JPH0513269B2

JPH0513269B2 -

Info

Publication number: JPH0513269B2
Application number: JP60077222A
Authority: JP
Inventors: Tooru Nakajima; Masahiro Sato; Katsuhiko Nishimura; Sumiaki Tsuru
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Pentax Corp
Priority date: 1985-04-11
Filing date: 1985-04-11
Publication date: 1993-02-22
Also published as: CH668960A5; GB2175602B; US5098842A; GB2175602A; GB8608736D0; US4761366A; JPS61235752A

Description

【発明の詳細な説明】

「技術分野」本発明は、動物細胞、特に付着性動物細胞群の
浮遊液の中から目的とする細胞ポピユレーシヨン
を分離する細胞分離材、分離器および分離方法に
関する。「従来技術およびその問題点」近年、医学分野において、臨床検査は勿論、一
連の生体防御機構増強物質の基礎的評価などを含
む免疫診断あるいは免疫治療を目的として、細胞
浮遊液の中から目的とする細胞群を分離すること
が行なわれている。しかしながら、例えばリンパ
球の中からＴ細胞、Ｂ細胞、Ｋ細胞、NK細胞な
どを分離する場合、未だそのポピユレーシヨンを
変えずに分離する方法はなく、細胞浮遊液の中か
ら目的とする細胞をそのポピユレーシヨンを変え
ずに分離する技術の完成が強く望まれている。特開昭57−204454号、特開昭56−140886号に
は、酸性官能基を有する粒状体や微細孔を有する
疎水性かつ水不溶性の粒状体、さらに具体的には
エチレン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニ
ル、スチレン、ジビニルベンゼン、アクリロニト
リル、メタクリル酸メチルの重合体および共重合
体、あるいはナイロン、ポリカーボネート、ポリ
エチレンテレフタレート、ポリエステル共重合体
およびこれらにスルホン基、カルボキシル基、ホ
スホン基あるいはフエノール基等を導入した誘導
体を利用した一段階の分離手段でＴ細胞を獲得す
る手法が提案されている。しかしながら、この細
胞分離方法では、粒状体の平均粒径が小さいので
カラムが詰まりやすく、また化学重合体自身ある
いは残留低分子物質が細胞活性に及ぼす毒作用が
あるという問題点がある。また、現在学術上国際的に公認されている細胞
分離材および分離方法は、いずれも、分離前の準
備に多大の時間がかかり、細心の処理過程を必要
とし、操作が複雑で時間と手間がかかり、使用材
料の製造ロツトによつてその分離能と分離パター
ン（細胞ポピユレーシヨンのスペクトル）に大き
な差異が発生して再現性に乏しいという問題点を
持つている。具体的代表例として、架橋デキストラン・セル
を用いるセフアデツクスC10法は、その原理が完
全には解明されていないが、細胞付着性の大小関
係が主役を演じていると考えられており、マクロ
フアージやサイズの大きい付着性を持つアクセサ
リー細胞が付着によつて分離され、Ｔ細胞やＢ細
胞が通過する。しかしながら、この方法では、非
付着性の小型アクセサリー細胞は通過してしまう
し、また最近の研究によるＴ細胞のサブポピユレ
ーシヨンのあるものは付着してしまうので、Ｔ細
胞ポピユレーシヨンを完全な形で得ることができ
ず、免疫診断学上のネツクポイントになつてい
る。他の具体的代表例として、ナイロンウールを用
いる分離カラムが公認されている。これは、Ｔ細
胞に富む分離細胞群を得る手段として使用される
が、ターゲツト細胞の実質的収率は概して低く、
12〜25％といわれている。そして、比較的純度の
高いＴ細胞が得られるが、分離前の細胞浮遊液中
のＴ細胞ポピユレーシヨンが通過後変つてしまう
欠点を有している。この方法では、ナイロンウー
ルを秤量して用いるが、製造ロツトの違いや、ウ
ールのほぐし方やカラムへの詰め方、洗浄の仕方
によつて分離能や分離パターンが変動する。な
お、このような特性は有機系の分離材に共通する
ものである。このように、細胞の付着性を利用する細胞分離
方法は、現在実用の緒についたばかりであり、分
離方法自体の改良や分離材の改良、あるいは新材
料の開発によつて、一段と高能率、高速度、高精
度になることが強く期待され、広くバイオテクノ
ロジーの分野や免疫診断学や免疫治療学など重要
な医学分野において今後益々その改良発達が要望
