JPH0466877B2

JPH0466877B2 -

Info

Publication number: JPH0466877B2
Application number: JP25104883A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Myake; Takanori Oka
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-12-26
Filing date: 1983-12-26
Publication date: 1992-10-26
Also published as: JPS60136593A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景技術分野本発明は、固相法、すなわち固体支持体粒子上
での反応によつて、核酸を合成するための装置に
関する。さらに具体的には、本発明は、反応室の
下部からの液相材料の定量的吸引および撹拌用ガ
スの吸引を簡単に行なえるようにした核酸合成器
に関する。先行技術遺伝子工学の技術的基礎となる遺伝子操作に化
学合成オリゴヌクレオチドが使用され始めてから
今日まで、遺伝子操作の発展はめざましいものが
あり、それに伴なう化学合成オリゴヌクレオチド
の果たした役割は大きいものと言える。オリゴヌクレオチドの合成法には、ジエステル
法（Science、203、614（1979））、トリエステル法
（Nucleic Acids Research、８、2331（1980）、同
８、5193（1980）、同８、5491（1980））、ホスフア
イト法（Tetrahedrom Letters、22、1859
（1981））、あるいは固相法（Nature、281、18
（1979）、Biochemistry、1980、6096（1980））、液
相法、あるいは酵素を用いる方法（Nucleic
Acids Research、８、5753（1980））等があり、
今日ではトリエステル法−固相法（Nucleic
Acids Research、８、5507（1980））またはホス
フアイト法−固相法（J.Am.Chem.Soc、103、
3185−3191（1981））の組合せが最も一般的であつ
て、技術的にもかなり確立された方法となつてい
る。そこで、これらの方法を用い、省力化を目的
として完全に自動化されたDNA合成装置がすで
に数機種発売されているが、いずれにせよ価格、
持ち運び、配置スペースなどに問題が残されてい
る。一方、実際面においては、一回の遺伝子操作で
必要とされるオリゴヌクレオチドは、一般に鎖長
15マー（mer）から25マー（mer）程度のプライ
マー、プローブ、リンカーなど数体であり、量的
にも多くて0.5OD程度である。したがつて、遺伝
子操作などに用いられる程度のオリゴヌクレオチ
ドの合成を随時可能とした安価でかつ簡易な核酸
合成器が望まれていた。発明の概要要旨本発明は、固相法によるオリゴヌクレオチド類
の合成に必要な一連の工程（たとえば、試薬等の
吸入、撹拌、反応（縮合、脱保護基、マスキング
等）、排出および内容物の洗浄乾燥等）を手動に
より可能とした核酸合成器を提供するものであ
る。すなわち、本発明による固体支持体粒子上での
反応によつて核酸を合成するための核酸合成器
は、着脱自在に連結された下記の部材ＡおよびＢ
からなること、を特徴とするものである。 (A) 下記の部材（Ａ−１）〜（Ａ−４）からなる
反応器。 (A‐1) 該固体支持体粒子を収容して該反応を行
なわせるのに十分な容積を有する円筒からな
る反応室、 (A‐2) 反応室（Ａ−１）の下方への延長部をな
しかつ反応室（Ａ−１）の下部より内径の小
さい、該固体支持体粒子保持用フイルターを
取付けるための取付座、 (A‐3) 取付座（Ａ−２）に取付けられた、該固
体支持体粒子保持用フイルター、 (A‐4) 反応室（Ａ−１）のさらに取付座（Ａ−
２）下方への延長部をなす、反応室（Ａ−
１）へ該反応に関与する液相材料を出入させ
るための給排液管、 (B) 下記の部材（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）からなる
給排気装置。 (B‐1) 上記反応室（Ａ−１）の上部において該
反応室と連通すべきシリンダー（Ｂ−１−
ａ）とその内部に設けられたピストン棒付き
ピストン（Ｂ−１−ｂ）とからなる正負圧発
生装置、 (B‐2) ピストン（Ｂ−１−ｂ）のピストン棒の
延長としての、ピストン駆動用棒部材、 (B‐3) 棒部材（Ｂ−２）を、ピストン（Ｂ−１
−ｂ）を退行させるように賦勢すべく配設し
たバネ部材、 (B‐4) バネ部材（Ｂ−３）によつて賦勢される
棒部材（Ｂ−２）の退行を所定位置に停止さ
せる制退機構。たヾし、この制退機構は、棒
部材（Ｂ−２）に設けられた突起（Ｂ−２−
ａ）とこれと係合する停止装置（Ｂ−４−
ａ）とからなり、突起（Ｂ−２−ａ）と停止
機構（Ｂ−４−ａ）とは棒部材（Ｂ−２）の
上記停止位置からの更なる退行を許容ししか
も更なる退行の後に再び上記停止位置への復
帰を許容するよう構成されたものである。効果このように、本発明は手動操作の可能な核酸合
成器に関するものであるが、本発明の核酸合成器
によつて操作マニユアルに従つてオリゴヌクレオ
チドの合成を行えば、有機合成の経験者でなくと
も簡単な操作で確実にしかも高収率で所望のオリ
ゴヌクレチオドを得ることができる。また、本発
明核酸合成器は、従来の自動化された核酸合成装
置で問題とされている価格、持ち運び性または配
置スペース等の点で解決されたものである。従つ
て、本発明によれば高価な自動化された核酸合成
装置を使わなくとも、遺伝子工学の分野において
常用されるオリゴヌクレオチドであるプライマ
ー、プローブ、リンカー等の合成が可能であり、
今後合成オリゴヌクレオチドの遺伝子工学への利
用に大きく貢献するものと思われる。本発明核酸合成器をその構成要素の面からみた
場合の一つの特色は、反応室の下部から所謂ピペ
ツトの原理で固相合成に必要な反応体、溶媒等の
液相材料を反応室へ吸引するためのシリンダー／
ピストン装置がピストンの二段階退行可能のよう
に構成されているということである。すなわち、
このような吸引装置によれば、第一段階のピスト
ンの退行で所定量の液相材料を吸引し、第二段階
のピストンの退行で空気（または不活性ガス）を
吸引してその気泡で固相反応系を撹拌することが
でき、両操作を極めて容易に実行することができ
る。発明の具体的説明核酸合成器合成器の概要本発明による核酸合成器は、固体支持体樹脂粒
子上での反応によつて、すなわち固相法によつ
て、核酸を合成するのに使用する装置であつて、
前記の部材Ａ−１〜Ａ−４およびＢ−１〜Ｂ−４
からなるものである。本発明装置の可動部分は、
主として給排気装置Ｂであるが、この部分の駆動
は電動によりあるいは合成操作をコンピユーター
管理の下に行なうことも勿論可能であるけれど
も、実験者が手動でこれを操作することが本発明
装置を利用するうえで最も好ましい。本発明による合成器の一具体例は、第１図にそ
の側断面図で示した反応器と第２図の側断面図で
示した給排気装置とを連結してなるものである。反応室（Ａ−１）反応室（Ａ−１）は、第１図にその側断面を示
してあるように、固相合成用固体支持体樹脂粒子
を収容して該反応を行なわせるのに十分な容積を
有する円筒からなる。ここで「円筒」とは、断面
が実質的に円形であつて、直径（断面が真円でな
い場合は相当直径）に比べて長さが十分に大きい
もの（特に、長さが少なくとも直径と同一である
もの）を意味する。また、その断面の形状ないし
大きさは長さ方向に関して同一でなくてもよく、
必要に応じて内部に突起を有するものであつても
よい。反応室（Ａ−１）の上部には、反応室を給排気
装置Ｂ（詳細後記）と着脱自在に連結するための
手段、たとえば雄ネジの刻設（Ａ−５）（第１
図）、が構じられている。一方、反応室（Ａ−１）の下部には、反応室円
筒の内径より小径のフイルター取付座（Ａ−２）
が設けられている（詳細後記）。反応室部分の材質は有機溶媒に耐性のものであ
れば何如なるものでもよく、ステンレス鋼、テフ
ロン、ガラス等の材質が適当なものとして考えら
れる。反応の状態や樹脂の状態が容易に確認でき
るということからは、ガラスが好ましい。特に、
反応室（Ａ−１）が透明であると、ヌクレオチド
等の脱トリチル化を行なう際の指標として溶液の
着色（橙〜黄）を利用することができて便利であ
る。また、反応器の内壁をシリコンで被覆するこ
とによつてヌクレオチドの縮合反応に際して使用
する樹脂が付着しないようにすればさらに好まし
い。なお、円筒の内径としては通常10mm程度であ
れば十分である。フイルター取付座（Ａ−２）固体支持体樹脂粒子保持用フイルター（詳細後
