JPH0466877B2

JPH0466877B2 -

Info

Publication number: JPH0466877B2
Application number: JP25104883A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Myake; Takanori Oka
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-12-26
Filing date: 1983-12-26
Publication date: 1992-10-26
Also published as: JPS60136593A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景技術分野本発明は、固相法、すなわち固体支持体粒子上
での反応によつて、核酸を合成するための装置に
関する。さらに具体的には、本発明は、反応室の
下部からの液相材料の定量的吸引および撹拌用ガ
スの吸引を簡単に行なえるようにした核酸合成器
に関する。先行技術遺伝子工学の技術的基礎となる遺伝子操作に化
学合成オリゴヌクレオチドが使用され始めてから
今日まで、遺伝子操作の発展はめざましいものが
あり、それに伴なう化学合成オリゴヌクレオチド
の果たした役割は大きいものと言える。オリゴヌクレオチドの合成法には、ジエステル
法（Science、203、614（1979））、トリエステル法
（Nucleic Acids Research、８、2331（1980）、同
８、5193（1980）、同８、5491（1980））、ホスフア
イト法（Tetrahedrom Letters、22、1859
（1981））、あるいは固相法（Nature、281、18
（1979）、Biochemistry、1980、6096（1980））、液
相法、あるいは酵素を用いる方法（Nucleic
Acids Research、８、5753（1980））等があり、
今日ではトリエステル法−固相法（Nucleic
Acids Research、８、5507（1980））またはホス
フアイト法−固相法（J.Am.Chem.Soc、103、
3185−3191（1981））の組合せが最も一般的であつ
て、技術的にもかなり確立された方法となつてい
る。そこで、これらの方法を用い、省力化を目的
として完全に自動化されたDNA合成装置がすで
に数機種発売されているが、いずれにせよ価格、
持ち運び、配置スペースなどに問題が残されてい
る。一方、実際面においては、一回の遺伝子操作で
必要とされるオリゴヌクレオチドは、一般に鎖長
15マー（mer）から25マー（mer）程度のプライ
マー、プローブ、リンカーなど数体であり、量的
にも多くて0.5OD程度である。したがつて、遺伝
子操作などに用いられる程度のオリゴヌクレオチ
ドの合成を随時可能とした安価でかつ簡易な核酸
合成器が望まれていた。発明の概要要旨本発明は、固相法によるオリゴヌクレオチド類
の合成に必要な一連の工程（たとえば、試薬等の
吸入、撹拌、反応（縮合、脱保護基、マスキング
等）、排出および内容物の洗浄乾燥等）を手動に
より可能とした核酸合成器を提供するものであ
る。すなわち、本発明による固体支持体粒子上での
反応によつて核酸を合成するための核酸合成器
は、着脱自在に連結された下記の部材ＡおよびＢ
からなること、を特徴とするものである。 (A) 下記の部材（Ａ−１）〜（Ａ−４）からなる
反応器。 (A‐1) 該固体支持体粒子を収容して該反応を行
なわせるのに十分な容積を有する円筒からな
る反応室、 (A‐2) 反応室（Ａ−１）の下方への延長部をな
しかつ反応室（Ａ−１）の下部より内径の小
さい、該固体支持体粒子保持用フイルターを
取付けるための取付座、 (A‐3) 取付座（Ａ−２）に取付けられた、該固
体支持体粒子保持用フイルター、 (A‐4) 反応室（Ａ−１）のさらに取付座（Ａ−
２）下方への延長部をなす、反応室（Ａ−
１）へ該反応に関与する液相材料を出入させ
るための給排液管、 (B) 下記の部材（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）からなる
給排気装置。 (B‐1) 上記反応室（Ａ−１）の上部において該
反応室と連通すべきシリンダー（Ｂ−１−
ａ）とその内部に設けられたピストン棒付き
ピストン（Ｂ−１−ｂ）とからなる正負圧発
生装置、 (B‐2) ピストン（Ｂ−１−ｂ）のピストン棒の
延長としての、ピストン駆動用棒部材、 (B‐3) 棒部材（Ｂ−２）を、ピストン（Ｂ−１
