JPH0375560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヌクレオシドを化学的にリン酸化し
て化学調味料として有用な5′−ヌクレオチドを工
業的に、かつ安価に製造する方法に関する。 さらに詳しくは、本発明は、イノシンおよびグ
アノシンを、その糖部分（リボース）の2′−およ
び3′−位の水酸基（２級水酸基）を保護すること
なく、5′−位の水酸基（１級水酸基）を直接リン
酸化するに際し、グアノシンとイノシンとの混晶
を用いるもので、その目的とするところは、グア
ノシン−5′−リン酸収率の向上と、グアノシン−
5′−ジリン酸、グアノシン−2′（3′），5′−二リン
酸等のグアノシン−ジホスフエート類の副生を抑
制することにある。 従来、5′−ヌクレオシドの製造法としては、リ
ボヌクレオシドを、そのリボフラノシル基の2′，
3′−位をアシル基あるいはアルキリデン基で保護
した後、各種の反応溶媒存在下で、種々のリン酸
化剤を用いて、諸種の条件でリン酸化し、次いで
保護基を加水分解して脱離し5′−リボヌクレオチ
ドとする方法が知られているが、このリン酸化方
法は、反応に多段階を要する、リン酸化剤の
使用量が多い、かならずしも収率が良好でない
などの欠点がある。 また、これらの欠点を解決するために、従来、
無保護のヌクレオシドを化学的にリン酸化する方
法として、特定の極性有機溶媒の存在下で、ヌク
レオシドとリン酸化剤を反応せしめる方法が知ら
れている。このようなリン酸化方法としては、(A)
ニトリル化合物を用いる方法（特公昭42−
20316）、(B)有機酸エステルを用いる方法（特公昭
42−21351）、(C)リン酸トリアルキルエステルを用
いる方法（Tetrahedron Letters No.50，
pp.5065，1967；Bulletin of the Chemical
Society of Japan Vol.42，3505（1969）；特公昭
42−11071）、(D)リン酸トリ（アルコキシアルキ
ル）エステルを用いる方法（特開昭51−86482）、
(E)エチレングリコールジアルキルエーテルを用い
る方法（特公昭46−31865）、および(F)極性有機溶
媒と有機アミンまたは有機アミンの無機酸塩を用
いる方法（Bulletin of the Chemical Society
of Japan，Vol.48，2084（1975）などが知られて
いる。 しかし、これらの無保護リン酸化法をグアノシ
ンのリン酸化に適用した場合、目的とするグアノ
シン−5′−リン酸への転換率は、いずれの方法に
よつても高々約90％であり、イノシンの場合、そ
のイノシン−5′−リン酸への転換率が95％にも及
ぶことと対比するならば、工業的に満足すべきも
のではない。 また、グアノシン−5′−リン酸との分離が困難
なグアノシン−5′−二リン酸、グアノシン−
2′（3′），5′−二リン酸等のジホスフエート類が約
10％以上も副生するという欠点がある。 こうした状況のもとで、本発明者らは、従来の
無保護リン酸化法をグアノシンのリン酸化に適用
する場合に起こる上述の障害を克服して、工業的
に有利なグアノシン−5′−リン酸の製造法を確立
すべく広く検討した結果、グアノシンとイノシン
との混晶を原料として用いることにより、イノシ
ンだけでなくグアノシンもまた極めて高収率で
5′−モノホスフエートに導かれ、ジホスフエート
類の副生も著しく減少することを発見し、さらに
検討して本発明を完成したものである。 すなわち、本発明は、極性有機溶媒中、グアノ
シンとイノシンとの混晶にオキシハロゲン化リン
もしくはその水和物を作用させることを特徴とす
るグアノシン−5′−リン酸とイノシン−5′−リン
酸との混合物の製造法である。 本発明の製造法において、グアノシンとイノシ
ンとの混晶は、自体公知の方法で得られたものを
用いることができる。例えば、グアノシンおよび
イノシンを含む水溶液より通常溶質を析出させる
手段によつて晶出させて得た混晶が用いられる
（特公昭47−38199参照）。 この場合、晶出の方法としては、例えば冷却、
濃縮（水の除去）、種晶の添加、グアノシンおよ
びイノシンを溶解しない親水性溶媒（例えばアセ