記）を取付けるための取付座（Ａ−２）は、反応
室（Ａ−１）の下方への延長部分をなし、かつ反
応室（Ａ−１）の下部より直径の小さい部材であ
る。ここで「反応室（Ａ−１）の下部より内径の
小さい）ということは、このフイルターが取付け
られている当該個所がこのフイルター取付座（Ａ
−２）が接続されている個所での反応室（Ａ−
１）の内径より小さければよいということを意味
するものである。従つて、反応室（Ａ−１）の上
方にさらに小径の部分が存在している場合を排除
しないのであり、また第１図に示したもののよう
にこのフイルター取付座（Ａ−２）の内径が下方
に向つて連続的に減少する場合をもまたこのフイ
ルター取付座（Ａ−２）の当該フイルター取付個
所より下方で拡径されている場合をも、包含する
ものである。フイルター取付座（Ａ−２）の一具体例は、図
示のようなロート状のものである。図示のものは
直径に比べて上下方向の寸法が比較的小さいが、
図示のものよりも縦長のロート状であつても勿論
差支えない。また、ロートの内径は続連的に減少
（下方へ）していてもよいが、内径の減少は段階
的であつてもよい。フイルター（Ａ−３）フイルター（Ａ−３）は、固相合成法用の固体
支持体樹脂粒子を支承しかつ液相材料の通過を許
容する構造ものであれば任意の形状、素材その他
のものでありうる。最も典型的なフイルターは、所謂ガラスフイル
ターとして知られている過部構造のものであ
る。また、セラミツクもフイルター部材と考えら
れる。フイルターとしての開孔度は、支持体樹脂
粒子が逸出しないよう40〜50ミクロン程度（ガラ
スフイルターでいえばＧ−２規格品程度）である
ことが好ましい。フイルターの他の具体例は、グラスウールであ
る。フイルター（Ａ−３）は取付座（Ａ−２）に取
付けられているが、ここで「取付けられた」とい
うことは取付座から着脱可能である場合と着脱不
能の場合のいずれをも包含するものとする。着脱
可能である場合には、その下方より進入してくる
合成反応用液相材料によつて上方に押上げられな
いようにその取付け方に配慮すべきである。給排液管（Ａ−４）給排液口は、反応室（Ａ−１）のさらに取付座
（Ａ−２）の下方への延長部をなして存在する。給排液管（Ａ−４）の開口部は、ゴムキヤツプ
（Ａ−６）によつて封じることができる。なお、（Ａ−１）〜（Ａ−４）からなる反応器
は、本発明者らの先行発明（昭和58年12月19日特
許出願）にかゝるものである。給排気装置フレーム（Ｂ−０）本発明核酸合成器は上記反応器Ａと給排気装置
Ｂとからなるが、給排気装置の各部材は第２図に
その側断面図で示すようにフレーム（Ｂ−０）内
に設けることが好ましい。フレーム（Ｂ−０）は、図示の例では、金属、
合成樹脂等で一体に形成したものであるが、その
内部への部材の収容ないし取外しのために適宜分
割しうる構造であつてもよいことはいうまでもな
い。フレーム（Ｂ−０）の下端部（第２図）には、
前記反応室上部の雄ネジ部（Ａ−５）と係合して
反応室をフレーム下部に連結するための雄ネジ環
（Ｂ−０−ａ）が設けられている。フレーム（Ｂ−０）への反応室（Ａ−１）の連
結は、シリンダー（Ｂ−１−ａ）（詳細後記）と
連通するフレーム延長部（Ｂ−０−ｂ）にパツキ
ン（Ｂ−０−ｃ）を嵌装したうえ、このパツキン
（Ｂ−０−ｃ）に反応室（Ａ−５）の上部を当接
させてこれを雄ネジ環（Ｂ−０−ａ）によつて螺
着すればよい。第３図は、本発明による核酸合成器、特にフレ
ーム、の一例の外観を示す説明図である。正負圧発生装置（Ｂ−１）正負圧発生装置（Ｂ−１）は、前記反応室（Ａ
−１）と連通するシリンダー（Ｂ−１−ａ）とそ
の内部に設けられたピストン棒付きピストン（Ｂ
−１−ｂ）とからなる。シリンダー（Ｂ−１−ａ）の長さは、ピストン
（Ｂ−１−ｂ）が退行して（すなわち、第２図の
場合は上方へ移動して）所定の排気量、すなわち
所定量の液相材料を吸引し、さらに空気をも吸引
するための負圧を発生しうる量、が実現できるの
に十分なものでなければならない。前記の内径10
mm程度の反応室に対しては、シリンダーの大きさ
は内径10mm程度×長さ30mm程度で十分である。ピストンにはピストン棒（Ｂ−１−ｃ）が付属
しており、これはその延長としてのピストン駆動
用棒部材（Ｂ−２）へとつながる。ピストン駆動装置用ハウジング（Ｂ−５）ピストン棒（Ｂ−１−ｃ）は、シリンダー（Ｂ
−１−ａ）の上部でフレームに設けられた貫孔
（Ｂ−０−ｂ）を貫通して上部へ延びてピストン
駆動用棒部材（Ｂ−２）となる。ピストン駆動用棒部材（Ｂ−２）は、その賦勢
用バネ部材（Ｂ−３）（詳細後記）等と共に、フ
レーム（Ｂ−０）内に設けられたハウジング（Ｂ
−５）内に収容されている。従つて、ハウジング
（Ｂ−５）は、フレームの貫孔（Ｂ−０−ｄ）を
介してシンリンダー（Ｂ−１−ａ）と連結されて
いる。ハウジング（Ｂ−５）は、シリンダー（Ｂ−１
−ａ）と同心のシリンダー状のものであることが
ふつうである。ピストン棒（Ｂ−１−ｃ）およびその延長とし
ての棒部材（Ｂ−２）とは中実のものであつても
よいが、反応室（Ａ−１）内に外部から乾燥用あ
るいは反応雰囲気用のガス（たとえば窒素ガス）
を供給するため、その芯部に貫孔（Ｂ−２−ｈ）
を設けることが好ましい。その場合には、反応室
（Ａ−１）と外界との連通を断つべく適当な弁装
置たとえばニードル弁（Ｂ−２−ｅ）およびその
カバー（Ｂ−２−ｆ）、ならびにガス源との継手
（Ｂ−２−ｇ）を設けることが好ましい。また、
棒部材（Ｂ−２）、ひいてはピストン（Ｂ−１−
ｃ）、の退行量を本合成器外部から知るために、
ピストン棒（Ｂ−１−ｃ）ないし棒部材（Ｂ−
２）の側面に数字、記号ないし目盛り（Ｂ−１−
ｄ）を記して、これをフレーム（Ｂ−０）に設け
た覗き孔（Ｂ−０−ｅ）（第３図）から見られる
ようにすることもできる。バネ部材（Ｂ−３）ハウジング（Ｂ−５）内には、棒部材（Ｂ−
２）をピストン（Ｂ−１−ｂ）を退行させるよう
に賦勢すべく配設したバネ部材が収容されてい
る。「ピストンを退行させるように賦勢すべく配設
した」ということは、たとえばコイルバネ部材
（Ｂ−３）の一端を棒部材（Ｂ−２）に、他端を
フレーム上の固定点に係止させて、コイルバネの
反発力あるいは収縮力によつて棒部材（Ｂ−２）
を退行（第２図では上方）させるようにしたこと
を意味するものである。第２図の具体例はその典
型的なものであつて、蓄勢されたコイルバネの反
発力によつて、棒部材（Ｂ−２）を退行させるよ
うになつている。ピストンを退行させるべくバネ部材を棒部材に
係止させるためには、棒部材には適当なバネ係止
具を設ける必要があるが、その代表的なものはコ
イルバネを接受して押圧力を伝えるバネ座であ
る。バネ座は棒部材そのものに設けてもよいが、第
２図の具体例に示したように、棒部材（Ｂ−２）
にネジ（Ｂ−２−ｃ）を介して嵌装されたスリー
ブ（Ｂ−２−ｂ）に円板状（Ｂ−２−ａ）に設け
ることが好ましい。このようにすれば、スリーブ
（Ｂ−２−ｂ）をフレーム外のつまみ（Ｂ−２−
ｄ）により回転させて、バネ座（Ｂ−２−ｃ）の
位置を上下させることができ、それによつて制退
機構（Ｂ−４）（詳細後記）によるピストン退行
量を調節することができる。なお、スリーブ（Ｂ
−２−ｂ）上の円板（Ｂ−２−ａ）は棒部材（Ｂ
−２）と剛体的に連結されているであるから、こ
のような円板（Ｂ−２−ａ）をも本発明では「棒
部材（Ｂ−２）に設けられた突起」というものと
する。制退機構（Ｂ−４）バネ部材（Ｂ−３）によつて賦勢される棒部材
（Ｂ−２）の退行を所定位置に停止させて所定量
の給気量を保証し、しかもその位置から更なる退
行を許容する制退機構（Ｂ−４）は、先ず、棒部
材（Ｂ−２）に設けられた突起（Ｂ−２−ａ）と
これと係合する停止装置（Ｂ−４−ａ）とからな
るものである。ここで、部材（Ｂ−２−ａ）は停
止装置（Ｂ−４）と係合するという点では突起で
あるが、これがコイルバネを接受するものである
場合は円板であり、しかもスリーブ（Ｂ−２−
ｂ）を介して間接的に棒部材（Ｂ−２）に設けら
れたものであつてもよいことは前記した通りであ
る。停止機構（Ｂ−４−ａ）は、突起（Ｂ−２−
ａ）との関係において、棒部材の上記停止位置か
らの更なる退行を許容し、しかもこの更なる退行
の後に再び上記停止位置への復帰を許容するよう
に構成されている。そのような構成の停止機構の一つの具体例は、
第２図にその側断面図を示したような、一方向係
止爪（Ｂ−４−ａ）を有する機構のものである。
すなわち、係止爪（Ｂ−４−ａ）は、突起（Ｂ−
２−ａ）の先端が移動の際に描く軌跡に対して直
角に、換言すれば棒部材（Ｂ−２）に設けられた
突起（Ｂ−２−ａ）が褶動接触するハウジング
（Ｂ−５）の側壁に直角に設けられた孔内に出入
自在にかつ該係止爪の頂部がハウジング（Ｂ−
５）内に突出するようバネ機構（詳細後記）で押
圧されるように、構成されている。係止爪は楔形
頂部を持つ棒状材からなり、その頂部は、棒部材
