JPH0465838B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 (イ) 産業上の利用分野 この発明は、DNAやRNAなどの核酸合成装置
に関する。

(ロ) 従来技術 核酸の合成法として、いわゆるジエステル法、
トリエステル法、ホスフアイト法と改良発展がな
され、さらにこれらの方法を利用し、固形支持体
を用いる固形支持体法が各種の利点を有すること
から多用されるに至つている。そしてこれらの方
法によつて核酸合成を行う装置も各種提案されて
いる。

いずれの装置も基本的には、反応器、保護基で
ブロツクされた複数種のヌクレオチド試薬を所定
の手順で前記反応器に供給可能なヌクレオチド試
薬供給手段、保護基脱離剤と合成用縮合剤とマス
キング剤とマスキング用縮合剤とを各々前記反応
器に供給可能な反応試薬供給手段および前記ヌク
レオチド試薬供給手段と前記反応試薬供給手段と
を制御して保護基離脱工程との合成縮合工程とマ
スキング縮合工程とを繰返して該酸合成を遂行す
る制御手段を具備してなつている。

ところでヌクレオチド試薬は基本的に塩基の違
いによつて４種類あり、これらを用いる手順を正
しくしなければ所望の塩基シーケンスをもつ核酸
を合成することはできない。

しかし、従来の核酸合成装置では、ヌクレオチ
ド試薬が正しく所定の手順で用いられているか否
かをチエツクすることができなかつたので、たと
えばヌクレオチド試薬を装置に誤つてセツトする
ことによつてしばしば誤つた塩基シーケンスの核
酸を合成してしまうことがあつた。

(ハ) 発明の目的 この発明は、核酸合成の際にヌクレオチド試薬
が正しく所定の手順で用いらるれているか否かを
チエツクすることが可能な核酸合成装置を提供す
ることを目的とする。

(ニ) 発明の構成 この発明は、保護基でブロツクされた複数のヌ
クレオチド試薬を所定の手順で反応器に供給して
保護基離脱工程と縮合工程とマスキング工程とを
繰返し、核酸合成を行う装置において、反応器の
排液経路に保護基離脱工程での排液の吸光度を２
以上の異なる波長で測定しうる吸光測定手段を設
けると共にその吸光度測定手段の出力側にその出
力に基いて排液中に含まれる脱離した保護基の定
性および定量を行う定性・定量演算手段を設けて
なる核酸合成装置を提供する。

異なる種類のヌクレオチド試薬ごとに異なる種
類の保護基を付けておき、脱離した保護基を定性
すれば、どのヌクレオチド試薬を用いたかを知る
ことができるで、それによりヌクレオチド試薬が
所定の手順で用いられているかを否かをチエツク
できる。

上記吸光度測定手段および上記定性・定量演算
手段を従来公知の核酸合成装置に付設すること
で、容易にこの発明の装置を達成できるものであ
る。

(ホ) 実施例 第１図に示す(1)は、この発明の一実施例であ
り、ホスホトリエステル法によるDNA微量自動
合成装置である。

まず、合成部の構成について説明する。

反応器２は内径８mm、高さ10mmの円筒状の本体
３の上方にすりばち状フランジ４を設けた容器で
ある。すりばち状フランジ４には、多数の試薬溶
液等供給用のノズルが挿着された栓５が装着され
ている。そこで、本体３の頭部開口が試薬溶液等
供給口６となる。本体３の内部下方にはガラスフ
イルタのごときフイルタ７が嵌着され、さらに底
部には排液口８が設けられている。フイルタ７
は、ポリスチレン、シリカビーズのごとき支持体
９を載置できる（透過させない）もので、試薬溶
液、溶媒、ガスを透過させるものでいる。フイル
タ７の上部空間が反応部１０になり、約450μlの
容積の空間である。

試薬溶液は全部で８種類ある。

１１〜１４は各種のヌクレオチド試薬溶液で、
それぞれ塩基にアデニン、シトシン、グアニン、
チミンを有している。アデニンを塩基にもつヌク
レオチド試薬溶液１１の５′は水酸基は、４−モ
ノメトキシトリチル基（MMTr）を保護基とし
てブロツクされている。同様に、シトシンを塩基
にもつヌクレオチド試薬溶液１２は４，4′−ジメ
トキシトリチル基（DMTr）でブロツクされて
おり、グアニンを塩基にもつヌクレオチド試薬溶
液１３は４，4′，4″−トリメトキシトリエチル基
（TMTr）でブロツクされており、チミンを塩基
にもつヌクレオチド試薬溶液１４はトリメチル基
（Tr）でブロツクされている。