されている。「発明の目的」本発明の目的は、細胞分離のための事前処理、
事前操作および分離操作そのものを簡略化するこ
とにある。また、本発明の他の目的は、細胞の分
離能率を向上させ、分離パターンを制御すること
にある。本発明のさらに他の目的は、再現性の高
い分離法とそれに適する材料を提供することにあ
る。「発明の構成」本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研
究した結果、特定粒径のハイドロキシ・カルシウ
ム・アパタイト焼結体が免疫細胞群に対する優れ
た吸着活性を有することを見出し、本発明を完成
するに至つた。すなわち、本発明の細胞分離材は、ハイロドキ
シ・カルシウム・アパタイト焼結体からなり、平
均粒径50〜2000μmであることを特徴とする。また、本発明の細胞分離器は、ハイドロキシ・
カルシウム・アパタイト焼結体からなり、平均粒
径50〜2000μmである細胞分離材を、細胞浮遊液
の出入口を有し、前記細胞分離材の分散を防ぐフ
イルターが配置されたカラム内に充填したことを
特徴とする。さらに、本発明の細胞分離方法は、ハイドロキ
シ・カルシウム・アパタイト焼結体からなり、平
均粒径50〜2000μmである細胞分離材に、細胞浮
遊液を接触させて、特定細胞を前記分離材に吸着
させることを特徴とする。本発明で用いるハイドロキシ・カルシウム・ア
パタイト焼結体は、平均粒径50〜2000μmとされ
る。平均粒径が50μm未満では、対象細胞の大き
さと芽球形態から流れが悪く、詰まりやすいとい
う問題が生じ、平均粒径が2000μmを超えると、
吸着表面積の低下に起因して分離能が低下すると
いう問題が生じる。また、本発明で用いるハイドロキシ・カルシウ
ム・アパタイト焼結体の組成において、CaとＰ
との配合比は1.4≦Ca／Ｐ≦1.8とされることが好
ましい。Ca／Ｐが上記範囲を外れると、吸着能
が低下し、ひいては分離能が低下するという問題
が生じる。さらに、本発明で用いるハイドロキシ・カルシ
ウム・アパタイト焼結体製造に際して、その焼成
温度は600〜1350℃とすることが好ましい。焼成
温度が600℃未満ではモノサイトの吸着性が低下
するという問題が生じ、焼成温度が1350℃を超え
るとアパタイト自身が分解してセラミツクスが形
成できないという問題が生じる。本発明によれば、細胞を免疫的に刺激すること
なく、従来法に比べて極めて安定にかつ高い分離
能を持つて分離することができる。また、分離操
作は大きく簡略化され、分離の所要時間は従来法
の数分の一あるいは十数分の一に短縮される。す
なわち、分離材の保水率が極めて小さいのでワン
ステツプ法が利用でき、直接細胞浮遊液を流し込
むことができて、目的によつては洗浄も不要であ
る。滅菌されたカラム（小規模の目的には注射器
でよい）と滅菌された分離材（100℃〜500℃の任
意の温度で加熱滅菌可）を用いれば、分離材のカ
ラムへの装着は極めて簡単で短時間に使用可能に
セツトされるので、準備操作の面でも極めて経済
的である。勿論実用上は、使い捨てカラムに分離
材等を詰めて完全滅菌条件下で市場に提供するこ
とも極めて容易である。ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体
が免疫細胞群に対して示す吸着性は、この物質が
本来脊椎動物の骨成分と同一物質である事実に由
来するものと考えられる。この物質は、バイオア
クチブ・マテリアルであり、生きた細胞に対する
その特異的吸着性、接着性およびその制御可能性
においてこの右に出うる材料はなく、付着性細胞
分離材として最適である。なお、本発明において、ハイドロキシ・カルシ
ウム・アパタイト焼結体の顆粒表面には、例えば
生体由来のヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、
キチン誘導体、フイブロネクチン、オステオネク
チンあるいはその他の多糖体やムコ多糖体、およ
びその誘導体を部分吸着させ、基質表面の物理化
学的性質あるいは免疫学的性質を変調して対象細
胞群のそれぞれに対する吸着活性を巧妙に変化さ
せることもできる。これによつて、カラムの分離
特性を効果的に変化させ、シヤープな溶出パター
ンを与える分離特性や、分離スペクトラムの制御
を行なうことが可能となる。さらに、細胞のサブ
ポピユレーシヨンの各々に対する吸着効果が変調
されて、特定のサブポピユレーシヨンを選択分離
することも可能となる。また大量の細胞を処理するカラムに対しては、
多段のカスケード構造の利用や、吸着特性の不均
一分布構造の利用、あるいはＵ字管方式の利用に
より、細胞浮遊液の通過スピードの自在な制御も
可能となる。さらに、微細な分離パターンを得る
