JPH0355109B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、α−エンドルフインの遺伝子組換え
法による新規な製造方法およびそれに係わる組換
えプラスミド、形質転換株、融合タンパク質に関
する。 α−エンドルフインは、16個のアミノ酸より構
成されるモルヒネ様生理活性を有するペプチドで
あり、下記アミノ酸配列を有する。 α−エンドルフイン：Tyr−Gly−Gly−Phe−
Met−Thr−Ser−Glu−Lys−Ser−Gln−Thr−
Pro−Leu−Val−Thr 本発明の新規組換えプラスミドpENDA1は、
第１図において示されるDNA配列を有する。本
発明は、発酵工業、医薬品工業等の分野に好適で
ある。 ［従来の技術］ α−エンドルフインは、モルヒネ様生理活性を
示すエンドルフイン類に属するペプチドであり、
ロイシンエンケフアリンの約８倍、メチオニンエ
ンケフアリンの約５倍の鎮痛活性を示す興味深い
生理活性ペプチドである。 本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。しかしながら、遺伝子操作を利
用した効率のよいα−エンドルフインの製造方法
に関しては、知られていない。 既に、本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ葉
酸還元酵素（以下、DHFRと略す。）遺伝子に関
して、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝子発現
用プラスミドベクターpTP70−１（特開昭63−
46193号公報）と、それを利用した融合遺伝子の
作成方法（特開平１−144992号公報）を開発して
いる。また、pTP70−１にメチオニンエンケフ
アリン（以下、MEKと略す。）を暗号化する化学
DNAを組み込んで、MEKの効率よい生産方法を
開発している（特開平１−252289号公報）。効率
のよいMEKの生産方法を開発する際に得られた
組換えプラスミドpMEK2は、制限酵素BamH
とXho部位の間の配列を異種DNAと取り替え
るだけで、DHFRとの融合遺伝子を容易に作成
できる。また、pMEK2を利用して融合遺伝子を
作成した場合、融合遺伝子の発言の結果得られる
融合タンパク質の大腸菌菌体の蓄積量としては、
全菌体タンパク質の約20％が期待される。しかし
ながら、α−エンドルフインの生産に上記発現ベ
クターを用いた例はない。 ［発明の目的］ 本発明の目的は、遺伝子操作の手法を用いたα
−エンドルフインの大量生産方法を開発すること
にある。 本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究
の結果、α−エンドルフインを暗号化する遺伝子
を設計・化学合成し、pMEK2に組み込むことに
より、α−エンドルフイン遺伝子とDHFR遺伝
子との融合遺伝子を作成し、融合遺伝子を大腸菌
で発現させることにより、DHFR−α−エンド
ルフイン融合タンパク質（以下、融合タンパク質
と略す。）を大量に生産できることを見いだし、
さらに、融合タンパク質を用いることにより効果
的にα−エンドルフインを作成できることを明ら
かにし、本発明を完成させた。 ［発明の構成］ 本発明は、(1)融合タンパク質の大量発現を可能
にする新規組換えプラスミドpENDA1、(2)
pENDA1を含有する大腸菌菌体、(3)pENDA1を
含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、(4)
pENDA1を含有する大腸菌からの融合タンパク
質の分離精製方法、および(5)融合タンパク質を用
いたα−エンドルフインの製造方法、の発明によ
り構成される。 (1) 新規組換えプラスミドpENDA1 第１図は、本発明のpENDA１の全塩基配列
を示している。図は、２本鎖環状DNAのうち
片方のDNA鎖配列だけを、プラスミド中に２
箇所存在する制限酵素Cla部位のうち制限酵
素Hind部位に近い方の切断認識部位、5′−
ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を１番として
数えて、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。本発明のpENDA１は、新規な組換えプラ
スミドである。pENDA１は、4673塩基対の大
きさであり、宿主である大腸菌にトリメトプリ
ムおよびアンピシリン耐性を付与することがで
きる。pENDA１は、pMEK2（特開平１−
252289号公報に記載。）のBamHとXho部
位の間のMEKを暗号化する配列を含む26塩基
対の配列を、α−エンドルフインを暗号化する
配列を含む59塩基対の化学合成DNAと置き換