−ｂ）を退行させるように賦勢すべく配設し
たバネ部材、 (B‐4) バネ部材（Ｂ−３）によつて賦勢される
棒部材（Ｂ−２）の退行を所定位置に停止さ
せる制退機構。たヾし、この制退機構は、棒
部材（Ｂ−２）に設けられた突起（Ｂ−２−
ａ）とこれと係合する停止装置（Ｂ−４−
ａ）とからなり、突起（Ｂ−２−ａ）と停止
機構（Ｂ−４−ａ）とは棒部材（Ｂ−２）の
上記停止位置からの更なる退行を許容ししか
も更なる退行の後に再び上記停止位置への復
帰を許容するよう構成されたものである。効果このように、本発明は手動操作の可能な核酸合
成器に関するものであるが、本発明の核酸合成器
によつて操作マニユアルに従つてオリゴヌクレオ
チドの合成を行えば、有機合成の経験者でなくと
も簡単な操作で確実にしかも高収率で所望のオリ
ゴヌクレチオドを得ることができる。また、本発
明核酸合成器は、従来の自動化された核酸合成装
置で問題とされている価格、持ち運び性または配
置スペース等の点で解決されたものである。従つ
て、本発明によれば高価な自動化された核酸合成
装置を使わなくとも、遺伝子工学の分野において
常用されるオリゴヌクレオチドであるプライマ
ー、プローブ、リンカー等の合成が可能であり、
今後合成オリゴヌクレオチドの遺伝子工学への利
用に大きく貢献するものと思われる。本発明核酸合成器をその構成要素の面からみた
場合の一つの特色は、反応室の下部から所謂ピペ
ツトの原理で固相合成に必要な反応体、溶媒等の
液相材料を反応室へ吸引するためのシリンダー／
ピストン装置がピストンの二段階退行可能のよう
に構成されているということである。すなわち、
このような吸引装置によれば、第一段階のピスト
ンの退行で所定量の液相材料を吸引し、第二段階
のピストンの退行で空気（または不活性ガス）を
吸引してその気泡で固相反応系を撹拌することが
でき、両操作を極めて容易に実行することができ
る。発明の具体的説明核酸合成器合成器の概要本発明による核酸合成器は、固体支持体樹脂粒
子上での反応によつて、すなわち固相法によつ
て、核酸を合成するのに使用する装置であつて、
前記の部材Ａ−１〜Ａ−４およびＢ−１〜Ｂ−４
からなるものである。本発明装置の可動部分は、
主として給排気装置Ｂであるが、この部分の駆動
は電動によりあるいは合成操作をコンピユーター
管理の下に行なうことも勿論可能であるけれど
も、実験者が手動でこれを操作することが本発明
装置を利用するうえで最も好ましい。本発明による合成器の一具体例は、第１図にそ
の側断面図で示した反応器と第２図の側断面図で
示した給排気装置とを連結してなるものである。反応室（Ａ−１）反応室（Ａ−１）は、第１図にその側断面を示
してあるように、固相合成用固体支持体樹脂粒子
を収容して該反応を行なわせるのに十分な容積を
有する円筒からなる。ここで「円筒」とは、断面
が実質的に円形であつて、直径（断面が真円でな
い場合は相当直径）に比べて長さが十分に大きい
もの（特に、長さが少なくとも直径と同一である
もの）を意味する。また、その断面の形状ないし
大きさは長さ方向に関して同一でなくてもよく、
必要に応じて内部に突起を有するものであつても
よい。反応室（Ａ−１）の上部には、反応室を給排気
装置Ｂ（詳細後記）と着脱自在に連結するための
手段、たとえば雄ネジの刻設（Ａ−５）（第１
図）、が構じられている。一方、反応室（Ａ−１）の下部には、反応室円
筒の内径より小径のフイルター取付座（Ａ−２）
が設けられている（詳細後記）。反応室部分の材質は有機溶媒に耐性のものであ
れば何如なるものでもよく、ステンレス鋼、テフ
ロン、ガラス等の材質が適当なものとして考えら
れる。反応の状態や樹脂の状態が容易に確認でき
るということからは、ガラスが好ましい。特に、
反応室（Ａ−１）が透明であると、ヌクレオチド
等の脱トリチル化を行なう際の指標として溶液の
着色（橙〜黄）を利用することができて便利であ
る。また、反応器の内壁をシリコンで被覆するこ
とによつてヌクレオチドの縮合反応に際して使用
する樹脂が付着しないようにすればさらに好まし
い。なお、円筒の内径としては通常10mm程度であ
れば十分である。フイルター取付座（Ａ−２）固体支持体樹脂粒子保持用フイルター（詳細後
記）を取付けるための取付座（Ａ−２）は、反応
室（Ａ−１）の下方への延長部分をなし、かつ反
応室（Ａ−１）の下部より直径の小さい部材であ
る。ここで「反応室（Ａ−１）の下部より内径の
小さい）ということは、このフイルターが取付け
られている当該個所がこのフイルター取付座（Ａ