ために、無重力下の対流フリー、純拡散のみのカ
ラム通過を行なつてもよい。「発明の実施例」以下、本発明をリンパ細胞の分離に適用した実
施例を挙げるが、本発明は他の付着性細胞にも適
用可能である。なお、以下の実施例は、いずれも図に示すよう
な細胞分離器を用いて実施したものである。この
細胞分離器は、細胞浮遊液の入口４および出口５
を有するカラム１内にフイルター３（プラスチツ
ク、ガラス、セラミツクスなどの通気性多孔体や
繊維が用いられる）が配置され、それにハイドロ
キシ・カルシウム・アパタイト焼結体からなる分
離材２が充填されてできている。実施例１内容積５mlのカラムに、ガラスウール0.02grを
0.8mlになるように詰め、これに700℃で焼成した
平均粒径400〜500μmのハイドロキシ・カルシウ
ム・アパタイト焼結体（Ca／Ｐ＝1.67）を５mlに
なるようにタツプしながら充填し、細胞分離器と
した。細胞分離器の洗浄は、始め生理食塩水を流し、
次に37℃に保温した培地（RPMI 1640）を流し、
最後に37℃に保温したウシ胎児血清を10％含む培
地（RPMI 1640）を流した。次に、あらかじめ比重遠心法により正常人末梢
血から分離した単核細胞を、ウシ胎児血清を10％
含む培地（RPMI 1640）に浮遊させ、その0.4ml
をカラムにのせ、浸透させて37℃で１時間インキ
ユベートした。その後、培地（RPMI 1640）で
細胞を流出させた。この細胞分離器の分離能の評価は、次の二方法
で行なつた。その一つは、カラム通過前と通過後
の細胞数をヘモサイトメータを用いて数え、細胞
の回収率を調べる方法である。この結果を第１表
に示す。他は細胞分離状態を調べる方法で、カラ
ム通過後の細胞を蛍光標識抗体Leu1，Leu12，
Leu M3でラベルし、FACS
（flourescenceactivated cell sorter）を用いてＴ
細胞、Ｂ細胞およびモノサイトの陽性率（％）を
調べた。結果を第２表に示す。実施例２内容積５mlのカラムにガラスウール0.02grをほ
ぼ0.8mlになるように詰め、これに1200℃で焼成
した粒径400〜500μmのハイドロキシ・カルシウ
ム・アパタイト焼結体（Ca／Ｐ＝1.67）を５mlに
なるようにタツプしながら充填し、これに細胞分
離器とした。以下、分離操作、分離能の評価は実施例１と同
様に行なつた。分離能の評価の結果を第１表およ
び第２表に示す。実施例３内容積５mlのカラムにガラスウール0.02grをほ
ぼ0.8mlになるように詰め、これに700℃で焼成し
た粒径800〜1000μmのハイドロキシ・カルシウ
ム・アパタイト焼結体（平均的Ca／Ｐ＝1.67）を
５mlになるようにタツプしつつ充填して細胞分離
器とした。以下、分離操作、分離能の評価は実施例１と同
様に行なつた。分離能の評価の結果を第１表およ
び第２表に示す。実施例４内容積５mlのカラムにガラスウール0.02grをほ
ぼ0.8mlになるように詰め、これに700℃で焼成し
た粒径100〜200μmのハイドロキシ・カルシウ
ム・アパタイト焼結体（平均的Ca／Ｐ＝1.67）を
５mlになるようにタツプしつつ充填して細胞分離
器とした。以下、分離操作、分離能の評価は実施例１と同
様に行なつた。分離能の評価の結果を第１表およ
び第２表に示す。比較例１内容積５mlのカラムにナイロンウール0.25grを
ほぼ３mlになるように充填し、細胞分離器とし
た。以下、分離操作、分離能の評価は実施例１と同
様に行なつた。分離能の評価の結果を第１表およ
び第２表に示す。実施例５内容積５mlのカラムにガラスウール0.02grをほ
ぼ0.8mlになるように詰め、これに700℃で焼結し
た粒径400〜500μmのハイドロキシ・カルシウ
ム・アパタイト焼結体（Ca／Ｐ＝1.67）を５mlに
なるようにタツプしながら充填して細胞分離器と
した。そして、実施例１と同様な方法で採取した
単核細胞を分離カラムに１ml（1.8×10⁷個）通
し、さらに培地（RPMI 1640）を流し、流出し
た細胞を回収した。以下、分離能の評価は実施例１と同様にして行
ない、その結果を第１表および第２表に示す。実施例１，３，４によれば、ハイドロキシ・カ
ルシウム・アパタイト焼結体を分離材として用い
ることにより、安定した回収率と分離能が得られ
ることがわかる。特に、ナイロンウールを用いた
比較例１と比べると、非常に高い回収率となつて
いる。また、実施例２によれば、ハイドロキシ・
カルシウム・アパタイトの焼成温度を高くするこ
とによつてモノサイトの混入を最小限（0.8％）
に抑えることができることがわかる。さらに、実
施例５によれば、洗浄、インキユベートなどの操
作なしでも高い回収率と高分離能が得られること
がわかる。