えた構造をしている。第１図において、533番
目から591番目迄の配列が化学合成DNA由来の
配列である。それ以外の配列がpMEK2由来の
配列である。 第１図の57番目から588番目まで配列は、
DHFRのカルボキシ末端側にα−エンドルフ
インがアルギニン（Arg）を介して結合した融
合タンパク質を暗号化している。 融合タンパク質を暗号化する配列の上流に
は、遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存
在する。（特開昭63−46193号公報）。即ち、43
番目から50番目までの配列がSD配列と呼ばれ
るもので、効率の良い翻訳に、また、4631番目
から4659番目までが、コンセンサス転写プロモ
ーターであり、効率の良い転写に貢献する。こ
のことから、pENDA１は、大腸菌に導入され
た場合、多量の融合タンパク質を作らせること
ができる。作られた融合タンパク質は、菌体内
に可溶性の状態で、菌体タンパク質の約20％程
度蓄積する。このことによつて、pENDA１を
含有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すよ
うになる。また、pENDA１は、pMEK1由来
の、アンピシリン耐性遺伝子を有している。こ
のことから、pENDA１が導入された大腸菌
は、アンピシリン耐性をも示す。pENDA１
は、大腸菌に導入されて安定状態に保たれ、
pENDA１を含有する大腸菌は、微工研に
FERM BP−2028として寄託されている。 このような特長を有するpENDA１は、実施
例１に従つて作成することができるが、組換え
プラスミドの作成方法によつて本発明が制限さ
れるものではない。 (2) pENDA１を含有する大腸菌 pENDA１を含有する大腸菌は、トリメトプ
リム及びアンピシリンに対して耐性を示す。
pENDA１を含有する大腸菌は、融合タンパク
質遺伝子の効率のよい発現の結果、融合タンパ
ク質を菌体内に可溶性の状態大量に蓄積する。
pENDA１を含有する大腸菌をYT＋Ap培地
（培地11中に、５ｇのNaCl、８ｇのトリプト
ン、５ｇのイーストエキス、及び50mgのアンピ
シリンナトリウムを含む液体培地）を用いて、
37℃で定常期まで培養した場合、蓄積する融合
タンパク質は、菌体タンパク質の約20％に達す
る。培養菌体を、リン酸緩衝液などの適当な緩
衝液に懸濁し、フレンチプレス法もしくは音波
破砕法で破砕し、これを遠心分離法により上清
と沈澱に分離した場合、全ての融合タンパク質
は上清中に回収される。pENDA１を含有する
大腸菌は、微工研にFERM BP−2028として
寄託されている。 (3) 融合タンパク質 第２図は、融合タンパク質を暗号化する部分
のDNA配列とそれから作られると予想される
タンパク質のアミノ酸配列を示している。融合
タンパク質は、177アミノ酸よりなる新規なタ
ンパク質である。アミノ末端側から数えて、１
から159番目までの配列が、大腸菌の野生型
DHFRに１箇所アミノ酸置換置換が起こつた
（Cys−152（Wild type）→（Glu−152）配列
であり、162番目から177番目までがα−エンド
ルフインの配列である。α−エンドルフインの
配列の直前のアミノ酸はアルギニン（Arg）で
ある。α−エンドルフインはアルギニンを含ま
ない。このことから、融合タンパク質をアルギ
ニルエンドペプチダーゼ
（Arginylendopeptidase、市販品として入手可
能）で処理することにより特異的に切り出すこ
とができる。160と161番目のイソロイシン
（Ile）−（ロイシン（Leu）の配列は、pMEK2の
BamH部位にα−エンドルフインを暗号化
するDNAを導入する際に、遺伝暗号の読み取
り枠を合わせるために生じた配列である
（pMEK2のもととなつたpTP70−１が作る
DHFRは、162個のアミノ酸よりなり、第２図
の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、アミ
ノ末端側から数えて、１から160番目までの配
列に、Gln−lleの２個のアミノ酸配列が結合し
た配列をしている。）。融合タンパク質およびα
−エンドルフインの分子量は、それぞれ20、
022および1745である。 融合タンパク質は、新規なタンパク質であ
る。融合タンパク質はDHFRのカルボキシ末
端側に、α−エンドルフインが融合した構造を
しているにもかかわらず、DHFR酵素活性を
有する。このため、大腸菌が融合タンパク質を
多量につくると、DHFRの阻害剤であり抗細
菌剤であるトリメトプリムに対して、耐性を示
すようになる。 (4) 融合タンパク質の分離精製 本発明の融合タンパク質の分離精製法は、
菌体の培養、菌体の破砕、DEAE−トヨパ
ールカラム処理、メソトリキセート