（Ｂ−２）の突起（Ｂ−２−ａ）がバネ（Ｂ−３）
によつて上方に押圧されたときに該係止爪によつ
て棒部材（Ｂ−２）の退行を停止させるようにそ
の下部（第２図の位置関係での下部）が水平に、
上部に傾斜していて該突起（Ｂ−２−ａ）が上記
停止位置から更に退行した位置から再び該停止位
置へ戻る（下向きに移動）ときに該係止爪を係止
爪孔へ押込むような分力が働くように、構成され
ている。係止爪（Ｂ−４−ａ）は、本発明に従つて、棒
部材（Ｂ−２）、ひいてはピストン（Ｂ−１−
ｂ）、の退行を一旦停止させ、そののち停止状態
を解除するものでなければならず、またその操作
は手動で可能であることが望ましい。従つて、係
止爪（Ｂ−４−ａ）はフレーム（Ｂ−０）の外側
からそのような操作が可能なものでなければなら
ない。第２図に示したものはそのように配慮され
た係止爪の一具体例であつて、係止爪（Ｂ−４−
ａ）は操作ノブ（Ｂ−４−ｂ）との間にピニオン
（Ｂ−４−ｃ）を介して所謂「ラツクおよびピニ
オン」の関係で係合している。操作ノブ（Ｂ−４
−ｂ）はスプリング（Ｂ−４−ｄ）によつてフレ
ーム（Ｂ−０）外へと押圧されている。このよう
な構成において、操作ノブ（Ｂ−４−ｂ）を押込
めば、係止爪（Ｂ−４−ａ）は引込まれて、棒部
材突起（Ｂ−２−ａ）との係合関係が解除され
て、棒部材の更なる退行が実現される。その後、
棒部材（Ｂ−２）をフレーム（Ｂ−０）内に押込
めば、突起（Ｂ−２−ａ）によつて係止爪（Ｂ−
４−ａ）が押込まれて（その際、操作ノブ（Ｂ−
４−ｂ）も引込まれることになる）、突起（Ｂ−
２−ａ）は係止爪（Ｂ−４−ａ）を乗り越えるこ
とになる。操作ノブ（Ｂ−４−ｂ）は、図示の具体例で
は、ピニオン（Ｂ−４−ｃ）を介して係止爪（Ｂ
−４−ａ）と係合していて、該ノブを押込むこと
によつて係止爪（Ｂ−４−ａ）と突起（Ｂ−２−
ａ）との係合関係を解除することができるので、
実験操作上好都合である。このように操作ノブを
押込むことによつて所期の目的を達成するために
は、図示のような「ラツクおよびピニオン」の機
構によらなくても、操作ノブと係止爪との間をレ
バー機構、「滑車およびひも」機構その他合目的
的な機構を採用しうることは当業者にとつて自明
であろう。操作ノブと係止爪とは上記のように運動方向が
逆（すなわち、操作ノブを右方向へ押すと係止爪
が左方向へ引込む）である必要はない。従つて、
係止爪の基部側を延長して、この延長部を操作ノ
ブとして利用するように構成することができる。
一端の係止爪側がハウジング（Ｂ−５）内に臨
み、他端の操作ノブ側がフレーム（Ｂ−０）外に
臨むようにフレーム（Ｂ−０）を貫通する係止
爪／操作ノブ一体部品を係止爪頂部が常にハウジ
ング（Ｂ−５）内に突出するように押圧するバネ
機構は当業者にとつて自明であろう。図示の停止機構は、停止機構側が突起（Ｂ−２
−ａ）との停止位置での係合関係を解除すべく動
くという方式のものである。しかし、本発明で
「突起（Ｂ−２−ａ）と停止機構（Ｂ−４−ａ）
とは棒部材（Ｂ−２）の上記停止位置からの更な
る退行を許容ししかもこの更なる退行の後に再び
上記停止位置への復帰を許容するよう構成された
ものである」と定義される制退機構（Ｂ−４）
は、突起（Ｂ−２−ａ）側が係止爪（Ｂ−４−
ａ）との係合関係を解除すべく動くものである場
合をも包含するものである。このような制退機構
（Ｂ−４）の一具体例は、係止爪が固定されてお
り、一方突起（Ｂ−２−ａ）の円板からなつてい
て、その周辺部にこの係止爪によつて係止されな
い凹欠部を設けたものであるもの、である。この
ような構成において、係止爪（Ｂ−４−ａ）と円
板状突起（Ｂ−２−ａ）とは定常相互関係では係
合していて突起（Ｂ−２−ａ）は停止している
が、棒部材（Ｂ−２）をある回転角でもつて回転
させれば、係止爪と当接する部分が円板突起に設
けた凹欠部となつて、棒部材の更なる退行が許容
される。この更なる退行の後での停止位置への復
帰は、上記と逆のことを行なえばよいことは当業
者にとつて自明であろう。制退機構（Ｂ−４）は、要するに、ある部材の
所定方向への移動を阻止するが反対方向への移動
は許容し、しかも上記の所定方向への移動阻止を
必要に応じて解除しうるような機能を持つもの、
である。従つて、前記の諸具体例の外にも、解除
機構つきラチエツト装置が一般に利用可能であ
る。核酸の合成本発明の核酸合成器を使用して行なうオリゴヌ
クレオチドの合成は、下記の内容のものである。
なお、下記は好ましい具体例についてのそれであ
る。核酸合成の概要本発明は、アミノメチルポリスチレン、シリカ
ゲルまたはポリアクリルモルホリドなどの種々の
不溶性固体支持体（以下、樹脂で代表させる）粒
子に、ヌクレオシドを固定化し、順次ヌクレオチ
ド鎖の延長を行なう固相合成法を用いた核酸合成
器であり、ホスホジエステル法、ホスホトリエス
テル法、ホスフアイト法が適用可能であるが、望
ましくは、ポリスチレン樹脂を用いたホスホトリ
エステル法−固相法が用いられる。すなわち、アミノ基を有するポリスチレン樹脂
などをヌクレオシドのコハク酸誘導体とを縮合さ
せる周知の方法（Nucleic Acids Res、８、5473
−5489（1980））により合成された固定化ヌクレオ
シド類（それぞれ、塩基としてアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミン、またはウラシルを有す
る）か、または市販のヌクレオシド樹脂（DMT
−dA−（Ｎ−Bz）−Suc−AP、DMT−dC（Ｎ−
Bz）−Suc−AP、DMT−dG−（Ｎ−iBu）−Suc
−AP、DMT−Ｔ−Suc−AP。いずれもバイオ
サーチ社製）等を反応室（Ａ−１）に入れ、この
反応器Ａを給排気装置Ｂと連結し、あらかじめジ
クロロメタン等の適当な溶媒を吸入し約30分程度
放置することにより、内容樹脂の膨潤を行ない、
その後、下記に示す工程を順次繰り返すことで、
目的とするオリゴヌクレオチドを合成していくも
のである。脱トリチル化 5′−水酸基の保護基として慣用されているジメ
トキシトリチル基の除去には、一般にベンゼンス
ルホン酸、ZnBr₂（Nucleic Acids Res、10、
1755−1769（1982））、トリククロロアセテート
（以下TCAと略す）等が使用可能である。この場
合、遊離されたトリチル基による発色（橙〜黄）
で脱トリチルが確認できるため、発色しなくなる
まで脱トリチル化剤の吸入、撹拌、排出を行なう
ことで、トリチル基の除去を行なうことができ
る。縮合無水ピリジン等の適当な無水溶媒で樹脂粒子を
よく洗浄した後、ガス導入口Ｂ−２−ｇから不活
性ガス（窒素、ヘリウム、アルゴンなど）を流入
させて（10分〜20分程度でよい）内容樹脂粒子の
乾燥を行ない、その後、メシチレンスルホニルニ
トロトリアゾリド（MSNT）またはイソプロピ
ルベンゼンスルホニルテトラゾリド（TPSTe）
等の縮合剤を溶かしたヌクレオチドブロツク（モ
ノマー、ダイマー、トリマー）の無水ピリジン溶
液を給排液管（Ａ−４）から吸入し（ピストン
（Ｂ−１−ｂ）を退行させることによる）、吸入し
て室温で放置（約30分〜１時間）することによつ
て、固定化ヌクレオシドの5′−水酸基と、ヌクレ
オチドブロツクのリン酸残基とを脱水縮合させる
ことができる。未反応5′−水酸基の不活性化（マスキング）未反応物の5′−水酸基の不活性化は、鎖長の短
いオリゴマーの混入を防ぎ、各サイクルの反応を
定量的に進行させるためであり、通常無水酢酸等
によるアセチル化によつて行なわれる。たとえば
１％ジメチルアデニンホスフエイト含有無水ピリ
ジン溶液と無水酢酸９：１溶液（ｖ／ｖ）（以下
１％DMAP／absPyと略す）を用いた場合、室
温で約５〜10分程度放置することで、未反応5′−
水酸基はアシル化されて、その後の縮合反応に対
して不活性化することができる。精製目的生成物の樹脂からの遊離及びトリチル基以
外の保護基の除去は、テトラメチルグアニジン−
ピリジン−２−アルドキシム（TMG−Oxime）
（Tetrahedron Lett、2727−2730（1978））、続い
て濃アンモニア水処理によつて行ない、その後、
80％酢酸で処理してトリチル基を除去し、DEAE
−セルロース（フアルマシア）クロマトグラフイ
ーまたはPermaphase AAX（デユポン）等を用
いた高速液体クロマトグラフイー（以下HPLCと
略す）で精製するか、あるいはトリチル基を除去
する前の混合物をセフアデツクスＧ−50（フアル
マシア）等により粗精製し、逆相カラムによる
HPLCで精製することにより得られたトリチル体
を80％酢酸等で処理し、更に逆相カラムにかけ単
離することによつて、行なうことができる。また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつ
ても精製可能である。この様にして得られたオリ
ゴヌクレオチドは、レイ・ウーらの塩基配列決定
法（Methods in Enzymology、65、Part1、620
−638（1980））、またはマクサム・ギルバート法
（Methods in Enzymology 65、Part1、499
（1980））により構造を確認することができる。操作マニユアル１操作上の注意 () 反応用器は常に垂直に保持して操作を行
なう。 () 試薬等の吸入を行なつた際は、必ず操作
ノブＢ−４−ｂを押して内容物の撹拌を行な
う。２ヌクレオチドの合成アミノメチルポリスチレン樹脂−ヌクレオシ
ド20mgを反応室（Ａ−１）に入れて給排気装置
Ｂと接続し、前処理（樹脂の膨潤）を行なつた
後、ステツプ１（脱トリチル）、ステツプ２（縮
合）、ステツプ３（マスキング）を一サイクルと
して、これを必要回数繰り返し行なうことによ
り、ヌクレオチド鎖を延長していく。前処理（樹脂の膨潤）ジクロロメタンをあらかじめ三角フラスコ３本
に取り、それぞれCH−１、CH−２、CH−３と
印としておく（ジクロロメタンはCH₂Cl₂と表
示）。 (イ) CH−３よりCH₂Cl₂を１ml吸入してから排出
する（以下この操作を洗浄と略す）。この操作
を２回行なう。 (ロ) CH−３よりCH₂Cl₂を１ml吸入して30分放置
し、排出する。ステツプ１（脱トリチル） (イ) ３％TCA含有CH₂Cl₂溶液（以下３％TCA／
CH₂Cl₂と略す）を吸入して１分間放置し、排
出する。 (ロ) CH−２のCH₂Cl₂より３回洗浄を行なう。 (ハ) ３％TCA／CH₂Cl₂で着色（橙〜黄色）が見
られなくなるまで(イ)、(ロ)の操作を繰り返し行な
う（ただし、１回目より後はTCA処理時間を10
秒とする）。 (ニ) CH−３のCH₂Cl₂で３回洗浄を行なう。ステツプ２（縮合）無水ピリジン（以下abs Pyと略す）を三角フ
ラスコ３本に取り、それぞれPy−１、Py−２、
Py−３と印し、ゴム栓でふたをしておく。 (イ) Py−１のabs Pyで３回洗浄を行なう。 (ロ) Py−２のabs Pyで３回洗浄を行なう。 (ハ) Py−３のabs Pyで３回洗浄を行なう。 (ニ) 窒素ボンベからのゴム管を接続口Ｂ−２−ｇ
に接続し、ニードルバルブＢ−２−ｅを開き、
300ml／分の流速で10分間通気する。 (ホ) abs Py0.3mlに溶かしたMSNT20mgと乾燥ヌ
クレオチド（モノマー20mg、ダイマー25mg、ト
リマー35mg）との溶液を吸入し、ゴムキヤツプ
Ａ−６をはめて室温で30分放置した後、排出す
る。 (ヘ) ステツプ２の(イ)、(ロ)、(ハ)を繰り返す。ステツプ３（マスキング） (イ) １％DMAP含有無水ピリジン溶液（１％
DMAP／absPy）と、無水酢酸（AC₂O）との
９対１溶液（ｖ／ｖ）を１ml吸入し、ゴムキヤ
ツプＡ−６を取りつけ、室温で５分間放置し、
排出する。 (ロ) ステツプ２の(イ)、(ロ)を繰り返す。 (ハ) CH−１のCH₂Cl₂で３回洗浄を行なう。 (ニ) CH−３のCH₂Cl₂で３回洗浄を行なう。実施例実施例１ DMT−dA−（Ｎ−Bz）−Suc−AP（バイオサー
チ）30mgを反応室（Ａ−１）に入れ、給排気装置
Ｂと接続し、操作マニユアルに従つてヌクレオチ
ドブロツク（AG、GC、GT、TGのダイマー）
を25mgずつ縮合させて、TG−GT−GC−AG−
Ａ−樹脂を合成した。反応終了後、樹脂を取り出
して乾燥させ、0.5Mピコリンアルドキシム−テ
トラメチルグアニジンのピリジン−水（９：１）
溶液300μを加えて、37℃で一夜放置した。次
に、濃アンモニア水（４ml）を加え、55℃で一夜
放置後、過を行なつて樹脂を除去し、液を水
に溶解し、エーテルで抽出を行なつた（脱保護）。
次に、セフアデツクスＧ−50を用いてゲル過
（溶出液は50ｍＭトリエチルアンモニウムバイカ
ーボネート、PH7.5）を行なつた。この際、各フ
ラクシヨンの260nｍの吸収を測定し、最初に溶
出したピークを集めて高速液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）を行ない、ついで８％酢酸２ml中で
室温10分間反応させて5′−水酸基体として目的と
する合成フグメントを分取した。なお、カラムは
μ Bonda−pak C18（逆相）を用いた。合成し
たオリゴヌクレオチドの塩基配列の確認は、レ
イ・ウーらの方法により行なつて、
TGGTGCAGAであることが確認できた（第４
図）。また、反応の１サイクルの平均収率は、い
ずれも90％以上であつた。実施例２ DMT−dG−（Ｎ−iBu）−Suc−Ap（バイオサ
ーチ）30mgを反応室（Ａ−１）に入れて給排気装
置Ｂと接続し、同様に操作マニユアルに従がつ
て、ヌクレオチドブロツク（CC、TC、CA、
TA、CA、AG、GA、AA、CG、TT、AG、
GGのダイマー）を25mgずつ縮合させて、GG−
AG−TT−CG−AA−GA−AG−CA−TA−
CA−TC−CC−Ｇ−樹脂を合成した。反応終了
後、樹脂を取り出して乾燥させ、0.5Mピコリン
アルドキシム−テトラメチルグアニジンのピリジ
ン−水（９：１）溶液300μを加えて、37℃で
一夜放置した。次に、濃アンモニア水（４ml）加
え、55℃で一夜放置後、過を行なつて樹脂を除
去し、液を水に溶解し、エーテルで抽出を行な
つた（脱保護）。次に、セフアデツクスＧ−50
を用いてゲル過（溶出液は50ｍＭトリエチルア
ンモニウムバイカーボネート、PH7.5）を行なつ
た。この際、各フラクシヨンの260nｍの吸収を
測定し、最初に溶出したピークを集めて高速液体
クロマトグラフイー（HPLC）を行ない、ついで
８％酢酸２ml中で室温10分間反応させて5′−水酸
基体として目的とする合成フラグメントを分取し
た。なお、カラムはμ Bondapak C18（逆相）
を用いた。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配
列の確認は、マクサム・ギルバート法により行な
つて、
GGAGTTCGAAGAAGCATACATCCCGであ
ることを確認できた（第５図）。なお、5′−末端
のＧは検出することができない。また、反応の１
サイクルの平均収率は、いずれも90％以上であつ
た。 BACKGROUND OF THE INVENTION TECHNICAL FIELD The present invention relates to a device for synthesizing nucleic acids by solid phase methods, ie reactions on solid support particles. More specifically, the present invention relates to a nucleic acid synthesizer that allows easy quantitative suction of liquid phase material and suction of stirring gas from the lower part of the reaction chamber. Prior art From the time chemically synthesized oligonucleotides began to be used for genetic manipulation, which forms the technical basis of genetic engineering, to the present day, genetic manipulation has made remarkable progress, and chemically synthesized oligonucleotides have played a major role in this process. I can say that. Oligonucleotide synthesis methods include the diester method (Science, 203 , 614 (1979)) and the triester method (Nucleic Acids Research, 8 , 2331 (1980), 8, 5193 (1980), 8 , 5491 (1980). )), phosphite method (Tetrahedrom Letters, 22 , 1859
(1981)) or solid phase method (Nature, 281 , 18
(1979), Biochemistry, 1980 , 6096 (1980)), liquid phase method, or method using enzymes (Nucleic method).