トン）の添加、PH調整（グアノシンおよびイノシ
ンの溶解度が大きいPH３以下の酸性域あるいはPH
９以上のアルカリ性域からPH３〜９の範囲に調整
する）などおよびこれらの組合せの方法を適宜採
用できる。このような方法でグアノシンおよびイ
ノシンを含む溶液よりグアノシンとイノシンとの
混晶を析出させた後、吸引または加圧過、遠心
分離、遠心沈降等の通常用いられる方法で該混晶
を分離し、例えば減圧下に加熱乾燥する等により
水などの溶媒を除去し、次いでリン酸化反応に供
するのが望ましい。 この際、分離された湿結晶をアセトン、メチル
エチルケトンなどの親水性で、かつグアノシンお
よびイノシンを溶解しない溶媒で洗滌すると、低
温短時間で乾燥することができるので有利であ
る。 また乾燥された混晶を適宜粉砕してから篩過
し、例えば100メツシユ以下に整粒して反応に供
してもよい。 本発明の製造法を適用するにあたつてグアノシ
ンとイノシンとの混晶中のイノシン含量が低過ぎ
たり、また高過ぎる場合は、グアノシンの5′−モ
ノホスフエートへの転換率の向上とジホスフエー
ト類の副生抑制という本発明の効果を奏し難いこ
とがある。通常、イノシンのグアノシンに対する
割合が約0.1〜10（モル／モル）、好ましくは約0.2
〜４（モル／モル）の混晶を用いるのが有利であ
る。 混晶中のイノシンとグアノシンとの量比は、前
述の方法において晶出原液中のこれらの濃度比あ
るいは（および）晶出方法を適宜選ぶことによ
り、任意に調節することが可能である。 本発明の製造法で用いられる極性有機溶媒とし
ては、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニ
トリル化合物、酢酸エチル、酢酸メチル、プロピ
オン酸メチル等の有機酸エステル類、リン酸トリ
メチル、リン酸トリエチル等のリン酸トリ低級ア
ルキルエステル類、リン酸トリ（メトキシエチ
ル）、リン酸トリ（エトキシエチル）等のリン酸
トリ（アルコキシアルキル）エステル類、エチレ
ングリコールジメチルエーテル、エチレングリコ
ールジエチルエーテル等のエチレングリコールジ
アルキルエーテル類、テトラヒドロフラン、１，
４−ジオキサン等の環状エーテル類、ジクロロメ
タン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等
のハロゲン化炭化水素類、ニトロメタン、ニトロ
エタン、ニトロベンゼン等のニトロ化合物等が挙
げられる。 これらの極性有機溶媒は２種以上を混合して用
いてもよく、また、これら以外の有機溶媒でも例
えばベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、
エチルエーテル等のエーテル類のように反応に悪
影響を及ぼさないものであれば、これらの溶媒と
混合して用いることができる。 極性有機溶媒の使用量は、その種類により異な
るが、通常グアノシンおよびイノシンの量に対し
て約５〜約30倍量の範囲で適宜選択され、好まし
くは10〜20倍量程度である。 また、上記溶媒に、ピリジン、γ−ピコリン、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−アニリン等の３級アミン類も
しくはその無機酸塩をグアノシンおよびイノシン
量に対し、約１〜５倍モル程度、適宜添加するこ
とにより、さらに反応促進、収率向上等の好まし
い効果をもたらすことが多い。 本発明の製造法で用いられるリン酸化剤は、オ
キシ塩化リン、オキシ臭化リン等のオキシハロゲ
ン化リンである。 オキシハロゲン化リンの使用量は通常、グアノ
シンおよびイノシンの約１〜５倍モル量、好まし
くは約1.5〜４倍モル量である。その使用量が少
な過ぎるとグアノシンおよびイノシンが未反応の
まま残り、また、過度の使用量ではジホスフエー
ト類の副生が増えると同時に目的とする5′−モノ
ホスフエートの収率が下がるので好ましくない。
通常、前記の使用範囲から、リン酸化剤あるいは
溶媒の種類等を考慮し適宜に選択される。 リン酸化に際し、オキシハロゲン化リンをその
まま反応に供するよりも、一旦、部分水和物とし
てから用いる方が、通常5′−モノホスフエート生
成への選択性が高く、2′または3′−モノホスフエ