（MTX）結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー、およびDEAE−トヨパールカラムクロマ
トグラフイーの過程より成り立つている。 菌体の培養 pENDA１を含有する大腸菌の培養は、
YT＋Ap培地（培地1l中、５ｇのNaCl、８
ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキスおよ
び50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体
培地。）で培養することができる。培地とし
ては、この他にST＋Ap培地（培地1l中に、
２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウ
ム、５ｇのポリペプトン、５ｇのイーストエ
キスおよび50mgのアンピシリンナトリウムを
含む液体培地。）など、菌体が成長する培地
であれば、どの様な培地でも用いることがで
きるが、調べた限りでは、YT＋Ap培地が
最適であつた。 pENDA１を含有する大腸菌を、培地に接
種し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常
期まで培養する。培養した菌体は、5000回
転／分の遠心分離により集める。培地1lより
湿重量２から５ｇの菌体が得られる。 集菌およびこれ以後の操作は、特に断わら
ない限り低温（０から10℃の間、４℃が望ま
しい）で行う。 菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の
緩衝液１（0.1ｍＭエチレンジアミン４酢酸ナ
トリウム（EDTA）を含む10ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液、PH7.0）に懸濁し、フレンチ
プレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕液
を、35000回転、１時間超遠心分離し、上清
を得る（無細胞抽出液）。 DEAE−トヨパールカラム処理 無細胞抽出液を、あらかじめ50ｍＭのKCl
を含む緩衝液１で平衡化したDEAEトヨパー
ルカラムにかけ、カラム容量の50ｍＭのKCl
を含む緩衝液１でカラムを洗う。酵素の溶出
は、緩衝液１を用いて0.1Mから0.3MのKCl
の直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定
量ずつフラクシヨンコレクターを用いて分画
する。酵素の溶出は、0.3MのKClを含む緩
衝液１を用いて行う。溶出液を一定量ずつフ
ラクシヨンコレクターを用いて分画する。分
画した溶出液についてDHFR活性を測定し、
酵素活性が含まれる画分を集める。 MIX結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー 上記の操作により得られた酵素液を、あら
かじめ緩衝液１で平衡化したMTX結合アガ
ロース−アフイニテイカラムに吸着させる。
吸着後、1MのKClを含む緩衝液２（0.1ｍＭ
EDTAを含む10ｍＭリン酸カリウム緩衝
液、PH8.5）で洗う。洗いは、カラムからの
溶出液の280nｍの吸光度を測定し、吸光度
が0.1以下になるまで同緩衝液を流し続ける。
酵素の溶出は、1MのKClと３ｍＭの葉酸を
含む緩衝液２を用いて行い、溶出液を一定量
ずつフラクシヨンコレクターを用いて分画す
る。分画した溶出液についてDHFR活性を
測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。
得られた酵素液を、緩衝液１に対して、３回
透析する。この段階で純度95％以上の融合タ
ンパク質が得られる。 DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフ
イ 透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液１で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムに吸着
させる。吸着後、50ｍMKClを含む緩衝液１
で洗う。酵素の溶出は、緩衝液１を用いて50
ｍＭから0.3MのKClの直線濃度勾配を用い
て行い、溶出液を一定量ずつフラクシヨンコ
レクターを用いて分画する。分画した溶出液
について280nｍの吸光度とDHFR活性とを
測定する。 酵素活性／280nｍの吸光度の値が、一定
な画分を集める。 以上の操作により、融合タンパク質の高度
精製均一化を、再現性良く行うことができ
る。 本発明に従うと、融合タンパク質の精製
は、菌体の培養を含めて一週間以内に行うこ
とができ、回収率50％以上で、均一な酵素商