Acids Research, 8 , 5753 (1980)), etc.
Today, the triester method-solid phase method (Nucleic method)
Acids Research, 8 , 5507 (1980)) or phosphite method-solid phase method (J.Am.Chem.Soc, 103 ,
3185-3191 (1981)) is the most common and technically well-established method. Therefore, several models of fully automated DNA synthesis equipment using these methods have already been released for the purpose of saving labor, but in any case, the price and
There are still problems with portability, placement space, etc. On the other hand, in practice, the oligonucleotides required for a single genetic manipulation generally have a chain length of
There are several 15-mer to 25-mer primers, probes, linkers, etc., and the amount is about 0.5OD at most. Therefore, there has been a desire for an inexpensive and simple nucleic acid synthesizer that can synthesize oligonucleotides at any time for use in genetic manipulation and the like. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a series of steps necessary for the synthesis of oligonucleotides by a solid phase method (for example, inhalation of reagents, stirring, reaction (condensation, deprotection, masking, etc.), discharge, and removal of contents. The present invention provides a nucleic acid synthesizer that enables manual operations such as washing, drying, etc. That is, the nucleic acid synthesizer for synthesizing nucleic acids by reaction on solid support particles according to the present invention comprises the following members A and B that are detachably connected.
It is characterized by the following. (A) A reactor consisting of the following members (A-1) to (A-4). (A-1) a reaction chamber consisting of a cylinder having a volume sufficient to accommodate the solid support particles and carry out the reaction; (A-2) a downward extension of the reaction chamber (A-1); (A-3) a mounting seat for mounting the filter for retaining solid support particles, which has a smaller inner diameter than the lower part of the reaction chamber (A-1); Solid support particle retention filter, (A-4) Further mounting seat (A-4) of the reaction chamber (A-1)
2) The reaction chamber (A-
1) a liquid supply/drainage pipe for supplying and discharging the liquid phase material involved in the reaction; (B) a supply/exhaust device consisting of the following members (B-1) to (B-4); (B-1) A cylinder (B-1-
a) and a piston (B-1-b) with a piston rod provided therein; (B-2) a piston as an extension of the piston rod of the piston (B-1-b); Drive rod member (B-3) The rod member (B-2) is connected to the piston (B-1
-b) a spring member disposed to urge the rod member (B-4) to retract; A stopping mechanism. However, this retraction mechanism includes a protrusion (B-2-) provided on the rod member (B-2).
a) and a stop device (B-4-
a), and the protrusion (B-2-a) and the stop mechanism (B-4-a) allow the rod member (B-2) to further regress from the above-mentioned stop position, and prevent further regress. It is configured to allow return to the above-mentioned stop position again later. Effects As described above, the present invention relates to a manually operable nucleic acid synthesizer, and if oligonucleotides are synthesized using the nucleic acid synthesizer of the present invention according to the operating manual, it will be easier for those with experience in organic synthesis. Even if it is not, the desired oligonucleotide can be obtained reliably and in high yield through simple operations. Furthermore, the nucleic acid synthesizer of the present invention solves the problems of conventional automated nucleic acid synthesizers in terms of cost, portability, installation space, etc. Therefore, according to the present invention, it is possible to synthesize oligonucleotides commonly used in the field of genetic engineering, such as primers, probes, and linkers, without using expensive automated nucleic acid synthesis equipment.
It is believed that this will greatly contribute to the future use of synthetic oligonucleotides in genetic engineering. One of the features of the nucleic acid synthesizer of the present invention from the viewpoint of its components is that liquid phase materials such as reactants and solvents required for solid phase synthesis are sucked into the reaction chamber from the lower part of the reaction chamber using the so-called pipette principle. Cylinder for /
The piston device is constructed such that the piston can be retracted in two stages. That is,
According to such a suction device, a predetermined amount of liquid phase material is sucked in the first stage of retraction of the piston, and air (or inert gas) is sucked in as the piston retracts in the second stage, and the air is solidified with the bubbles. The phase reaction system can be stirred and both operations can be carried out very easily. Specific Description of the Invention Nucleic Acid Synthesizer Overview of the Synthesizer The nucleic acid synthesizer according to the present invention is a device used to synthesize nucleic acids by reaction on solid support resin particles, that is, by a solid phase method. And,
Said members A-1 to A-4 and B-1 to B-4
It consists of The movable parts of the device of the present invention are:
This is mainly the air supply/exhaust system B, and although it is of course possible to drive this part electrically or perform synthetic operations under computer control, it is also possible to operate this part manually by the experimenter using the device of the present invention. It is the most preferable to do so. A specific example of a synthesizer according to the present invention is one in which a reactor shown in a side sectional view in FIG. 1 and an air supply/exhaust device shown in a side sectional view in FIG. 2 are connected. Reaction Chamber (A-1) As shown in the side cross section of FIG. 1, the reaction chamber (A-1) accommodates solid support resin particles for solid-phase synthesis to carry out the reaction. Consists of a cylinder with sufficient volume. Here, a "cylindrical cylinder" is one whose cross section is substantially circular and whose length is sufficiently larger than its diameter (or equivalent diameter if the cross section is not a perfect circle) (in particular, a cylinder whose length is at least equal to the diameter). means something that is). In addition, the shape or size of the cross section does not have to be the same in the length direction,
It may have a protrusion inside if necessary. The upper part of the reaction chamber (A-1) is provided with a means for removably connecting the reaction chamber to the air supply/exhaust system B (details will be described later), such as a male thread (A-5) (first
(Fig.) is constructed. On the other hand, at the bottom of the reaction chamber (A-1) is a filter mounting seat (A-2) with a diameter smaller than the inner diameter of the reaction chamber cylinder.
(details later). The reaction chamber may be made of any material as long as it is resistant to organic solvents, and suitable materials include stainless steel, Teflon, and glass. Glass is preferable because the state of the reaction and the state of the resin can be easily confirmed. especially,
When the reaction chamber (A-1) is transparent, it is convenient because the coloring of the solution (orange to yellow) can be used as an indicator when detritylating nucleotides and the like. Furthermore, it is more preferable to coat the inner wall of the reactor with silicone to prevent the resin used in the nucleotide condensation reaction from adhering to the inner wall of the reactor. Note that it is usually sufficient for the inner diameter of the cylinder to be about 10 mm. Filter mounting seat (A-2) The mounting seat (A-2) for mounting the solid support resin particle holding filter (details will be described later) forms a downward extension of the reaction chamber (A-1), and This member has a smaller diameter than the lower part of the reaction chamber (A-1). Here, "the inner diameter is smaller than the lower part of the reaction chamber (A-1)" means that the location where this filter is installed is this filter mounting seat (A-1).