１５は縮合剤で、２−４−６−トリメチルベン
ゼンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド
（MSNT）のピリジン溶液である。３９は保護基
脱離剤で、イソプロパノールと塩化メチレンの混
合溶媒に臭化亜鉛を溶解した溶液である。４０は
マスキング用試薬で、無水酢酸とピリジンの混合
液である。４１はマスキング用縮合剤で、ジメチ
ルアミノピリジンのピリジン溶液である。

シリンジポンプ２１〜２５は、それぞれ切換コ
ツク１６〜２０を介して上記試薬溶液１１〜１５
を吸収し、反応器２へ供給しうる。

シリンジポンプ２１〜２５のプラジヤはそれぞ
れプランジヤ駆動機構２６〜３０で駆動される。

プランジヤ駆動機構２６は、パルスモータ３１
と、それにより回転されるネジ軸３２と、そのネ
ジ軸３３の回転により移動してプランジヤ２１ａ
を上下させるナツト３３とからなつており、パル
スモータ３１はマイクロコンピユータのごとき制
御回路３４でパルス制御されている。他のプラン
ジヤ駆動機構２７〜３０も同様の構造である。

３６〜３８は溶媒で、それぞれ乾燥用揮発性溶
媒のテトラヒドロフラン（THF）、洗浄用溶媒の
ピリジン、同じく洗浄用溶媒のイソプロパノール
と塩化メチレンの混合液である。これら溶媒３６
〜３８および前記試薬溶液３９〜４１は、窒素ガ
ス圧によつてそれぞれ弁４２〜４７を介して反応
器２に供給されうる。

弁４８は、窒素ガスで反応器２内をブローする
ために、窒素ガスを直接反応器２を供給するもの
である。窒素ガスは塩化カルシウムのごとき乾燥
剤４９で乾燥されている。

制御回路３４は、前述のようにプランシヤ制御
機構２６〜３０を制御する外に、切換コツク１６
〜２０、弁４２〜４８、排液弁５０および排気弁
５１の作動を制御する。また、操作卓３５を介し
てオペレータと対話を行う。

切換コツク５２は、反応器２の排液流路５３を
廃棄流路５４もしくは測定流路５５に切換接続す
るもので、制御回路３４によつて作動を制御され
る。

希釈容器５６は内容量1200ml位の円筒状容器
で、頭部は前記測定流路５５と接続されており、
底部は測定弁５７を介して吸光度測定ユニツト６
８のフローセル６９に接続されている。

希釈容器５６の側壁には光学式レベルセンサ５
８が取り付けられ、そのレベルセンサの出力は制
御回路３４に接続されている。

希釈容器５６には、弁６３を介して希釈および
洗浄のための液たとえば４％トリクロロ酢酸を含
む二塩化メチレン６０を供給可能である。さらに
希釈容器５６の頭部および底部から内部に、弁６
５，６６を介して窒素ガスを供給可能である。こ
れらの弁６３，６５，６６および排気弁６７およ
び前記測定弁５７は制御回路３４にて作動を制御
される。

吸光度測定ユニツト６８は、色色光源７０から
出た光を干渉フイルタで単波長とし、フローセル
６９を通して受光器７８にて検知する。第２図に
示すように、干渉フイルタは７２〜７５の４種類
ある。干渉フイルタ７２は波長500nm位の光を透
過し、干渉フイルタ７３は波長480nm位の光を透
過し、干渉フイルタ７４は波長440nm位の光透過
し、干渉フイルタ７５は波長420nm位の光を透過
する。回転軸７１ａのまわりにホルダー７１を回
転することでこれら干渉フイルタ７２〜７５のい
ずれか一つを選択して用いることができる。第１
図とは直角の方向から見た吸光度測定ユニツト６
８を第３図に示す。７７はレフアレンス・セル、
７９は受光器である。受光器７８，７９の出力は
制御回路３４に接続されており、制御回路３４は
受光器７８，７９の出力信号に基いて、脱離され
た保護基の定性と定量と収率の算出を行う。

DNA合成に際しては、まず栓５をはずして反
応器２内に、DMA分子の末端部分のみを結合し
た支持体９を入れる。この量は、たとえば支持体
９がポリスチレン粉体の場合には10mg〜50mgが好
適である。なお、DNA分子の末端部分の５′水酸
基たとえばDMTrでブロツクされている。栓５
を元に戻した後、入れた支持体９の量などを操作
卓３５を介して制御回路３４に入力し、ついでス
タート指令を入力する。