品を得ることができる。 DHFR酵素活性は、反応液（0.05ｍＭのジ
ヒドロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの
２−メルカプトエタノール、50ｍＭのリン酸
緩衝液（PH7.0））を、１mlのキユベツトと
り、これに酵素液を加え、340nｍの吸光度
の時間変化を測定することにより行う。酵素
１ユニツトは、上記反応条件において、１分
間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元す
るのに必要な酵素量として定義する。この測
定は、分光光度計を用いて容易に行うことが
できる。 (5) 融合タンパク質を用いたα−エンドルフイン
の製造 製造した融合タンパク質からのα−エンドル
フインの切断・分離は、アルギニルエンドペプ
チダーゼ（Arginylendopeptidase、市販品と
して入手可能）で処理することにより行う。精
製した融合タンパク質１重量に対して、アルギ
ニルエンドペプチダーゼ0.01重量の割合で加
え、37℃で50ｍＭ Tris−HC1緩衝液、PH8.5
中、24時間処理する。反応液に等量の50％酢酸
を加える。この試料を、HPLC装置（島津LC
−4A、inertsil−ODSカラム）を用いて、0.1％
トリフルオロ酢酸中、15％から50％のアセトニ
トリルの濃度勾配を用いて溶出・分離する。溶
出物は、220nｍにおける吸光度の測定により
検出することができる。第３図は、アルギニル
エンドペプチダーゼ処理した融合タンパク質試
料の高速液体クロマトグラムを示している。試
料注入後約15分後のピークがα−エンドルフイ
ンである。このピーク画分を分離する。分離し
た溶出液をエバホレーターで乾燥後、少量の水
を加え凍結乾燥し溶媒を除き、α−エンドルフ
インを得ることができる。また、得られたペプ
チドを酸加水分解後、アミノ酸分析することに
よりアミノ酸組成を確かめることができる。 本発明の実施例においては、3lの培地から湿
重量約10ｇの菌体が得られ、この菌体（計算
上、約230mgの融合タンパク質、約20.0mgのα
−エンドルフインを含む。）から、約126mgの融
合タンパク質（収率、55％、計算上約11mgのα
−エンドルフインを含む。）を精製して得るこ
とができ、このうち、20mgの融合タンパク質を
アルギニルエンドペプチダーゼ処理後、HPLC
で分離・精製することにより、約0.97mgのα−
エンドルフインを得ることができた。 ［発明の効果］ 本発明の、新規プラスミドpENDA１および
pENDA１を含有する大腸菌を用いることによ
り、融合タンパク質を容易にかつ高収率で分離精
製することが得られること、また、タンパク質分
解酵素で処理することにより融合タンパク質から
効率よくα−エンドルフインを切り出すことがで
きることからモルヒネ様生理活性を有することが
知られているα−エンドルフインの生産に有効で
ある。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ pENDA１の作成 α−エンドルフインを暗号化するDNAとして
は、 1.5′−
GATCCGCTACGGCGGTTTCATGACCTCA
Ｇ−3′ 2.5′−AAAAATCACAGACCCCGCTG−3′ 3.5′−TCGAGTTATTCACCTTTTTTG−3′ 4.5′−TATGCGTTTTTGATGATTG−3′ 5.5′−GTGACTTAAC−3′ 6.5′−TCGAGTTAAGTCACCAGCGGGG−
3′ の６本のDNAをホスホアミダイト法に従つて化
学合成し、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて、各DNAの5′末端をリン酸化した。リン
酸化したDNAを約0.1ml（約0.01μｇのDNAを含
んでいる。）ずつ取り、これを60℃でインキユベ
ートすることによつて両DNAをアニールさせた
（これをDNA1と呼ぶ）。 約1μｇのpMEK2を、BamHおよびXholで切
断した後、アルカリホスフアターゼ処理をした。
アルカリホスフアターゼ処理したDNAをフエノ
ール処理することにより、共存する酵素タンパク
質を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈
澱させた。沈澱したDNAを70％エタノールで洗
つた後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥
させた。BamHおよびXhoによるDNAの切
断、アルカリホスフアターゼ処理、フエノール処
理、およびエタノール沈澱の各操作は、いずれ
も、“Molecular Cloning Ａ Loboratory
Manual”（T.Maniatis、E.F.Fritsch、J.