-2) is connected to the reaction chamber (A-
This means that the inner diameter should be smaller than the inner diameter of 1). Therefore, it is not excluded that there is a part with a smaller diameter above the reaction chamber (A-1), and the inner diameter of this filter mounting seat (A-2) as shown in Fig. 1 is not excluded. This includes a case where the diameter decreases continuously toward the bottom and a case where the diameter of the filter mounting seat (A-2) increases below the filter mounting location. A specific example of the filter mounting seat (A-2) is funnel-shaped as shown in the figure. The one shown has a relatively small vertical dimension compared to its diameter, but
Of course, it may be in the shape of a funnel that is longer vertically than the one shown. Further, the inner diameter of the funnel may be continuously reduced (downward), but the inner diameter may be reduced in stages. Filter (A-3) The filter (A-3) may be of any shape, material, or other material as long as it supports the solid support resin particles for solid phase synthesis and allows the passage of the liquid phase material. It can be. The most typical filter is a so-called glass filter, which has a multilayer structure. Ceramics can also be considered as filter members. The degree of opening of the filter is preferably about 40 to 50 microns (about G-2 standard glass filter) to prevent the support resin particles from escaping. Another example of a filter is glass wool. The filter (A-3) is attached to the mounting seat (A-2), but "attached" here includes both cases where it is removable from the mounting seat and cases where it is not removable. shall be taken as a thing. If it is removable, consideration should be given to how to attach it so that it is not pushed upward by the liquid phase material for synthesis reaction that enters from below. Liquid supply/drainage pipe (A-4) The liquid supply/drainage port exists as an extension of the reaction chamber (A-1) further downward from the mounting seat (A-2). The opening of the liquid supply/drainage pipe (A-4) can be sealed with a rubber cap (A-6). The reactors (A-1) to (A-4) are based on the prior invention of the present inventors (patent application filed on December 19, 1988). Air supply/exhaust system frame (B-0) The nucleic acid synthesizer of the present invention consists of the above-mentioned reactor A and air supply/exhaust system B. Each member of the air supply/exhaust system is assembled into a frame (B-0) as shown in a side sectional view in FIG. It is preferable to provide it in B-0). In the illustrated example, the frame (B-0) is made of metal,
Although it is integrally formed of synthetic resin or the like, it goes without saying that it may have a structure that can be divided as appropriate to accommodate or remove members therein. At the lower end of the frame (B-0) (Fig. 2),
A male threaded ring (B-0-a) is provided for engaging the male threaded portion (A-5) on the upper part of the reaction chamber to connect the reaction chamber to the lower part of the frame. The reaction chamber (A-1) is connected to the frame (B-0) by attaching a gasket (B-0 -c), and then bring the upper part of the reaction chamber (A-5) into contact with this gasket (B-0-c) and screw it with the male screw ring (B-0-a). do it. FIG. 3 is an explanatory diagram showing the appearance of an example of a nucleic acid synthesizer, particularly a frame, according to the present invention. Positive and negative pressure generation device (B-1) The positive and negative pressure generation device (B-1) is connected to the reaction chamber (A
-1) communicating with the cylinder (B-1-a) and the piston with a piston rod installed inside the cylinder (B-1-a)
-1-b). The length of the cylinder (B-1-a) is such that when the piston (B-1-b) retracts (that is, moves upward in the case of Fig. 2), a predetermined displacement, that is, a predetermined amount of liquid is produced. It must be sufficient to generate a negative pressure to draw in the phase material and also to draw in air. Inner diameter 10 as above
For a reaction chamber of about mm size, a cylinder size of about 10 mm in inner diameter x 30 mm in length is sufficient. A piston rod (B-1-c) is attached to the piston, and this leads to a piston driving rod member (B-2) as an extension thereof. Piston drive housing (B-5) The piston rod (B-1-c) is connected to the cylinder (B-5).
-1-a) passes through a through hole (B-0-b) provided in the frame and extends upward to become a piston driving rod member (B-2). The piston driving rod member (B-2), together with its biasing spring member (B-3) (details will be described later), is attached to a housing (B-0) provided in the frame (B-0).
-5). Therefore, the housing (B-5) is connected to the thin cylinder (B-1-a) via the through-hole (B-0-d) of the frame. The housing (B-5) is the cylinder (B-1
- It is usually cylindrical and concentric with a). The piston rod (B-1-c) and the rod member (B-2) as an extension thereof may be solid, but a drying or reaction atmosphere is supplied from the outside into the reaction chamber (A-1). gas (e.g. nitrogen gas)
A through hole (B-2-h) is made in the core to supply
It is preferable to provide In that case, a suitable valve device such as a needle valve (B-2-e) and its cover (B-2-f) and a gas source are provided to disconnect the reaction chamber (A-1) from the outside world. It is preferable to provide a joint (B-2-g). Also,
The rod member (B-2) and eventually the piston (B-1-
c) In order to know the regression amount of , from outside the synthesizer,
Piston rod (B-1-c) or rod member (B-
2) Numbers, symbols or scales on the side (B-1-
d), which can be seen through a peephole (B-0-e) (FIG. 3) provided in the frame (B-0). Spring member (B-3) Inside the housing (B-5) is a rod member (B-
2) is housed in a spring member disposed to urge the piston (B-1-b) to retract. "Arranged to urge the piston to retract" means, for example, that one end of the coil spring member (B-3) is locked to the rod member (B-2) and the other end is locked to a fixed point on the frame. Then, the rod member (B-2) is
This means that it is caused to regress (upward in FIG. 2). The specific example shown in FIG. 2 is a typical example, in which the bar member (B-2) is caused to retract by the repulsive force of the stored coil spring. In order to lock the spring member to the rod member in order to retract the piston, it is necessary to provide an appropriate spring locking device on the rod member, and a typical spring locking device receives a coil spring and transmits the pressing force. It is a spring seat. The spring seat may be provided on the bar member itself, but as shown in the specific example in Fig. 2, the spring seat may be provided on the bar member (B-2).
It is preferable that the sleeve (B-2-b) is fitted into the sleeve (B-2-b) through a screw (B-2-c) and provided in the shape of a disk (B-2-a). If you do this, you can attach the sleeve (B-2-b) to the knob (B-2-b) outside the frame.
d) can be rotated to raise or lower the position of the spring seat (B-2-c), thereby adjusting the amount of piston retraction by the retraction mechanism (B-4) (details will be described later). . In addition, the sleeve (B
-2-b) on the disk (B-2-a) is the rod member (B-2-b)
-2), such a disc (B-2-a) is also referred to as a "protrusion provided on the rod member (B-2)" in the present invention. . Restriction/retraction mechanism (B-4) Stops the retraction of the bar member (B-2) biased by the spring member (B-3) at a predetermined position to ensure a predetermined amount of air supply, and The retraction mechanism (B-4) that allows further retraction from the position first includes a projection (B-2-a) provided on the rod member (B-2) and a stop device (B-2) that engages with the projection (B-2-a). 4-a). Here, the member (B-2-a) is a protrusion in that it engages with the stop device (B-4), but if it receives a coil spring, it is a disc, and the sleeve (B-2-a) is a projection. -2-
As mentioned above, it may be indirectly provided on the rod member (B-2) via the rod member (B-2). The stop mechanism (B-4-a) has a protrusion (B-2-
In relation to (a), the bar member is configured to allow further regression from the above-mentioned stop position, and to allow return to the above-mentioned stop position again after this further regression. One specific example of a stopping mechanism with such a configuration is:
This is a mechanism having a one-way locking pawl (B-4-a), as shown in a side sectional view in FIG.
That is, the locking claw (B-4-a) is connected to the protrusion (B-4-a).
2-a) perpendicularly to the locus drawn during movement, in other words, the housing (B- 5), and the top of the locking pawl is inserted into the hole provided perpendicularly to the side wall of the housing (B-
5) It is configured to be pressed by a spring mechanism (details will be described later) so as to protrude inward. The locking pawl is made of a rod-shaped member with a wedge-shaped top, and the top of the locking claw is such that the protrusion (B-2-a) of the rod member (B-2) is connected to the spring (B-3).
The lower part (the lower part in the positional relationship shown in FIG. 2) is horizontal so that the locking pawl stops the rod member (B-2) from regressing when it is pressed upward by the locking claw.
Push the locking pawl into the locking pawl hole when the projection (B-2-a) tilts upward and returns to the stop position (moves downward) from the position where it has further regressed from the stop position. It is constructed in such a way that a component force like this works. According to the present invention, the locking pawl (B-4-a) is connected to the rod member (B-2) and thus to the piston (B-1-
b) It must be possible to temporarily stop the regression and then release the stopped state, and it is desirable that this operation can be performed manually. Therefore, the locking pawl (B-4-a) must be able to be operated from outside the frame (B-0). The one shown in FIG.
A) is engaged with the operating knob (B-4-b) via a pinion (B-4-c) in a so-called "rack and pinion" relationship. Operation knob (B-4
-b) is pressed out of the frame (B-0) by a spring (B-4-d). In such a configuration, when the operating knob (B-4-b) is pushed in, the locking claw (B-4-a) is retracted and engages with the rod member protrusion (B-2-a). is released, and further retraction of the bar member is achieved. after that,
When the rod member (B-2) is pushed into the frame (B-0), the locking claw (B-2) is engaged by the protrusion (B-2-a).