−２）が接続されている個所での反応室（Ａ−
１）の内径より小さければよいということを意味
するものである。従つて、反応室（Ａ−１）の上
方にさらに小径の部分が存在している場合を排除
しないのであり、また第１図に示したもののよう
にこのフイルター取付座（Ａ−２）の内径が下方
に向つて連続的に減少する場合をもまたこのフイ
ルター取付座（Ａ−２）の当該フイルター取付個
所より下方で拡径されている場合をも、包含する
ものである。フイルター取付座（Ａ−２）の一具体例は、図
示のようなロート状のものである。図示のものは
直径に比べて上下方向の寸法が比較的小さいが、
図示のものよりも縦長のロート状であつても勿論
差支えない。また、ロートの内径は続連的に減少
（下方へ）していてもよいが、内径の減少は段階
的であつてもよい。フイルター（Ａ−３）フイルター（Ａ−３）は、固相合成法用の固体
支持体樹脂粒子を支承しかつ液相材料の通過を許
容する構造ものであれば任意の形状、素材その他
のものでありうる。最も典型的なフイルターは、所謂ガラスフイル
ターとして知られている過部構造のものであ
る。また、セラミツクもフイルター部材と考えら
れる。フイルターとしての開孔度は、支持体樹脂
粒子が逸出しないよう40〜50ミクロン程度（ガラ
スフイルターでいえばＧ−２規格品程度）である
ことが好ましい。フイルターの他の具体例は、グラスウールであ
る。フイルター（Ａ−３）は取付座（Ａ−２）に取
付けられているが、ここで「取付けられた」とい
うことは取付座から着脱可能である場合と着脱不
能の場合のいずれをも包含するものとする。着脱
可能である場合には、その下方より進入してくる
合成反応用液相材料によつて上方に押上げられな
いようにその取付け方に配慮すべきである。給排液管（Ａ−４）給排液口は、反応室（Ａ−１）のさらに取付座
（Ａ−２）の下方への延長部をなして存在する。給排液管（Ａ−４）の開口部は、ゴムキヤツプ
（Ａ−６）によつて封じることができる。なお、（Ａ−１）〜（Ａ−４）からなる反応器
は、本発明者らの先行発明（昭和58年12月19日特
許出願）にかゝるものである。給排気装置フレーム（Ｂ−０）本発明核酸合成器は上記反応器Ａと給排気装置
Ｂとからなるが、給排気装置の各部材は第２図に
その側断面図で示すようにフレーム（Ｂ−０）内
に設けることが好ましい。フレーム（Ｂ−０）は、図示の例では、金属、
合成樹脂等で一体に形成したものであるが、その
内部への部材の収容ないし取外しのために適宜分
割しうる構造であつてもよいことはいうまでもな
い。フレーム（Ｂ−０）の下端部（第２図）には、
前記反応室上部の雄ネジ部（Ａ−５）と係合して
反応室をフレーム下部に連結するための雄ネジ環
（Ｂ−０−ａ）が設けられている。フレーム（Ｂ−０）への反応室（Ａ−１）の連
結は、シリンダー（Ｂ−１−ａ）（詳細後記）と
連通するフレーム延長部（Ｂ−０−ｂ）にパツキ
ン（Ｂ−０−ｃ）を嵌装したうえ、このパツキン
（Ｂ−０−ｃ）に反応室（Ａ−５）の上部を当接
させてこれを雄ネジ環（Ｂ−０−ａ）によつて螺
着すればよい。第３図は、本発明による核酸合成器、特にフレ
ーム、の一例の外観を示す説明図である。正負圧発生装置（Ｂ−１）正負圧発生装置（Ｂ−１）は、前記反応室（Ａ
−１）と連通するシリンダー（Ｂ−１−ａ）とそ
の内部に設けられたピストン棒付きピストン（Ｂ
−１−ｂ）とからなる。シリンダー（Ｂ−１−ａ）の長さは、ピストン
（Ｂ−１−ｂ）が退行して（すなわち、第２図の
場合は上方へ移動して）所定の排気量、すなわち
所定量の液相材料を吸引し、さらに空気をも吸引
するための負圧を発生しうる量、が実現できるの
に十分なものでなければならない。前記の内径10
mm程度の反応室に対しては、シリンダーの大きさ
は内径10mm程度×長さ30mm程度で十分である。ピストンにはピストン棒（Ｂ−１−ｃ）が付属
しており、これはその延長としてのピストン駆動
用棒部材（Ｂ−２）へとつながる。ピストン駆動装置用ハウジング（Ｂ−５）ピストン棒（Ｂ−１−ｃ）は、シリンダー（Ｂ
−１−ａ）の上部でフレームに設けられた貫孔
（Ｂ−０−ｂ）を貫通して上部へ延びてピストン
駆動用棒部材（Ｂ−２）となる。ピストン駆動用棒部材（Ｂ−２）は、その賦勢
用バネ部材（Ｂ−３）（詳細後記）等と共に、フ
レーム（Ｂ−０）内に設けられたハウジング（Ｂ
−５）内に収容されている。従つて、ハウジング
（Ｂ−５）は、フレームの貫孔（Ｂ−０−ｄ）を
介してシンリンダー（Ｂ−１−ａ）と連結されて
いる。ハウジング（Ｂ−５）は、シリンダー（Ｂ−１
−ａ）と同心のシリンダー状のものであることが