ート、ジホスフエート類の副生量がすくなくなる
ので好ましい。 オキシハロゲン化リンの水和物を得る方法は、
オキシハロゲン化リンを上記反応溶媒に加えて溶
解してから、これに少量の水またはメタノール、
エタノール、三級ブタノール等のアルコール類、
もしくはギ酸、酢酸等の有機酸類を加えて反応さ
せればよく、生成した部分水和物は分離すること
なく、溶液として本発明のリン酸化反応に供され
る。この際の水またはアルコール類、もしくは有
機酸の添加量はオキシハロゲン化リンのグアノシ
ンとイノシンとの混晶に対する仕込割合によつて
異なるが、通常オキシハロゲン化リンに対して約
0.1〜0.7倍モル量であり、好ましくは0.3〜0.6倍
モル量である。 ただし、本発明の製造法で反応溶媒として用い
られる上記の極性有機溶媒類のうち、ニトリル
類、エチレングリコールジアルキルエーテル類、
環状エーテル類、ハロゲン化炭化水素類、もしく
はニトロ化合物を用い、これにピリジン、γ−ピ
コリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン等の無機酸塩
を添加して反応に供するときは、オキシハロゲン
化リンは部分水和する必要はなく、そのまま反応
に使用しても、部分水和物を用いる場合と同様に
良好な効果が得られる。 本発明の製造法は、約10℃以下に冷却しなが
ら、前記反応溶媒にリン酸化剤を加え、これに所
定量の水（またはアルコール類もしくは有機酸）
を添加し、場合によつてはさらに、３級アミン
（またはその無機酸塩）を添加して溶解し、続い
てグアノシンとイノシンとの混晶を加え、撹拌、
冷却下に反応させることにより行われる。 反応温度は−30゜〜＋50℃の範囲が実用的であ
り、中でも−10゜〜＋30℃が特に好ましい。 この温度範囲において、反応時間は溶媒の種
類、促進剤添加の有無等によつて異なるが、一般
に30分〜10時間である。当反応方法においては、
グアノシンを単独にリン酸化する従来の方法に比
べ、反応は短時間で終了する。 このようにして得られた反応生成物を常法によ
り冷水と混合することによつて、未反応のリン酸
化剤および生成したヌクレオシドホスホハロゲネ
ートを加水分解し、グアノシン−5′−リン酸およ
びイノシン−5′−リン酸を含む溶液（加水分解
液）を得る。 このようにして得られたグアノシン−5′−ホス
フエートおよびイノシン−5′−ホスフエートを精
製する方法としては、例えば、 １ 加水分解液のPHを水酸化ナトリウムで約1.5
に調整した後、活性炭で処理する方法、 ２ 反応溶媒を他の有機溶媒を用いて抽出分離し
た後、水酸化ナトリウムなどのアルカリで中和
してから、吸着樹脂処理あるいは晶析により精
製する方法、 ３ 反応溶媒を他の有機溶媒を用いて抽出分離し
た後、活性炭で処理する方法、 などが挙げられる。次いで、これらの精製方法の
いずれかを経た後、常法によりグアノシン−5′−
リン酸二ナトリウムとイノシン−5′−リン酸二ナ
トリウムとの混晶として取得することができる。
また必要ならば、例えば活性炭カラムを用いる分
別溶出法等により、グアノシン−5′−リン酸およ
びイノシン−5′−リン酸を分離した後、所望のア
ルカリ金属の塩としてそれぞれを純度の高い単一
物の結晶として取得することも可能である。これ
らの5′−ヌクレオチドまたはその混合物は呈味性
に富み、化学調味料として有用な物質である。 本発明の製造法を適用するこによりグアノシン
の5′−モノホスフエートへの転換率が向上し、ま
たジホスフエート類の副生量も大幅に下がるが、
この場合のイノシンの5′−モノホスフエートへの
転換率は、イノシンを単独に同条件でリン酸化し
た場合の転換率とほとんど変わらない。 以下、参考例および実施例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。 参考例 １ アセトニトリル100ml、ピリジン37.9ｇの溶液
に氷冷下オキシ塩化リン67.5ｇを滴下し、次に水
4.5ｇをゆつくり添加した。得られた混合液を0゜
〜２℃に保ち、撹拌しながらこれにグアノシン
28.3ｇを加えた。この温度で６時間連続撹拌し反
応した後、反応液を700ｇの氷水と混合した。こ
の水溶液を高速液体クロマトで分析し、第１表の
結果を得た。