4-a) is pushed in (at that time, the operation knob (B-
4-b) will also be drawn in), the protrusion (B-
2-a) will get over the locking claw (B-4-a). In the illustrated example, the operation knob (B-4-b) is connected to the locking pawl (B-4-c) via the pinion (B-4-c).
-4-a), and by pushing the knob, the locking claw (B-4-a) and the protrusion (B-2-
Since the engagement relationship with a) can be canceled,
This is convenient for experimental operations. In order to achieve the intended purpose by pushing in the operating knob in this way, it is necessary to close the gap between the operating knob and the locking pawl without using the "rack and pinion" mechanism shown in the figure. It will be apparent to those skilled in the art that lever mechanisms, "pulley and string" mechanisms, and other suitable mechanisms may be employed. The operating knob and the locking pawl do not need to move in opposite directions (that is, when the operating knob is pushed to the right, the locking pawl retracts to the left) as described above. Therefore,
The proximal side of the locking pawl can be extended so that this extension can be used as an operating knob.
A locking claw/operation knob integral part that passes through the frame (B-0) so that the locking claw side at one end faces into the housing (B-5) and the operating knob side at the other end faces outside the frame (B-0). A spring mechanism for pressing the top of the locking pawl so that it always protrudes into the housing (B-5) will be obvious to those skilled in the art. The stop mechanism shown has a protrusion (B-2) on the stop mechanism side.
-a) It moves to release the engagement relationship at the stop position. However, in the present invention, "the protrusion (B-2-a) and the stop mechanism (B-4-a)"
is configured to allow the rod member (B-2) to further retreat from the above-mentioned stopping position, and to allow the rod member (B-2) to return to the above-mentioned stopping position again after this further regression. Restriction mechanism (B-4)
, the protrusion (B-2-a) side is the locking claw (B-4-
This also includes the case where the device moves to release the engagement relationship with a). One specific example of such a retraction mechanism (B-4) has a locking pawl fixed, and one side is made up of a disc of a protrusion (B-2-a), and this locking claw is attached to the periphery of the disk. It is provided with a recessed part that is not locked by a claw. In such a configuration, the locking claw (B-4-a) and the disc-shaped projection (B-2-a) are engaged in a steady mutual relationship, and the projection (B-2-a) is stopped. However, if the rod member (B-2) is rotated at a certain rotation angle, the part that comes into contact with the locking pawl becomes a recess provided in the disc protrusion, and further regression of the rod member occurs. Permissible. It will be obvious to those skilled in the art that returning to the rest position after this further regression can be accomplished by doing the opposite. In short, the restraining mechanism (B-4) prevents movement of a certain member in a predetermined direction, but allows movement in the opposite direction, and can release the above-mentioned prevention of movement in the predetermined direction as necessary. Something with functions like
It is. Therefore, in addition to the specific examples described above, ratchet devices with release mechanisms are generally available. Synthesis of Nucleic Acid The synthesis of oligonucleotides carried out using the nucleic acid synthesizer of the present invention is as follows.
In addition, the following is about a preferable specific example. Overview of Nucleic Acid Synthesis The present invention involves immobilizing nucleosides on particles of various insoluble solid supports (hereinafter referred to as resins) such as aminomethyl polystyrene, silica gel, or polyacrylic morpholide, and sequentially elongating nucleotide chains. This is a nucleic acid synthesizer that uses a solid phase synthesis method, and the phosphodiester method, phosphotriester method, and phosphite method are applicable, but preferably the phosphotriester method using polystyrene resin-solid phase method is used. . That is, the well-known method of condensing a polystyrene resin having an amino group with a succinic acid derivative of a nucleoside (Nucleic Acids Res, 8 , 5473)
-5489 (1980)) (each having adenine, cytosine, guanine, thymine, or uracil as the base) or commercially available nucleoside resins (DMT
−dA−(N−Bz)−Suc−AP, DMT−dC(N−
Bz) −Suc−AP, DMT−dG−(N−iBu)−Suc
-AP, DMT-T-Suc-AP. (Both manufactured by Biosearch) etc. are placed in the reaction chamber (A-1), this reactor A is connected to the air supply/exhaust device B, and a suitable solvent such as dichloromethane is inhaled in advance and left for about 30 minutes. , carrying out swelling of the content resin,
Then, by sequentially repeating the steps shown below,
The target oligonucleotide is synthesized. Detritylation To remove the dimethoxytrityl group, which is commonly used as a protecting group for the 5'-hydroxyl group, benzenesulfonic acid, ZnBr ₂ (Nucleic Acids Res, 10 ,
1755-1769 (1982)), trichloroacetate (hereinafter abbreviated as TCA), and the like. In this case, color development (orange to yellow) due to liberated trityl groups
Since detritylation can be confirmed with , the trityl group can be removed by inhaling, stirring, and discharging the detritylation agent until no color develops. Condensation After thoroughly washing the resin particles with a suitable anhydrous solvent such as anhydrous pyridine, inert gas (nitrogen, helium, argon, etc.) is introduced from the gas inlet B-2-g (for about 10 to 20 minutes). ) The content resin particles are dried and then mesitylenesulfonylnitrotriazolide (MSNT) or isopropylbenzenesulfonyltetrazolide (TPSTe)
Anhydrous pyridine solution of nucleotide block (monomer, dimer, trimer) in which condensing agent such as By leaving the immobilized nucleoside at room temperature for approximately 30 minutes to 1 hour, the 5'-hydroxyl group of the immobilized nucleoside and the phosphoric acid residue of the nucleotide block can undergo dehydration condensation. Inactivation of unreacted 5'-hydroxyl groups (masking) Inactivation of the 5'-hydroxyl groups of unreacted substances is to prevent contamination of short-chain oligomers and to allow the reaction of each cycle to proceed quantitatively. , usually carried out by acetylation with acetic anhydride or the like. For example, when using an anhydrous pyridine solution containing 1% dimethyladenine phosphate and a 9:1 solution (v/v) of acetic anhydride (hereinafter abbreviated as 1% DMAP/absPy), it is possible to leave it at room temperature for about 5 to 10 minutes. , unreacted 5′−
Hydroxyl groups can be acylated to inactivate them against subsequent condensation reactions. Purification Release of the target product from the resin and removal of protecting groups other than the trityl group are performed using tetramethylguanidine-
Pyridine-2-aldoxime (TMG-Oxime)
(Tetrahedron Lett, 2727-2730 (1978)), followed by concentrated ammonia water treatment;
Trityl groups were removed by treatment with 80% acetic acid and DEAE
- Purify by cellulose (Pharmacia) chromatography or high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC) using Permaphase AAX (DuPont), or purify the mixture before removing the trityl group using Cephadex G-50 (Pharmacia). ), etc., and then purified using a reversed phase column.
This can be carried out by treating the trityl compound obtained by purification with HPLC with 80% acetic acid, etc., and then applying it to a reverse phase column for isolation. It can also be purified by polyacrylamide gel electrophoresis. The oligonucleotides obtained in this way were subjected to the base sequencing method of Lei Wu et al. (Methods in Enzymology, 65 , Part 1, 620).
−638 (1980)) or the Maxam-Gilbert method (Methods in Enzymology 65 , Part 1, 499)
(1980)), the structure can be confirmed. Operation Manual 1 Precautions for Operation () Always hold the reaction vessel vertically during operation. () When inhaling reagents, etc., be sure to press operation knob B-4-b to stir the contents. 2 Synthesis of nucleotides 20 mg of aminomethyl polystyrene resin-nucleoside is placed in the reaction chamber (A-1) and connected to air supply/exhaust device B. After pretreatment (swelling of the resin), step 1 (detritylation), The nucleotide chain is extended by repeating step 2 (condensation) and step 3 (masking) as many times as necessary. Pretreatment (resin swelling) Dichloromethane is placed in three Erlenmeyer flasks and marked as CH-1, CH-2, and CH-3 (dichloromethane is indicated as CH ₂ Cl ₂ ). (a) Inhale 1 ml of CH ₂ Cl ₂ from CH-3 and then discharge it (hereinafter this operation will be abbreviated as cleaning). Perform this operation twice. (b) Inhale 1 ml of CH ₂ Cl ₂ from CH-3, leave it for 30 minutes, and then expel it. Step 1 (Detritylation) (a) CH ₂ Cl ₂ solution containing 3% TCA (hereinafter referred to as 3% TCA/
(abbreviated as CH ₂ Cl ₂ ), leave it for 1 minute, and exhale. (b) Wash three times with CH-2 CH ₂ Cl ₂ . (c) Repeat operations (a) and (b) with 3% TCA/CH ₂ Cl ₂ until no coloring (orange to yellow) is seen (however, after the first time, the TCA treatment time is 10
seconds). (d) Wash three times with CH-3 CH ₂ Cl ₂ . Step 2 (Condensation) Take anhydrous pyridine (hereinafter abbreviated as abs Py) into three Erlenmeyer flasks, and add Py-1, Py-2, and
Mark Py-3 and cover with a rubber stopper. (b) Wash three times with Py-1 abs Py. (b) Wash three times with Py-2 abs Py. (c) Wash three times with Py-3 abs Py. (d) Connect the rubber tube from the nitrogen cylinder to port B-2-g.