ふつうである。ピストン棒（Ｂ−１−ｃ）およびその延長とし
ての棒部材（Ｂ−２）とは中実のものであつても
よいが、反応室（Ａ−１）内に外部から乾燥用あ
るいは反応雰囲気用のガス（たとえば窒素ガス）
を供給するため、その芯部に貫孔（Ｂ−２−ｈ）
を設けることが好ましい。その場合には、反応室
（Ａ−１）と外界との連通を断つべく適当な弁装
置たとえばニードル弁（Ｂ−２−ｅ）およびその
カバー（Ｂ−２−ｆ）、ならびにガス源との継手
（Ｂ−２−ｇ）を設けることが好ましい。また、
棒部材（Ｂ−２）、ひいてはピストン（Ｂ−１−
ｃ）、の退行量を本合成器外部から知るために、
ピストン棒（Ｂ−１−ｃ）ないし棒部材（Ｂ−
２）の側面に数字、記号ないし目盛り（Ｂ−１−
ｄ）を記して、これをフレーム（Ｂ−０）に設け
た覗き孔（Ｂ−０−ｅ）（第３図）から見られる
ようにすることもできる。バネ部材（Ｂ−３）ハウジング（Ｂ−５）内には、棒部材（Ｂ−
２）をピストン（Ｂ−１−ｂ）を退行させるよう
に賦勢すべく配設したバネ部材が収容されてい
る。「ピストンを退行させるように賦勢すべく配設
した」ということは、たとえばコイルバネ部材
（Ｂ−３）の一端を棒部材（Ｂ−２）に、他端を
フレーム上の固定点に係止させて、コイルバネの
反発力あるいは収縮力によつて棒部材（Ｂ−２）
を退行（第２図では上方）させるようにしたこと
を意味するものである。第２図の具体例はその典
型的なものであつて、蓄勢されたコイルバネの反
発力によつて、棒部材（Ｂ−２）を退行させるよ
うになつている。ピストンを退行させるべくバネ部材を棒部材に
係止させるためには、棒部材には適当なバネ係止
具を設ける必要があるが、その代表的なものはコ
イルバネを接受して押圧力を伝えるバネ座であ
る。バネ座は棒部材そのものに設けてもよいが、第
２図の具体例に示したように、棒部材（Ｂ−２）
にネジ（Ｂ−２−ｃ）を介して嵌装されたスリー
ブ（Ｂ−２−ｂ）に円板状（Ｂ−２−ａ）に設け
ることが好ましい。このようにすれば、スリーブ
（Ｂ−２−ｂ）をフレーム外のつまみ（Ｂ−２−
ｄ）により回転させて、バネ座（Ｂ−２−ｃ）の
位置を上下させることができ、それによつて制退
機構（Ｂ−４）（詳細後記）によるピストン退行
量を調節することができる。なお、スリーブ（Ｂ
−２−ｂ）上の円板（Ｂ−２−ａ）は棒部材（Ｂ
−２）と剛体的に連結されているであるから、こ
のような円板（Ｂ−２−ａ）をも本発明では「棒
部材（Ｂ−２）に設けられた突起」というものと
する。制退機構（Ｂ−４）バネ部材（Ｂ−３）によつて賦勢される棒部材
（Ｂ−２）の退行を所定位置に停止させて所定量
の給気量を保証し、しかもその位置から更なる退
行を許容する制退機構（Ｂ−４）は、先ず、棒部
材（Ｂ−２）に設けられた突起（Ｂ−２−ａ）と
これと係合する停止装置（Ｂ−４−ａ）とからな
るものである。ここで、部材（Ｂ−２−ａ）は停
止装置（Ｂ−４）と係合するという点では突起で
あるが、これがコイルバネを接受するものである
場合は円板であり、しかもスリーブ（Ｂ−２−
ｂ）を介して間接的に棒部材（Ｂ−２）に設けら
れたものであつてもよいことは前記した通りであ
る。停止機構（Ｂ−４−ａ）は、突起（Ｂ−２−
ａ）との関係において、棒部材の上記停止位置か
らの更なる退行を許容し、しかもこの更なる退行
の後に再び上記停止位置への復帰を許容するよう
に構成されている。そのような構成の停止機構の一つの具体例は、
第２図にその側断面図を示したような、一方向係
止爪（Ｂ−４−ａ）を有する機構のものである。
すなわち、係止爪（Ｂ−４−ａ）は、突起（Ｂ−
２−ａ）の先端が移動の際に描く軌跡に対して直
角に、換言すれば棒部材（Ｂ−２）に設けられた
突起（Ｂ−２−ａ）が褶動接触するハウジング
（Ｂ−５）の側壁に直角に設けられた孔内に出入
自在にかつ該係止爪の頂部がハウジング（Ｂ−
５）内に突出するようバネ機構（詳細後記）で押
圧されるように、構成されている。係止爪は楔形
頂部を持つ棒状材からなり、その頂部は、棒部材
（Ｂ−２）の突起（Ｂ−２−ａ）がバネ（Ｂ−３）
によつて上方に押圧されたときに該係止爪によつ
て棒部材（Ｂ−２）の退行を停止させるようにそ
の下部（第２図の位置関係での下部）が水平に、
上部に傾斜していて該突起（Ｂ−２−ａ）が上記
停止位置から更に退行した位置から再び該停止位
置へ戻る（下向きに移動）ときに該係止爪を係止
爪孔へ押込むような分力が働くように、構成され
ている。係止爪（Ｂ−４−ａ）は、本発明に従つて、棒
部材（Ｂ−２）、ひいてはピストン（Ｂ−１−
ｂ）、の退行を一旦停止させ、そののち停止状態