すると制御回路３４は、切換コツク１６〜２
０、プランジヤ駆動回路２６〜３０、弁４２〜４
８，５０，５１を適切に作動させて、第４図Ａに
示す合成サイクルを実行し、操作卓３５で入力さ
れた目的DNAを合成する。そして同時に、第２
図Ｂに示す定性・定量・収率測定を行う。

すなわち、脱保護基工程において反応器２から
排液を何回か排出する際、切換コツク５２を測定
流路５５側に切換えてそれを希釈容器５６に分取
する。また、イソプロパノールと塩化メチレンの
混合液３８で洗浄するときの排液も同様に希釈容
器５６に分取する。こうして、脱離された保護基
を全て希釈容器５６に集める。その後、制御回路
３４は、切換コツク５２を廃棄流路５４側に戻
し、合成サイクルを続行するのと並行して次のよ
うに動作する。

まず弁６３を作動して希釈液６０を注入し、液
面がレベルセンサ５８の位置となるようにする。
これによつて、測定対象である前記排液は適切な
一定濃度に希釈される。次に弁６６を作動して窒
素ガスでバブリングし、希釈容器５６内に撹拌
し、弁５７，６５を作動し、フローセル６９を通
じて排出する。このときフイルタ７２，７３，７
４，７５のそれぞれを用いて異なる波長で吸光度
測定を行い、その後、希釈液６０で洗浄する。

第５図イ，ロ，ハ，ニは、それぞれMMTr、
DMTr、TMTr、Trの吸光度スペクトルの図で
ある。図より容易に理解されるように、420nm、
440nm、480nmおよび500nmにおける吸光度を得
れば、それらの相対パターンから、保護基が
MMTrか、DMTrか、TMTrか、Trかを同定す
ることができる。脱離された保護基をかくして定
性した後、それが予め設定していた順番の保護基
であるか否かをチエツクする。そしてもし異なつ
た保護基であれば、それは所定の手順のヌクレオ
チド試薬が用いられなかつたことを意味している
から、合成サイクルを停止し、操作卓３５におい
てアラームランプを点灯するなどしてオペレータ
に警報を発する。一方、定性した保護基が予め設
定していた順番の保護基であれば、ヌクレオチド
試薬が所定の手順で用いられていることを意味し
ているから、次に定量を行う。

定量は、定性によつて保護基の種類に分つてお
りかつ排液の希釈度も適切な一定濃度であるか
ら、予め設定されていた校正値と比較することで
容易に行いうる。定量の後、収率の演算を行う。

収率の演算は、その合成サイクルにおける定量
値を、記憶しておいた前回の合成サイクルにおけ
る定量値で徐して100を乗じることによつて行う。
得られた収率は、前回の合成サイクルの収率であ
る。つまり第１回目の合成サイクルの収率は、第
２回目の合成サイクルの途中で得られることにな
る。その収率は操作卓３５において表示される。

制御回路３４は、上記のように或る合成サイク
ルの収率を演算すると共に、それまでの合成サイ
クルの収率のすべて乗じて全体の収率を演算し、
それを操作卓３５において表示する。

さらに制御回路３４は、或る合成サイクルの収
率が所定値（たとえば80％）以上であるか否かの
判断と全体の収率が所定値（たとえば30％）以上
であるか否かの判断とを行い、いずれか一方でも
所定値以上でない場合には並行して実行している
合成サイクルを停止し、操作卓３５においてアラ
ームランムを点灯するなどしてオペレータに警報
を発する。

合成部の変形例として、反応器２をロート状に
したもの、樽状にしたもの、また反応部の容積を
80μ〜800μの間で変化したものが挙げられ
る。また固体支持体としてkel−Ｆ・ｇスチレン、
シリカゲル、ポリアクリルモルホリドなどを用い
たものが挙げられる。これらの支持体は粒径30〜
300ミクロン程度のものが好ましい。

脱保護基定量の変形例としては、脱保護基工程
で何回か排出される排液を集めてから希釈してい
るが、排出されるごとに定量し、これらを積算し
て脱離された保護基の総量を求めるようにしても
よい。