Sambrook、eds.Cold Spring Harbor
Laboratory（1982）、以下、文献１と呼ぶ。）に記
載している方法に従つて行つた。乾燥させた
DNAを50μのリガーゼ用反応液（10ｍＭ
Tris−HCl、PH7.4、５ｍＭ Mgcl₂、10ｍＭジチ
オトレイトール、５ｍＭ ATP）に溶解後、5μ
のDNA1を加え、これに１ユニツトのT4−
DNAリガーゼを加えて、10℃で、12時間DNAの
連結反応を行わせた。この反応物を、形質転換法
（trans−formationmethod、上記文献１に記載）
に従つて、大腸菌HB101株に取り込ませた。こ
の処理をした菌体を、50mg／mlのアンピシリンナ
トリウムおよび10mg／mlのトリメトプリムを含む
栄養寒天培地（培地1l中に、２ｇのグルコース、
１ｇのリン酸２カリウム、５ｇのイーストエキ
ス、５ｇのポリペプトン、15ｇの寒天を含む。）
上に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
６個のコロニーを得ることができた。これらのコ
ロニーを、1.5mlのYT＋Ap培地（培地1l中に、
５ｇのNaCl、５ｇのイーストエキス、８ｇのト
リプトン、50mg／アンピシリンナトリウムを含
む。）で、37℃、１晩、菌体を培養した。培養液
を、各々エツペンドルフ遠心管にとり、12000回
転／分で10分間遠心分離し、菌体を沈澱として集
めた。これに、0.1mlの電気泳動用サンプル調製
液（0.0625MのTris−HCl、PH6.8、２％のラウリ
ル硫酸ナトリウム（SDS）、10％のグリセリン、
５％の２−メルカプトエタノール、0.001％のブ
ロムフエノールブルーを含む。）を加え、菌体を
懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶
かした。この処理をしたサンプルをSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（U.K.Lammli；
Nature、vol.227、p.680（1970））に従つて分析し
た。標準サンプルとしてpMEK2を含有する大腸
菌に同様な処理をしたもの、および分子量マーカ
ーとしてラクトアルブミン（分子量14200）、トリ
プシンインヒビター（分子量20100）、トリプシノ
ーゲン（分子量24000）、カルボニツクアンヒドラ
ーゼ（分子量29000）、グリセロアルデヒド３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ（分子量36000）、卵アルブ
ミン（分子量45000）、および牛血清アルブミン
（分子量66000）を含むサンプルをポリアクリルア
ミド濃度の10から20％濃度勾配ゲルで泳動した。
その結果、すべてのコロニーにおいて、pMEK2
のDHFR−MEK融合タンパク質のバンドが消失
し、それより明らかに分子量が大きくなつたタン
パク質（分子量約24000と推定される。）が認めら
れた。pMEK2のDHFR−MEK融合タンパク質
（分子量、18963）は、この条件で分子量約22000
のタンパク質として泳動する。得られた６個のコ
ロニーから適当に一株を選び、これをYT＋Ap
培地で培養し、TanakaとWeisblumの方法（T.