を解除するものでなければならず、またその操作
は手動で可能であることが望ましい。従つて、係
止爪（Ｂ−４−ａ）はフレーム（Ｂ−０）の外側
からそのような操作が可能なものでなければなら
ない。第２図に示したものはそのように配慮され
た係止爪の一具体例であつて、係止爪（Ｂ−４−
ａ）は操作ノブ（Ｂ−４−ｂ）との間にピニオン
（Ｂ−４−ｃ）を介して所謂「ラツクおよびピニ
オン」の関係で係合している。操作ノブ（Ｂ−４
−ｂ）はスプリング（Ｂ−４−ｄ）によつてフレ
ーム（Ｂ−０）外へと押圧されている。このよう
な構成において、操作ノブ（Ｂ−４−ｂ）を押込
めば、係止爪（Ｂ−４−ａ）は引込まれて、棒部
材突起（Ｂ−２−ａ）との係合関係が解除され
て、棒部材の更なる退行が実現される。その後、
棒部材（Ｂ−２）をフレーム（Ｂ−０）内に押込
めば、突起（Ｂ−２−ａ）によつて係止爪（Ｂ−
４−ａ）が押込まれて（その際、操作ノブ（Ｂ−
４−ｂ）も引込まれることになる）、突起（Ｂ−
２−ａ）は係止爪（Ｂ−４−ａ）を乗り越えるこ
とになる。操作ノブ（Ｂ−４−ｂ）は、図示の具体例で
は、ピニオン（Ｂ−４−ｃ）を介して係止爪（Ｂ
−４−ａ）と係合していて、該ノブを押込むこと
によつて係止爪（Ｂ−４−ａ）と突起（Ｂ−２−
ａ）との係合関係を解除することができるので、
実験操作上好都合である。このように操作ノブを
押込むことによつて所期の目的を達成するために
は、図示のような「ラツクおよびピニオン」の機
構によらなくても、操作ノブと係止爪との間をレ
バー機構、「滑車およびひも」機構その他合目的
的な機構を採用しうることは当業者にとつて自明
であろう。操作ノブと係止爪とは上記のように運動方向が
逆（すなわち、操作ノブを右方向へ押すと係止爪
が左方向へ引込む）である必要はない。従つて、
係止爪の基部側を延長して、この延長部を操作ノ
ブとして利用するように構成することができる。
一端の係止爪側がハウジング（Ｂ−５）内に臨
み、他端の操作ノブ側がフレーム（Ｂ−０）外に
臨むようにフレーム（Ｂ−０）を貫通する係止
爪／操作ノブ一体部品を係止爪頂部が常にハウジ
ング（Ｂ−５）内に突出するように押圧するバネ
機構は当業者にとつて自明であろう。図示の停止機構は、停止機構側が突起（Ｂ−２
−ａ）との停止位置での係合関係を解除すべく動
くという方式のものである。しかし、本発明で
「突起（Ｂ−２−ａ）と停止機構（Ｂ−４−ａ）
とは棒部材（Ｂ−２）の上記停止位置からの更な
る退行を許容ししかもこの更なる退行の後に再び
上記停止位置への復帰を許容するよう構成された
ものである」と定義される制退機構（Ｂ−４）
は、突起（Ｂ−２−ａ）側が係止爪（Ｂ−４−
ａ）との係合関係を解除すべく動くものである場
合をも包含するものである。このような制退機構
（Ｂ−４）の一具体例は、係止爪が固定されてお
り、一方突起（Ｂ−２−ａ）の円板からなつてい
て、その周辺部にこの係止爪によつて係止されな
い凹欠部を設けたものであるもの、である。この
ような構成において、係止爪（Ｂ−４−ａ）と円
板状突起（Ｂ−２−ａ）とは定常相互関係では係
合していて突起（Ｂ−２−ａ）は停止している
が、棒部材（Ｂ−２）をある回転角でもつて回転
させれば、係止爪と当接する部分が円板突起に設
けた凹欠部となつて、棒部材の更なる退行が許容
される。この更なる退行の後での停止位置への復
帰は、上記と逆のことを行なえばよいことは当業
者にとつて自明であろう。制退機構（Ｂ−４）は、要するに、ある部材の
所定方向への移動を阻止するが反対方向への移動
は許容し、しかも上記の所定方向への移動阻止を
必要に応じて解除しうるような機能を持つもの、
である。従つて、前記の諸具体例の外にも、解除
機構つきラチエツト装置が一般に利用可能であ
る。核酸の合成本発明の核酸合成器を使用して行なうオリゴヌ
クレオチドの合成は、下記の内容のものである。
なお、下記は好ましい具体例についてのそれであ
る。核酸合成の概要本発明は、アミノメチルポリスチレン、シリカ
ゲルまたはポリアクリルモルホリドなどの種々の
不溶性固体支持体（以下、樹脂で代表させる）粒
子に、ヌクレオシドを固定化し、順次ヌクレオチ
ド鎖の延長を行なう固相合成法を用いた核酸合成
器であり、ホスホジエステル法、ホスホトリエス
テル法、ホスフアイト法が適用可能であるが、望
ましくは、ポリスチレン樹脂を用いたホスホトリ
エステル法−固相法が用いられる。すなわち、アミノ基を有するポリスチレン樹脂
などをヌクレオシドのコハク酸誘導体とを縮合さ
せる周知の方法（Nucleic Acids Res、８、5473
−5489（1980））により合成された固定化ヌクレオ