【表】 参考例 ２ リン酸トリエチル300mlに氷冷下オキシ塩化リ
ン46.0ｇを加えて溶解し、続いて水1.8ｇをゆつ
くり添加した。得られた混合液を10℃に保ち、撹
拌しながらこれにグアノシン28.3ｇを加えた。こ
の温度で５時間連続して撹拌し反応した後、反応
液を500ｇの氷水と混合した。この水溶液を高速
液体クロマトで分析し、第２表の結果を得た。

【表】 参考例 ３ アセトニトリル200ml、ピリジン75.1ｇの溶液
に氷冷下オキシ塩化リン67.5ｇを滴下し、次に水
8.9ｇをゆつくり添加した。得られた混合液を0゜
〜２℃に保ち、撹拌しながらこれにグアノシン
28.3ｇ続いてイノシン26.3ｇを加えた。この温度
で６時間連続撹拌し反応した後、反応液を1.4Kg
の氷水と混合した。この水溶液を高速液体クロマ
トで分析し、第３表の結果を得た。

【表】 参考例 ４ リン酸トリエチル700ml、オキシ塩化リン115.0
ｇの混液に氷冷下、水4.5ｇを滴下して加え、次
にこれにグアノシン28.3ｇ、続いてイノシン40.2
ｇを加え５℃で６時間連続撹拌し反応させた。反
応液を1.2Kgの氷水と混合し、その水溶液を高速
液体クロマトで分析し、第４表の結果を得た。

【表】 実施例 １ アセトニトリル120ml、ピリジン46.7ｇの溶液
に氷冷下オキシ塩化リン83.0ｇを滴下し、次に水
5.5ｇをゆつくり添加した。得られた溶液を０〜
２℃に保ち、撹拌しながらこれにグアノシン28.3
ｇおよびイノシン6.2ｇを含む混晶を加えた。こ
の温度で５時間連続撹拌し反応させた後、反応液
を900mlの氷水と混合した。この水溶液を高速液
体クロマトで分析し、第５表の結果を得た。

【表】 実施例 ２ ニトロメタン140mlにピリジン塩酸塩76.1ｇを
加え、これに氷冷下オキシ塩化リン52.5ｇを滴下
した。得られた溶液を2゜〜３℃に保ち、撹拌しな
がらこれにグアノシン28.3ｇおよびイノシン9.9
ｇを含む混晶を加えた。この温度で５時間連続し
て反応させた後、反応液を600ｇの氷水と混合し
た。この水溶液をエチルエーテルで抽出してニト
ロメタンを除き、抽残液を高速液体クロマトで分
析し、第６表の結果を得た。

【表】 実施例 ３ ジクロルメタン200ml、γ−ピコリン44.2ｇの
混液に氷冷下オキシ塩化リン133.6ｇを滴下し、
次にメタノール15.2ｇをゆつくり添加した。得ら
れた溶液を2゜〜３℃に保ち、撹拌しながらこれに
グアノシン28.3ｇおよびイノシン26.3ｇを含む混
晶を加えた。この温度で５時間連続撹拌し反応さ
せた後、反応液を1400ｇの氷水と混合した。得ら
れた液のジクロルメタン層と水層を分液し、水層
を高速液体クロマトで分析し、第７表の結果を得
た。