Tanaka、B.Weisblum；J.Bacteriology、
vol.121、p.354（1975））に従つて、プラスミドを
調製した。得られたプラスミドをpENDA１と名
づけた。pENDA１は、pMEK2のBamHと
Xhoとの間の配列が、化学合成したDNA配列
と置き変わつた構造をしているはずである。
pENDA１のEcoR（第１図の471−476番目の
配列）とSal（第１図の889−895番目の配列）
による切断によつて得られる約400ヌクレオチド
長のDNAについて、M13フアージを用いたジデ
オキシ法（J.Messing；Mehtods in
Enzymology、vol.101、p.20（1983））に従つて、
塩基配列を決定した。その結果、第１図に示す配
列の471番目から約895番目迄の配列が確かめられ
た。塩基配列を検討することにより、pENDA１
が融合タンパク質を暗号化することが明らかとな
つた。 pMEK2の塩基配列は、本発明者らによつて明
らかにされている（特開平１−252288号公報）。
また、pENDA１のEcoR−Sal切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、Pst、
Hind、Hpa、Aat、Pvu、Bgl、およ
びClaを用いた制限酵素による切断実験の結
果、pMEK2のEcoR−Sal切断によつて得ら
れる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であるこ
とが示された。 以上の結果から、pENDA１の全塩基配列が第
１図に示した配列であることが決められた。 実施例 ２ pENDA１を含有する大腸菌が作る融合タンパ
ク質 pENDA１を含有する大腸菌が作る融合タンパ
ク質のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予
想することができる。第１図の57番目から588番
目の配列が融合タンパク質を暗号化していること
から、トリプレツト暗号表を用いて、アミノ酸配
列を推定した。その結果第２図に示すアミノイ酸
配列が得られた。 pENDA１を含有する大腸菌から、エンドルフ
イン融合タンパク質を分離精製し、精製したタン
パク質の性質を調べた。 融合タンパク質の精製 Ａ 用いた菌体量：質重量 10ｇ Ｂ 酵素精製表 表における精製過程は無細胞抽出液、
DEAE−トヨパールカラム処理、メソトリキセ
ート結合アフイニテイクロマトグラフイー、およ
びDEAE−トヨパールカラムクロマトグラフイ
ーを表す。

【表】 得られた酵素タンパク質をSDS電気泳動法（上
記実施例に記載の方法）により分析したところ、
分子量約2400の単一なタンパク質バンドが示さ
れ、得られた酵素標品が均一であることが示され
た。 分離精製した融合タンパク質の性質 精製したDHFR活性を示すタンパク質をエン
ザイムイムノアツセイにより検討したところ、α
−エンドルフインに対する抗体と反応することが
示された。即ち、精製して得られたタンパク質は
免疫学的にα−エンドルフインと同等の構造を含
んでいることが明らかとなつた。 精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端
側のアミノ酸配列を明らかにするために、カルボ
キシペプチダーゼＹを、精製タンパク質に時間を
変化させて作用させ、遊離してくるアミノ酸を定
量した（カルボキシペプチダーゼ法によるカルボ
キシ末端側のアミノ酸配列の決定法）。その結果、
−Leu−Val−Thr（カルボキシ末端）であること
が予想された。また、精製して得られたタンパク
質を酸加水分解した後、アミノ酸分析したとこ
ろ、塩基配列の結果予想されるアミノ酸組成と一
致した結果が得られた。 実施例 ３ 精製分離した融合タンパク質からのα−エンド
ルフインの分離 実施例２で得られた２mlの精製均一化した融合
タンパク質の溶液（緩衝液１中、約20mg、約
1000nmoleの融合タンパク質を含む）に、0.2mg
のアルギニルエンドペプチダーゼを加え、37℃で
24時間反応させる。反応後、１mlの酢酸を加え
る。そのうちの、0.5ml（約167nmoleの融合タン
パク質を含むはず）をとり、高速液体クロマトグ
ラフイー装置（島津LC−4A）を用いlnertsil−
ODS5μｍカラムで分離した。溶出は、0.1％トリ
フルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾配（15
％から50％）をかけることにより行つた。０から
２分までは、15％のアセニトリルを用い、２分か
ら32分までは、15％から50％のアセトニトリルの
直線濃度勾配をかけた。その結果、第３図に示す
ような溶出曲線が得られた。試料注入後約15分後
のピーク画分を分離し、分離した溶出液をエバー
ホレーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し
溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプチド
を酸加水分解後、その10分の１をアミノ酸分析に
用いた。その結果、グルタミン＋グルタミン酸、
ロイシン、グリシン、リジン、メチオニン、フエ
ニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、
チロシン、およびバリンがそれぞれ、20.2、9.7、