シド類（それぞれ、塩基としてアデニン、シトシ
ン、グアニン、チミン、またはウラシルを有す
る）か、または市販のヌクレオシド樹脂（DMT
−dA−（Ｎ−Bz）−Suc−AP、DMT−dC（Ｎ−
Bz）−Suc−AP、DMT−dG−（Ｎ−iBu）−Suc
−AP、DMT−Ｔ−Suc−AP。いずれもバイオ
サーチ社製）等を反応室（Ａ−１）に入れ、この
反応器Ａを給排気装置Ｂと連結し、あらかじめジ
クロロメタン等の適当な溶媒を吸入し約30分程度
放置することにより、内容樹脂の膨潤を行ない、
その後、下記に示す工程を順次繰り返すことで、
目的とするオリゴヌクレオチドを合成していくも
のである。脱トリチル化 5′−水酸基の保護基として慣用されているジメ
トキシトリチル基の除去には、一般にベンゼンス
ルホン酸、ZnBr₂（Nucleic Acids Res、10、
1755−1769（1982））、トリククロロアセテート
（以下TCAと略す）等が使用可能である。この場
合、遊離されたトリチル基による発色（橙〜黄）
で脱トリチルが確認できるため、発色しなくなる
まで脱トリチル化剤の吸入、撹拌、排出を行なう
ことで、トリチル基の除去を行なうことができ
る。縮合無水ピリジン等の適当な無水溶媒で樹脂粒子を
よく洗浄した後、ガス導入口Ｂ−２−ｇから不活
性ガス（窒素、ヘリウム、アルゴンなど）を流入
させて（10分〜20分程度でよい）内容樹脂粒子の
乾燥を行ない、その後、メシチレンスルホニルニ
トロトリアゾリド（MSNT）またはイソプロピ
ルベンゼンスルホニルテトラゾリド（TPSTe）
等の縮合剤を溶かしたヌクレオチドブロツク（モ
ノマー、ダイマー、トリマー）の無水ピリジン溶
液を給排液管（Ａ−４）から吸入し（ピストン
（Ｂ−１−ｂ）を退行させることによる）、吸入し
て室温で放置（約30分〜１時間）することによつ
て、固定化ヌクレオシドの5′−水酸基と、ヌクレ
オチドブロツクのリン酸残基とを脱水縮合させる
ことができる。未反応5′−水酸基の不活性化（マスキング）未反応物の5′−水酸基の不活性化は、鎖長の短
いオリゴマーの混入を防ぎ、各サイクルの反応を
定量的に進行させるためであり、通常無水酢酸等
によるアセチル化によつて行なわれる。たとえば
１％ジメチルアデニンホスフエイト含有無水ピリ
ジン溶液と無水酢酸９：１溶液（ｖ／ｖ）（以下
１％DMAP／absPyと略す）を用いた場合、室
温で約５〜10分程度放置することで、未反応5′−
水酸基はアシル化されて、その後の縮合反応に対
して不活性化することができる。精製目的生成物の樹脂からの遊離及びトリチル基以
外の保護基の除去は、テトラメチルグアニジン−
ピリジン−２−アルドキシム（TMG−Oxime）
（Tetrahedron Lett、2727−2730（1978））、続い
て濃アンモニア水処理によつて行ない、その後、
80％酢酸で処理してトリチル基を除去し、DEAE
−セルロース（フアルマシア）クロマトグラフイ
ーまたはPermaphase AAX（デユポン）等を用
いた高速液体クロマトグラフイー（以下HPLCと
略す）で精製するか、あるいはトリチル基を除去
する前の混合物をセフアデツクスＧ−50（フアル
マシア）等により粗精製し、逆相カラムによる
HPLCで精製することにより得られたトリチル体
を80％酢酸等で処理し、更に逆相カラムにかけ単
離することによつて、行なうことができる。また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によつ
ても精製可能である。この様にして得られたオリ
ゴヌクレオチドは、レイ・ウーらの塩基配列決定
法（Methods in Enzymology、65、Part1、620
−638（1980））、またはマクサム・ギルバート法
（Methods in Enzymology 65、Part1、499
（1980））により構造を確認することができる。操作マニユアル１操作上の注意 () 反応用器は常に垂直に保持して操作を行
なう。 () 試薬等の吸入を行なつた際は、必ず操作
ノブＢ−４−ｂを押して内容物の撹拌を行な
う。２ヌクレオチドの合成アミノメチルポリスチレン樹脂−ヌクレオシ
ド20mgを反応室（Ａ−１）に入れて給排気装置
Ｂと接続し、前処理（樹脂の膨潤）を行なつた
後、ステツプ１（脱トリチル）、ステツプ２（縮
合）、ステツプ３（マスキング）を一サイクルと
して、これを必要回数繰り返し行なうことによ
り、ヌクレオチド鎖を延長していく。前処理（樹脂の膨潤）ジクロロメタンをあらかじめ三角フラスコ３本
