JPH0411191B2

JPH0411191B2 -

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Publication number: JPH0411191B2
Application number: JP60116737A
Authority: JP
Priority date: 1985-05-31
Filing date: 1985-05-31
Publication date: 1992-02-27
Also published as: JPS61274678A

Description

【発明の詳細な説明】 (イ) 産業上の利用分野本発明は、ヒトの肺表面活性物質を構成してい
るアポ蛋白（以下、LS分子量約62000および約
34000〜37000のアポ蛋白と略記する）に対する
IgG型のマウスモノクローナル抗体を産生する、
マウス−マウスハイブリドーマとその製造法に関
する。その目的とするところは、肺表面活性物質
の動態を知る指標として、臨床及び病理診断の試
薬として用いることのできる、LSアポ蛋白を認
識するモノクローナル抗体を産生する、ハイブリ
ドーマを提供することにある。

(ロ) 従来の技術動物の肺胞には、肺表面活性物質と称するリン
脂質を主成分とする生理活性物質が存在する。こ
れは肺胞の内壁を覆い、肺胞上皮保護作用を有す
ると共に、動物が呼吸機能を維持する上に重要な
生理的機能を有している。即ち、肺表面活性物質
は、呼気時、吸気時における肺胞内面の表面張力
を変化させるといつた特異な表面活性を有してお
り、肺胞相互間の安定性に寄与して、抗無気肺作
用を示すと云われている。かかる肺表面活性物質
が不足すると肺胞は虚脱し、安定した換気能力を
維持できなくなり、例えば、新生児呼吸窮迫症候
群（IRDS）のごとき症状が現われる。肺表面活
性物質の約90％はリン脂質や中性脂質等の脂質で
あるが、約10％は蛋白であり、これらは脂質と蛋
白の複合体、即ちリポ蛋白として存在している。
肺表面活性物質から脂質を除去すると水不溶性の
蛋白が得られ、これをアポ蛋白と呼んでいるが、
分子量約36000（36K）の蛋白が主成分である。ア
ポ蛋白の構造、機能、代射についてはこれまで詳
細に検討され、ポリクローナル抗体による免疫学
的定量、免疫組織学的検討も行われてきた。しか
し、今日、LSアポ蛋白が肺表面活性物質の動態
を知る指標として臨床および病理診断に広く用い
られるには至つていない。

(ハ) 発明が解決しようとする問題点肺表面活性物質のマーカーとして、羊水中の
Ｌ／Ｓ比（レシチンとスフインゴミエリンの比）、
羊水および気管支肺洗浄液中のジパルミトイルホ
スフアチジルコリン量が測定されているが、これ
らリン脂質に比べ、蛋白は特異性に優れまた高感
度に検出し得るので、肺表面活性物質のマーカー
として蛋白を用いることが期待されている。

このためには、LSアポ蛋白に対するモノクロ
ーナル抗体を得る必要があるが、現在までその様
なモノクローナル抗体は、従つてそれを産生する
ハイブリドーマも得らられていない。

(ニ) 問題点を解決するための手段本発明者らは、ヒトの肺及び／又は気管支の洗
浄液中の肺表面活性物質から、例えば、肺表面活
性物質が大量蓄積する肺胞蛋白症患者の気管支肺
洗浄液から、分子量約62000および約34000〜
37000のLSアポ蛋白を分離精製し、これを用いて
マウスを免疫し、かかるマウスから得られる抗体
産生細胞とマウスのミエローマ細胞を融合させる
ことによつて、分子量約62000および約34000〜
37000のLSアポ蛋白を特異的に認識するマウスモ
ノクローナル抗体を産生するマウス−マウスハイ
ブリドーマを得ることができた。

かくして得られたマウス−マウスハイブリドー
及び／又はそれに由来する細胞株を適当な方法で
培養すると、培養物からヒトの分子量約62000お
よび約34000〜37000のLSアポ蛋白を特異的に認
識するIgG型のマウスモノクローナル抗体を採取
することができる。

本発明における肺表面活性物質は、ヒトの肺及
び／又は気管支の洗浄液から、好ましくは肺胞蛋
白症患者の気管支肺洗浄液から分離・採取され
る。肺表面活性物質は、約90％の脂質と約10％の
蛋白との複合体（リポ蛋白）であり、これから公
知の方法、例えばFrosolononの方法（J.Lipid
Res.11，439−457（1970）参照）によつて肺表面
活性物質を得、次いで脂質を除去すると、本発明
におけるLSアポ蛋白が得られる。LSアポ蛋白は
分子量約62000と約36000の蛋白が主成分である
が、分子量約36000の蛋白は、ソジウムドデシル
サルフエート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）では幅広いバンドとして分離し、
この中には分子量約37000と約34000の蛋白も含ん
でいると考えられる。従つて、本発明におけるア
ポ蛋白とは、これらの蛋白又はそれらのフラグメ
ントを意味するものである。なお、蛋白の分子量
はSDS−PAGEにより測定した。