吸光度測定ユニツト６８の変形例としては、定
性すべき保護基の種類に応じて干渉フイルタの数
（すなわち測定波長の数）を増減したものが挙げ
られる。さらにグレーテイングやプリズムを用い
た分光光度計でスペクトルを測定するものが挙げ
られる。

保護基は、上記実施例で挙げた以外の低級アル
コキシ基で任意に置換されたトリチル基を用いて
もよい。

また希釈液に代えて希釈発色液たとえばエタノ
ールと過塩素酸の混合液を加えるようにしてもよ
い。

他の実施例としては、ホスホモノトリアゾリド
法やホスフアイト法、あるいはジエステル法によ
るDNA等合成装置にこの発明を適用したものが
挙げられる。また複数の合成部に対して１つの脱
保護基定量・収率演算・自動停止制御部を対応さ
せたものが挙げられる。この場合、収率の高い合
成部では合成動作が続行され、収率の低い合成部
では合成部が停止されるようになる。

なお収率の低下により停止しても、オペレータ
の指示によつて再び合成動作を続行しうるように
するのが好ましい。

上記の実施例のDNA合成装置１によれば、反
応器２の反応部１０を小型化すると共に、フイル
タ７の上に支持体９を載置し、上方から試薬溶液
１１〜１５を供給し、底部から排液するように反
応器２を構成している。そこで排液弁５０を閉じ
たまま試薬溶液を上方から供給すれば、その試薬
溶液は支持体９に含まれてこれを膨潤すると共に
フイルタ７より上の反応部１０内にとどまつて下
方へ落ちない。従つて、供給した全ての試薬溶液
が反応に参加し、デツトスペースに溜まるものが
無くなる。この結果、供給量は最低量（支持体体
積の５〜７倍位）で充分になり、また反応を促進
するために反応器を振侭するなどの混合・接触操
作も無用になつている。また、新たなヌクレオチ
ドを連結する反応の前に反応器２内をTHF３６
で洗浄乾燥すると共に乾燥ガスでブローして短時
間で反応器２内を完全乾燥できるように構成され
ており、この結果、縮合反応を阻害する水分を完
全に除去できるので反応効率が下がらず、余分な
試薬を必要としない。さらに、合成中に反応収率
を容易に知ることができて非常に便利である。な
んとなれば、合成が適正に行われているか否かの
チエツクを極めて容易に行えるからである。ま
た、収率が所定レベルより落ちたときに自動的に
合成の動作を停止するから、試薬と時間の無駄が
省かれると共に無人運転も可能となり、実用的で
ある。

(ヘ) 発明の効果 この発明の核酸合成装置によれば、保護基離脱
工程で離脱した保護基の定性を行うことができ
る。そこでたとえば異種のヌクレオチド試薬ごと
に保護基の種類を変えておけば、保護基を定性す
ることから逆に合成に用いられたヌクレオチド試
薬の種類を推定でき、所定の手順でヌクレオチド
試薬が用いられているか否かを確認することがで
きて、装置の信頼性が向上する。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の核酸合成装置の一実施例で
あるDNA微量合成装置の構成説明図、第２図は
第１図に示す装置の干渉フイルタ部分の構成説明
図、第３図は第１図に示す装置の吸光度測定ユニ
ツトの構成説明図、第４図は第１図に示す装置の
動作のフローチヤート、第５図イ〜ニはそれぞれ
保護基であるMMTr、DMTr、TMTrおよびTr
の吸光度のスペクトル図である。 １……DNA微量自動合成装置、２……反応器、
１１〜１４……ヌクレオチド試薬溶液、１５，３
９〜４１……試薬溶液、３４……制御回路、３５
……操作卓、５２……切換コツク、５３……排液
流路、５５……測定流路、５６……希釈容器、５
８……レベルセンサ、６０……希釈液、６８……
吸光度測定ユニツト、６９……フローセル、７
２，７３，７４，７５……干渉フイルタ、７７…
…レフアレンスセル、７８，７９……受光器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 保護基でブロツクされた複数のヌクレオチド
   試薬を所定の手順で反応器に供給して保護基離脱
   工程と縮合工程とマスキング工程とを繰返し、核
   酸合成を行う装置において、 反応器の排液経路に保護基離脱工程での排液の
   吸光度を２以上の異なる波長で測定しうる吸光度
   測定手段を設けると共にその吸光度測定手段の出
   力側にその出力に基いて排液中に含まれる脱離し
   た保護基の定性および定量を行う定性・定量演算
   手段を設けてなることを特徴とする核酸合成装
   置。