に取り、それぞれCH−１、CH−２、CH−３と
印としておく（ジクロロメタンはCH₂Cl₂と表
示）。 (イ) CH−３よりCH₂Cl₂を１ml吸入してから排出
する（以下この操作を洗浄と略す）。この操作
を２回行なう。 (ロ) CH−３よりCH₂Cl₂を１ml吸入して30分放置
し、排出する。ステツプ１（脱トリチル） (イ) ３％TCA含有CH₂Cl₂溶液（以下３％TCA／
CH₂Cl₂と略す）を吸入して１分間放置し、排
出する。 (ロ) CH−２のCH₂Cl₂より３回洗浄を行なう。 (ハ) ３％TCA／CH₂Cl₂で着色（橙〜黄色）が見
られなくなるまで(イ)、(ロ)の操作を繰り返し行な
う（ただし、１回目より後はTCA処理時間を10
秒とする）。 (ニ) CH−３のCH₂Cl₂で３回洗浄を行なう。ステツプ２（縮合）無水ピリジン（以下abs Pyと略す）を三角フ
ラスコ３本に取り、それぞれPy−１、Py−２、
Py−３と印し、ゴム栓でふたをしておく。 (イ) Py−１のabs Pyで３回洗浄を行なう。 (ロ) Py−２のabs Pyで３回洗浄を行なう。 (ハ) Py−３のabs Pyで３回洗浄を行なう。 (ニ) 窒素ボンベからのゴム管を接続口Ｂ−２−ｇ
に接続し、ニードルバルブＢ−２−ｅを開き、
300ml／分の流速で10分間通気する。 (ホ) abs Py0.3mlに溶かしたMSNT20mgと乾燥ヌ
クレオチド（モノマー20mg、ダイマー25mg、ト
リマー35mg）との溶液を吸入し、ゴムキヤツプ
Ａ−６をはめて室温で30分放置した後、排出す
る。 (ヘ) ステツプ２の(イ)、(ロ)、(ハ)を繰り返す。ステツプ３（マスキング） (イ) １％DMAP含有無水ピリジン溶液（１％
DMAP／absPy）と、無水酢酸（AC₂O）との
９対１溶液（ｖ／ｖ）を１ml吸入し、ゴムキヤ
ツプＡ−６を取りつけ、室温で５分間放置し、
排出する。 (ロ) ステツプ２の(イ)、(ロ)を繰り返す。 (ハ) CH−１のCH₂Cl₂で３回洗浄を行なう。 (ニ) CH−３のCH₂Cl₂で３回洗浄を行なう。実施例実施例１ DMT−dA−（Ｎ−Bz）−Suc−AP（バイオサー
チ）30mgを反応室（Ａ−１）に入れ、給排気装置
Ｂと接続し、操作マニユアルに従つてヌクレオチ
ドブロツク（AG、GC、GT、TGのダイマー）
を25mgずつ縮合させて、TG−GT−GC−AG−
Ａ−樹脂を合成した。反応終了後、樹脂を取り出
して乾燥させ、0.5Mピコリンアルドキシム−テ
トラメチルグアニジンのピリジン−水（９：１）
溶液300μを加えて、37℃で一夜放置した。次
に、濃アンモニア水（４ml）を加え、55℃で一夜
放置後、過を行なつて樹脂を除去し、液を水
に溶解し、エーテルで抽出を行なつた（脱保護）。
次に、セフアデツクスＧ−50を用いてゲル過
（溶出液は50ｍＭトリエチルアンモニウムバイカ
ーボネート、PH7.5）を行なつた。この際、各フ
ラクシヨンの260nｍの吸収を測定し、最初に溶
出したピークを集めて高速液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）を行ない、ついで８％酢酸２ml中で
室温10分間反応させて5′−水酸基体として目的と
する合成フグメントを分取した。なお、カラムは
μ Bonda−pak C18（逆相）を用いた。合成し
たオリゴヌクレオチドの塩基配列の確認は、レ
イ・ウーらの方法により行なつて、
TGGTGCAGAであることが確認できた（第４
図）。また、反応の１サイクルの平均収率は、い
ずれも90％以上であつた。実施例２ DMT−dG−（Ｎ−iBu）−Suc−Ap（バイオサ
ーチ）30mgを反応室（Ａ−１）に入れて給排気装
置Ｂと接続し、同様に操作マニユアルに従がつ
て、ヌクレオチドブロツク（CC、TC、CA、
TA、CA、AG、GA、AA、CG、TT、AG、
GGのダイマー）を25mgずつ縮合させて、GG−
AG−TT−CG−AA−GA−AG−CA−TA−
CA−TC−CC−Ｇ−樹脂を合成した。反応終了
後、樹脂を取り出して乾燥させ、0.5Mピコリン
アルドキシム−テトラメチルグアニジンのピリジ
ン−水（９：１）溶液300μを加えて、37℃で
一夜放置した。次に、濃アンモニア水（４ml）加
え、55℃で一夜放置後、過を行なつて樹脂を除
去し、液を水に溶解し、エーテルで抽出を行な
つた（脱保護）。次に、セフアデツクスＧ−50
を用いてゲル過（溶出液は50ｍＭトリエチルア
ンモニウムバイカーボネート、PH7.5）を行なつ
た。この際、各フラクシヨンの260nｍの吸収を
測定し、最初に溶出したピークを集めて高速液体