【表】 実施例 ４ アセトニトリル320ml、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニ
リン91.8ｇの混液に氷冷下オキシ塩化リン213.2
ｇを滴下し、次にギ酸29.1ｇをゆつくり添加し
た。得られた溶液を2゜〜３℃に保ち、撹拌しなが
らこれにグアノシン28.3ｇおよびイノシン57.9ｇ
を含む混晶を加えた。この温度で４時間連続撹拌
し反応させた後、反応液を2.2Kgの氷水と混合し
た。この水溶液を高速液体クロマトで分析し、第
８表の結果を得た。

【表】 実施例 ５ リン酸トリエチル400ml、オキシ塩化リン59.7
ｇの混液に氷冷下、水2.3ｇを滴下して加え、次
にこれにグアノシン28.3ｇおよびイノシン8.0ｇ
を含む混晶を加え10℃で４時間連続撹拌し反応さ
せた。反応液を600ｇの氷水と混合し、その水溶
液を高速液体クロマトで分析し、第９表の結果を
得た。

【表】 実施例 ６ リン酸トリメチル500ml、オキシ塩化リン82.9
ｇの混液に氷冷下、水3.2ｇを滴下して加え、次
にこれにグアノシン28.3ｇおよびイノシン21.5ｇ
を含む混晶を加え10℃で３時間連続撹拌し反応さ
せた。反応液を900ｇの氷水と混合し、その水溶
液を高速液体クロマトで分析し、第10表の結果を
得た。 この水溶液を１，２−ジクロルエタンで抽出し
てリン酸トリメチルを除き、抽残液を炭末塔に通
してグアノシン−5′−リン酸等のヌクレオチドを
吸着させ、よく水洗し、次に２％水酸化ナトリウ
ム水溶液で溶出した。溶出液を塩酸でPH8.5に調
整してから減圧下に水を留去し、濃縮液を熱時脱
色過した後メタノールを添加して晶析し、グア
ノシン−5′−リン酸二ナトリウムおよびイノシン
−5′−リン酸二ナトリウムの混晶（含水塩、純度
98％）を得た。

【表】 実施例 ７ リン酸トリエチル700ml、オキシ塩化リン115.0
ｇの混液に氷冷下、水4.5ｇを滴下して加え、次
にこれにグアノシン28.3ｇおよびイノシン40.2ｇ
を含む混晶を加え５℃で６時間連続撹拌し反応さ
せた。反応液を1.2Kgの氷水と混合し、その水溶
液を高速液体クロマトで分析し、第11表の結果を
得た。 この水溶液をトルエンで抽出してリン酸トリエ
チルを除き、抽残液を炭末塔に通してグアノシン
−5′−二リン酸等のヌクレオチドを吸着させ、よ
く水洗し、次に1.5％塩化アンモニウム水溶液に
アンモニア水を加えてPH10.0にした液を通してイ
ノシン−5′−リン酸を溶出（第１溶出）させ、続
いて２％水酸化ナトリウム水溶液を通してグアノ
シン−5′−リン酸等を溶出（第２溶出）させた。
第１溶出液に水酸化ナトリウムを加えて濃縮し、
放冷晶析してイノシン−5′−リン酸二ナトリウム
の結晶（８水塩、純度99％）を得た。

【表】 また、第２溶出液を塩酸でPH8.5に調整してか
ら濃縮し、放冷晶析して、グアノシン−5′−リン
酸二ナトリウムの結晶（７水塩、純度98％）を得
た。 実施例 ８ リン酸トリメチル1.1、オキシ塩化リン184.9
ｇの混液に氷冷下、水7.2ｇを滴下して加え、次
にこれにグアノシン28.3ｇおよびイノシン81.0ｇ
を含む混晶を加え５℃で４時間連続撹拌し反応さ
せた。反応液を２Kgの氷水と混合し、その水溶液
を高速液体クロマトで分析し、第12表の結果を得
た。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 極性有機溶媒中、グアノシンとイノシンとの
   混晶にオキシハロゲン化リンもしくはその水和物
   を作用させることを特徴とするグアノシン−5′−
   リン酸とイノシン−5′−リン酸との混合物の製造
   法。