本発明のLSアポ蛋白を認識するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマは、手法それ自
体は公知である細胞融合法によつて製造すること
ができる。まず、分子量約62000および約34000〜
37000のヒトのLSアポ蛋白でマウスを免疫し、次
いでこれらの動物の脾臓やリンパ節等から抗体産
生細胞（リンパ球）を採取し、そして、この細胞
をマウスのミエローマ細胞と融合させる。マウス
のミエローマ細胞としては、BALB／Ｃマウス
のP3−X63−Ag8，P3−X63−Ag8−U1，P3−
NS1／１−Ag4−１，P3−X63−Ag8−6.5.3，
SP2／Ｏ−Ag14，FO，MPC11−45.6TG1.7など
がある。

細胞融合の条件は、例えば次の通りである。抗
体産生細胞とミエローマ細胞を10：１〜１：10，
好ましくは１：１〜１：３の比率で混合し、適当
な細胞融合用溶液、例えば約35％ポリエチレング
リコール（分子量1000〜6000程度）および約7.5
％ジメチルスルホキシドを含むRPMI1640を加え
て、室温〜37℃で１〜数分間攪拌し、その後10％
FCS加RPMI1640で徐々に希釈し、洗浄の後
HAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミ
ジン）選択培養液にて細胞濃度が１〜５×10⁵
個／mlとなるように調整する。これを0.2mlずつ、
例えば96穴プレートに分注し、５％CO₂を含む空
気中で35〜38℃で２〜３週間培養する。HAT培
養液中ではハイブリドーマのみが存在し、８−ア
ザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエローマ
同士の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体産
生細胞は数日で死滅する）。次に、このハイブリ
ドーマ集落から、分子量約62000および約34000〜
37000のヒトのLSアポ蛋白に対し特異的なモノク
ローナル抗体を分泌するものだけ選別する。この
選別工程（スクリーニング）は、それぞれのハイ
ブリドーマより産生されたモノクローナル抗体
が、目的とするLSアポ蛋白と抗原抗体反応をす
るか否かを酵素抗体法で調べることによつて行な
う事ができる。目的とするモノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマは、次にクローニングに
よりクローン化細胞にしなくてはならない。この
工程は、具体的には限界希釈法を用い行う事がで
きる。約２〜３週間後、96穴のプレート中で生育
したコロニーを拾い、再び酵素抗体法で分子量約
62000および約34000〜37000のヒトのLSアポ蛋白
に対する抗体活性を調べハイブリドーマを選別す
る。本発明ではこの工程を２回くり返した。

クローニングによつて選別された、分子量約
62000および約34000〜37000のヒトのLSアポ蛋白
を認識する抗体を産生するハイブリドーマは凍結
して保存することができ、また、これを適当な方
法で大量に培養することもできる。かかるハイブ
リドーマのセルライン（細胞株）又は複製された
細胞も本発明の範囲に含まれるものである。ま
た、クローン化されたハイブリドーマと実質的に
同一のLSアポ蛋白に対する抗体を産生する限り、
その変異株等も本発明の範囲に含まれる。

(ホ) 発明の効果本発明のハイブリドーマを、適当な方法で大量
に培養すると、培養上清から分子量約62000およ
び約34000〜37000のヒトのLSアポ蛋白を認識す
るモノクローナル抗体を得ることができる。ま
た、このハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化
し、その復水や血清から目的とする抗体を得るこ
ともできる。かかる抗体の精製は、プロテインＡ
等を用いるアフイニテイクロマトグラフイー等の
方法によつて行なわれる。

(ヘ) 以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例１ (1) 肺胞蛋白症患者の肺及び気管支を、治療の目
的で、0.15M塩化ナトリウム溶液で洗浄し、気
管支肺洗浄液（BALF）を３得た。この
BALFを300×ｇで10分間遠心分離し、細胞及
び細胞破片を除去した。次いで、得られた上清
を48000×ｇで20分間遠心分離し、沈渣画分を
採取した。

この沈渣画分を、145mMの塩化ナトリウム、
1mMのエチレンジアミン四酢酸ニナトリウム
を含む10mMのトリス緩衝液（ph7.4）80mlに
懸濁し、0.25Mと0.65Mの不連続シヨ糖密度勾
配による遠心分離を、4000×ｇで60分間行なつ
た。0.25Mと0.65Mのシヨ糖溶液のIB画分を採
取し、上記緩衝液400mlに再懸濁した。そして、
この懸濁液を、48000×ｇで30分間遠心分離し、
沈澱物（肺表面活性物質）を得た。

アルブミン等の不純物を除くためにこの沈澱
物を、１％のトリトンＸ−100（ポリオキシエチ
レンアルキルフエニルエーテル）、3mMの
EDTA，1mMのフエニルメチルスルホニルフ
ロリド、0.5mMのジチオスレイトールを含む
5mMのトリス緩衝液（PH7.8、以後トリトン緩
衝液という）27mlに静かに分散させた。この分
散液を150000×ｇで60分間遠心分離し、沈澱物
（精製肺表面活性物質）を得た。

この沈澱物を、上記トリトン緩衝液４mlに再
分散し、この再分散液に４mlのブタノール−エ
タノール混合液（容量比６：１）を添加し、激
しく振とうして、０℃で10分間放置し脂質を抽
出除去した後、2000r.p.m.で15分間遠心分離
し、沈澱物（アポ蛋白）を得た。この操作をも
う３回繰り返し、最終的なアポ蛋白の沈澱を得
た。