Connect to, open needle valve B-2-e,
Aerate for 10 minutes at a flow rate of 300 ml/min. (e) Inhale a solution of 20 mg of MSNT dissolved in 0.3 ml of abs Py and dry nucleotides (20 mg of monomer, 25 mg of dimer, 35 mg of trimer), put on rubber cap A-6, leave at room temperature for 30 minutes, and then exhale. (F) Repeat Step 2 (A), (B), and (C). Step 3 (Masking) (a) Anhydrous pyridine solution containing 1% DMAP (1%
Inhale 1 ml of a 9:1 solution (v/v) of DMAP/absPy) and acetic anhydride (AC ₂ O), attach rubber cap A-6, and leave at room temperature for 5 minutes.
Discharge. (b) Repeat step 2 (a) and (b). (c) Wash three times with CH ₂ Cl ₂ of CH-1. (d) Wash three times with CH-3 CH ₂ Cl ₂ . Examples Example 1 30 mg of DMT-dA-(N-Bz)-Suc-AP (Biosearch) was placed in the reaction chamber (A-1), connected to the air supply/exhaust system B, and the nucleotide block (BioSearch) was added according to the operating manual. AG, GC, GT, TG dimers)
By condensing 25 mg each, TG-GT-GC-AG-
A-resin was synthesized. After the reaction, the resin was taken out, dried, and mixed with 0.5M picolinaldoxime-tetramethylguanidine pyridine-water (9:1).
300μ of the solution was added and left at 37°C overnight. Next, concentrated aqueous ammonia (4 ml) was added, and after standing at 55°C overnight, the resin was removed by filtration, the liquid was dissolved in water, and extracted with ether (deprotection).
Next, gel filtration was performed using Sephadex G-50 (eluent: 50 mM triethylammonium bicarbonate, pH 7.5). At this time, the absorption at 260 nm of each fraction was measured, and the first eluted peak was collected and subjected to high performance liquid chromatography (HPLC).Then, the 5'-hydroxyl base was reacted in 2 ml of 8% acetic acid at room temperature for 10 minutes. The desired synthetic fragment was isolated. The column used was μ Bonda-pak C18 (reverse phase). The base sequence of the synthesized oligonucleotide was confirmed using the method of Lei Wu et al.
It was confirmed that it was TGGTGCAGA (4th
figure). Moreover, the average yield of one cycle of the reaction was 90% or more in all cases. Example 2 30 mg of DMT-dG-(N-iBu)-Suc-Ap (Biosearch) was placed in the reaction chamber (A-1), connected to air supply/exhaust device B, and nucleotides were added in the same manner according to the operation manual. Block (CC, TC, CA,
TA, CA, AG, GA, AA, CG, TT, AG,
By condensing 25 mg of GG dimer), GG
AG−TT−CG−AA−GA−AG−CA−TA−
CA-TC-CC-G-resin was synthesized. After the reaction was completed, the resin was taken out and dried, 300 µ of a pyridine-water (9:1) solution of 0.5M picolinaldoxime-tetramethylguanidine was added, and the mixture was left at 37°C overnight. Next, concentrated aqueous ammonia (4 ml) was added, and after standing at 55°C overnight, the resin was removed by filtration, the liquid was dissolved in water, and extracted with ether (deprotection). Next, Cephadex G-50
Gel filtration was performed using (eluent: 50 mM triethylammonium bicarbonate, pH 7.5). At this time, the absorption at 260 nm of each fraction was measured, and the first eluted peak was collected and subjected to high performance liquid chromatography (HPLC).Then, the 5'-hydroxyl base was reacted in 2 ml of 8% acetic acid at room temperature for 10 minutes. The desired synthetic fragment was isolated. The column is μ Bondapak C18 (reversed phase).
was used. The base sequence of the synthesized oligonucleotide was confirmed by the Maxam-Gilbert method.
It was confirmed that it was GGAGTTCGAAGAAGCATACATCCCG (Figure 5). Note that G at the 5'-terminus cannot be detected. Also, reaction 1
The average yield of all cycles was 90% or more.

[Brief explanation of drawings]

第１〜２図は、それぞれ本発明核酸合成器の反
応器および給排気装置を示す側断面図である。第
３図は、本発明核酸合成器の給排気装置を示す説
明図である。第４図は、レイ・ウーらの塩基配列
決定法に従つて行なつたオートラジオグラムの模
式図である。第５図は、マクサム・ギルバート法
により行なつたオートラジオグラムの模写図であ
る。Ａ−１……反応室、Ａ−２……フイルター取付
座、Ａ−３……フイルター、Ａ−４……給排液
管、Ｂ−１……正負圧発生装置、Ｂ−１−ｂ……
ピストン、Ｂ−２……ピストン駆動棒部材、Ｂ−
２−ａ……突起、Ｂ−４−ａ……係止爪、Ｂ−４
−ｂ……操作ノブ。 1 and 2 are side sectional views showing a reactor and an air supply/exhaust device of the nucleic acid synthesizer of the present invention, respectively. FIG. 3 is an explanatory diagram showing the air supply and exhaust system of the nucleic acid synthesizer of the present invention. FIG. 4 is a schematic diagram of an autoradiogram performed according to the base sequencing method of Lei Wu et al. FIG. 5 is a reproduction of an autoradiogram obtained by the Maxam-Gilbert method. A-1...Reaction chamber, A-2...Filter mounting seat, A-3...Filter, A-4...Liquid supply/drainage pipe, B-1...Positive and negative pressure generator, B-1-b... …
Piston, B-2...Piston drive rod member, B-
2-a...Protrusion, B-4-a...Latching claw, B-4
-b...Operation knob.

Claims

[Claims] 1. The following members A and B detachably connected.
A nucleic acid synthesizer for synthesizing nucleic acids by reaction on solid support particles, characterized in that the device comprises: (A) A reactor consisting of the following members (A-1) to (A-4). (A-1) a reaction chamber consisting of a cylinder having a volume sufficient to accommodate the solid support particles and carry out the reaction; (A-2) a downward extension of the reaction chamber (A-1); (A-3) A mounting seat for attaching the solid support particle retention filter, which has no inner diameter than the lower part of the reaction chamber (A-1); (A-3) the solid support attached to the mounting seat (A-2); Support particle retention filter, (A-4) Further mounting seat (A-4) of the reaction chamber (A-1)
2), which forms a downward extension of the reaction chamber (A-
1) a liquid supply/drainage pipe for supplying and discharging the liquid phase material involved in the reaction; (B) a supply/exhaust device consisting of the following members (B-1) to (B-4); (B-1) A cylinder (B-1-
a) and a piston (B-1-b) with a piston rod provided therein; (B-2) a piston as an extension of the piston rod of the piston (B-1-b); Drive rod member (B-3) The rod member (B-2) is connected to the piston (B-1
-b) a spring member disposed to urge the rod member (B-4) to retract; A stopping mechanism. However, this retraction mechanism includes a protrusion (B-2-) provided on the rod member (B-2).
a) and a stop device (B-4-
a), and the protrusion (B-2-a) and the stop mechanism (B-4-a) allow the rod member (B-2) to further regress from the above-mentioned stop position, and prevent further regress. It is configured to allow return to the above-mentioned stop position again later. 2. The stopping mechanism (B-4-a) consists of a rod-shaped member with a wedge-shaped top (1) and its shaft is connected to the rod-shaped member (B-4-a).
2) by a spring so that the tip of the protrusion (B-2-a) is perpendicular to the trajectory drawn when it regresses, and (2) the top always protrudes across the trajectory. Although it is activated, it is arranged so that it can be manually retreated to a position where it does not cross the trajectory, and the shape of this wedge-shaped top is (1) a protrusion that regresses (B-2-a) (2) When the protrusion (B-2-a) returns after further regression, the protrusion (B-2-a) will stop the progress of the protrusion (B-2-a) to a position where it does not cross the trajectory. The nucleic acid synthesizer according to claim 1, which is adapted to be pushed back to ensure the return of the protrusion to its rest position. 3. A protrusion (B-2-a) is provided on a sleeve fitted to the rod member (B-2), and the relative position of the sleeve with respect to the rod member can be changed by a screw. 3. The nucleic acid synthesizer according to any one of claims 1 to 2, wherein the nucleic acid synthesizer is of the same type. 4. Claims 1 to 3, wherein the piston rod and the rod member (B-2) as an extension thereof have a through hole in its core that communicates with the inside of the cylinder and the outside world of the synthesizer via the piston. The nucleic acid synthesizer according to any one of .