クロマトグラフイー（HPLC）を行ない、ついで
８％酢酸２ml中で室温10分間反応させて5′−水酸
基体として目的とする合成フラグメントを分取し
た。なお、カラムはμ Bondapak C18（逆相）
を用いた。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配
列の確認は、マクサム・ギルバート法により行な
つて、
GGAGTTCGAAGAAGCATACATCCCGであ
ることを確認できた（第５図）。なお、5′−末端
のＧは検出することができない。また、反応の１
サイクルの平均収率は、いずれも90％以上であつ
た。

【図面の簡単な説明】

第１〜２図は、それぞれ本発明核酸合成器の反
応器および給排気装置を示す側断面図である。第
３図は、本発明核酸合成器の給排気装置を示す説
明図である。第４図は、レイ・ウーらの塩基配列
決定法に従つて行なつたオートラジオグラムの模
式図である。第５図は、マクサム・ギルバート法
により行なつたオートラジオグラムの模写図であ
る。Ａ−１……反応室、Ａ−２……フイルター取付
座、Ａ−３……フイルター、Ａ−４……給排液
管、Ｂ−１……正負圧発生装置、Ｂ−１−ｂ……
ピストン、Ｂ−２……ピストン駆動棒部材、Ｂ−
２−ａ……突起、Ｂ−４−ａ……係止爪、Ｂ−４
−ｂ……操作ノブ。

Claims

【特許請求の範囲】１着脱自在に連結された下記の部材ＡおよびＢ
からなることを特徴とする、固体支持体粒子上で
の反応によつて核酸を合成するための核酸合成
器。 (A) 下記の部材（Ａ−１）〜（Ａ−４）からなる
反応器。 (A‐１) 該固体支持体粒子を収容して該反応を行
なわせるに十分な容積を有する円筒からなる
反応室、 (A‐２) 反応室（Ａ−１）の下方への延長部をな
しかつ反応室（Ａ−１）の下部より内径の小
さい、該固体支持体粒子保持用フイルターを
取付けるための取付座、 (A‐３) 取付座（Ａ−２）に取付けられた、該固
体支持体粒子保持用フイルター、 (A‐４) 反応室（Ａ−１）のさらに取付座（Ａ−
２）の下方への延長部をなす、反応室（Ａ−
１）へ該反応を関与する液相材料を出入させ
るための給排液管、 (B) 下記の部材（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）からなる
給排気装置。 (B‐１) 上記反応室（Ａ−１）の上部において該
反応室と連通すべきシリンダー（Ｂ−１−
ａ）とその内部に設けられたピストン棒付き
ピストン（Ｂ−１−ｂ）とからなる正負圧発
生装置、 (B‐２) ピストン（Ｂ−１−ｂ）のピストン棒の
延長としての、ピストン駆動用棒部材、 (B‐３) 棒部材（Ｂ−２）を、ピストン（Ｂ−１
−ｂ）を退行させるように賦勢すべく配設し
たバネ部材、 (B‐４) バネ部材（Ｂ−３）によつて賦勢される
棒部材（Ｂ−２）の退行を所定位置に停止さ
せる制退機構。たヾし、この制退機構は、棒
部材（Ｂ−２）に設けられた突起（Ｂ−２−
ａ）とこれと係合する停止装置（Ｂ−４−
ａ）とからなり、突起（Ｂ−２−ａ）と停止
機構（Ｂ−４−ａ）とは棒部材（Ｂ−２）の
上記停止位置からの更なる退行を許容ししか
も更なる退行の後に再び上記停止位置への復
帰を許容するよう構成されたものである。２停止機構（Ｂ−４−ａ）が楔形頂部を持つ棒
状部材からなつていて(1)その軸が棒部材（Ｂ−
２）が退行するときの突起（Ｂ−２−ａ）の先端
が描く軌跡に対して直角となるようにかつ(2)該頂
部が該軌跡を常に横切つて突出するようにバネに
よつて賦勢されているが該軌跡を横切らない位置
まで手動で後退させうるように配設されたもので
あり、しかもこの楔形頂部の形状が(1)退行してく
る突起（Ｂ−２−ａ）に対してはその進行を停止
させるが、(2)該突起（Ｂ−２−ａ）の更なる退行
後の復帰時には該突起（Ｂ−２−ａ）によつて前
記軌跡を横切らない位置まで押戻されて、該突起
の停止位置への復帰を保証するように定められて
いる、特許請求の範囲第１項記載の核酸合成器。３突起（Ｂ−２−ａ）が、棒部材（Ｂ−２）に
嵌装されたスリーブに設けられており、該スリー
ブがネジによつて棒部材との間の相対位置を変え
られるようになつているものである、特許請求の
範囲第１〜２項のいずれかに記載の核酸合成器。４ピストン棒およびその延長としての棒部材
（Ｂ−２）が、ピストンを介してシリンダー内部
と本合成器の外界と連通する貫孔をその芯部に有
する、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項
に記載の核酸合成器。