この沈澱物をトリトン緩衝液20mlに懸濁し、
同じトリトン緩衝液に対してセロハン膜を用い
て透析し（ブタノール−エタノールの除去）、
透析内液を得た。この透析内液を、150000×ｇ
で60分間遠心分離し上清を得た。沈澱物には再
びトリトン緩衝液20mlを添加し可溶化した後、
150000×ｇで60分間遠心分離し上清を得た。こ
の操作をもう６回行ない上清を集めた。得られ
た上清は合算して150mlであつたこの上清を、
トリトン緩衝液で平衡化したブルーセフアロー
ス4Bカラム（直径1.8cm×3.5cm）に注加し、同
緩衝液を用いて溶出し、素通り画分を採取する
ことによつて混在するアルブミンを完全に除去
した。

この画分を、トリトン緩衝液で平衡化した
DEAE−トーヨーパールカラム（直径1.4cm×
19cm）に注加し、まず、同緩衝液200mlを用い
て流速15ml／hr.で溶出し、次に、同緩衝液に
含まれる塩化ナトリウムの濃度を０から0.5M
まで直線的に連続的に上げながら溶出し、塩化
ナトリウム濃度が0.30Mと0.35Mの間の画分を
得た。この画分に含まれる蛋白の分子量は約
62000と約36000であつた。

(2) 前記の塩化ナトリウム濃度が0.30Mと0.35M
の間で溶出された画分に含まれるLSアポ蛋白
を、以下の実験に用いた。

LSアポ蛋白をフロイント完全アジユバント
に乳化し、BALB／Ｃマウスの腹腔に投与し
た。そして、30日後にマウスに追加免疫を行つ
た。一方、15％の牛胎児血清を添加したRPMI
1640（ギブコ社製）で、ミエローマ細胞P3−
X63−Ag8−U1を維持培養しておいた。追加
免疫３日後、マウスから得た脾臓細胞とP3−
X63−Ag8−U1を、Oi等の方法（Selective
methods in cellular immunology 1980，
p351−372，参照）によりポリエチレングリコ
ール4000を用い細胞融合させ、96穴マイクロプ
レートにまいた。細胞融合後、培地を100μM
ヒポキサンテン、0.4μMアミノプテリン、
16μMチミジンを添加したRPMI培地（HAT培
地）に置き換えた。HAT培地で培養中２〜３
週間で、脾臓細胞とミエローマの細胞のハイブ
リドーマのみが生育した。ハイブリドーマの培
養液中の抗体活性を、以下に述べるELISA法
で調べた。

［抗体のスクリーニング］ LSアポ蛋白をELISA用のプレートに付着させ、
10mMリン酸生理食塩液（PH7.4）に３％（ｗ／
ｖ）のBSAを添加した液で、ブロツキングを行
つた。ブロツキング後、ハイブリドーマ培養液
50μをELISAプレートに添加し、室温で２時間
又は４℃で一夜培養した。その後、ビオチン化ウ
マ抗マウスIgGイムノグロブリン（2μｇ／ml）
50μの２次抗体を添加、室温で１時間反応さ
せ。これに、50μの西洋ワサビパーオキシダー
ゼアビジンＤ溶液（1μｇ／ml）を加え、LSアポ
蛋白に結合した抗体を、100μの基質溶液（0.1
％Ｏ−フエニレンジアミン、0.015％H₂O₂，0.1M
クエン酸緩衝液、PH4.6）を加える事により検出
した。

(3) LSアポ蛋白に対する抗体を産生するハイブ
リドーマを選別し、更に限界希釈法によるクロ
ーニングを行ない、最終的に単一クローンのハ
イブリドーマ２種が得れた。このハイブリドー
マを、それぞれ、プリスタン投与BALB／Ｃ
マウスの腹腔で増殖させ、モノクローナル抗体
を含む腹水を得た。得られた腹水に50％飽和硫
安を加え抗体を沈澱させ、この沈澱物を0.1M
リン酸生理食塩液（PH8.0）に溶解させた。そ
して透析後、プロテインＡ−セフアロース
CL4Bカラム（フアルマシア社製）にかけ、抗
体を0.2Mグリシン−塩酸バツフアー（PH3.0）
で溶出して精製した。

２種類のハイブリドーマから得られたモノクロ
ーナル抗体を、それぞれPC6，PE10と命名した。

Claims

【特許請求の範囲】１ヒトの肺表面活性物質の分子量約62000およ
び約34000〜37000のアポ蛋白を認識する、IgG型
のマウスモノクローナル抗体を産生するマウス−
マウスハイブリドーマおよびそれに由来する細胞
株。２ヒトの肺表面活性物質の分子量約62000およ
び約34000〜37000のアポ蛋白でマウスを免疫し、
該マウスから得られる抗体産生細胞とマウスのミ
エローマ細胞を融合させることを特徴とする、分
子量約62000および約34000〜37000のヒトの肺表
面活性物質のアポ蛋白を認識するIgG型のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造
法。