19.0、9.0、8.9、9.0、9.3、18.4、26.3、8.8および
9.3nmolずつ検出された。アミの酸組成は、α−
エンドルフインのそれと一致した。また、アミノ
酸分析に用いた標品は、約9.3nmole（約16.2μｇ）
のα−エンドルフインを含んでいたことになる。
この結果から、精製均一化した融合タンパク質を
用いて、アルギニルエンドペプチダーゼ処理した
標品をHPLCを用いて分離することにより収率約
56％でα−エンドルフインを回収できることが明
らかとなつた。融合タンパク質の精製の収率が約
55％であり、融合タンパク質からのα−エンドル
フインの分離の収率が約56％であることから、大
腸菌がつくるα−エンドルフインの単離収率が約
31％であると計算される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pENDA１の全塩基配列を示した図
であり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だ
けを、5′末端から3′末端の方向に記述している。
図中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、
Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを
示している。図中番号は、pENDA１に２箇所存
在する制限酵素Cla切断認識部位のうち制限酵
素Hind切断部位に近い方のCla切断認識部位
の、5′−ATCGAT−3′、の最初の“Ａ”を１番
として数えた番号を示している。第２図は、
pENDA１中に存在するエンドルフイン融合タン
パク質を暗号化する部分の塩基配列およびタンパ
ク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符号
は、核酸塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニ
ンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチ
ミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギニン
を、Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン
酸を、Cysはシステインを、Glnはグルタミンを、
Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisは
ヒスチジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイ
シンを、Lysはリジンを、Metはメチオニンを、
Pheはフエニルアラニンを、Proはプロリンを、
Serはセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはト
リプトフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリ
ンを示している。図中番号は、１番目のアミノ酸
であるメチオニンを暗号化するATGコドンの
“Ａ”を１番として数えた番号を示している。第
３図は、アルギニルエンドペプチダーゼ処理した
融合タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを
示している。横軸は試料注入後の時間を分単位
で、縦軸は、220nｍの吸光度を任意単位で表現
している。矢印で示したピークがα−エンドルフ
インの溶出ピークである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 大腸菌において安定に複製され、宿主である
   大腸菌にトリメトプリム耐性およびアンピシリン
   耐性を与えることができ、4673塩基対の大きさを
   有し、下記に示すDNA配列を有する新規組換え
   プラスミドpENDA１。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ２ pENDA１を含有する大腸菌。 ３ pENDA１を含有する大腸菌が生産し、下記
   に示すアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵
   素−α−エンドルフイン融合タンパク質。 【表】 ４ pENDA１を含有する大腸菌を培養し、ジヒ
   ドロ葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還
   元酵素−α−エンドルフイン融合タンパク質を、
   培養菌体の無細胞抽出液から、メソトリキセート
   結合アフイニテイカラムクロマトグラフイー、お
   よび陰イオン交換カラムクロマトグラフイーを用
   いて精製することを特徴とするジヒドロ葉酸還元
   酵素−α−エンドルフイン融合タンパク質の分離
   精製方法。 ５ pENDA１を含有する大腸菌の生産するジヒ
   ドロ葉酸還元酵素−α−エンドルフイン融合タン
   パク質を分離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元
   酵素−α−エンドルフイン融合タンパク質をタン
   パク質分解酵素で消化した後、α−エンドルフイ
   ンを分離精製することを特徴とするα−エンドル
   フインの製造方法。