【表】

【表】「発明の効果」以上説明したように、本発明によれば、特定粒
径のハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結
体を細胞分離材として使用するので、細胞を免疫
的に刺激することなく、従来法に比べて極めて安
定にかつ高い分離能を持つて分離することができ
る。また、分離材の保水率が極めて小さいのでワ
ンステツプ法が利用でき、直接細胞浮遊液を流し
込むことができて、目的によつては洗浄も不要で
あるため、分離操作を大幅に簡略化することがで
きる。さらに、ハイドロキシ・カルシウム・アパ
タイト焼結体の顆粒表面に種々の物質を部分吸着
させて、基質表面の物理化学的性質あるいは免疫
学的性質を変調して対象細胞群のそれぞれに対す
る吸着活性を巧妙に変化させることにより、細胞
の分離能率をさらに向上させ、分離パターンを制
御することもできる。

【図面の簡単な説明】

図は本発明による細胞分離器の一実施例を示す
断面図である。図中、１はカラム、２は細胞分離材、３はフイ
ルター、４は入口、５は出口である。

Claims

【特許請求の範囲】１ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結
体からなり、平均粒径50〜2000μmであることを
特徴とする細胞分離材。２特許請求の範囲第１項において、前記ハイド
ロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体は、600
〜1350℃で焼結され、造粒されたものである細胞
分離材。３特許請求の範囲第１項または第２項におい
て、前記ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト
焼結体は、Ca／Ｐが1.4〜1.8とされている細胞分
離材。４ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結
体からなり、平均粒径50〜2000μmである細胞分
離材を、細胞浮遊液の出入口を有し、前記細胞分
離材の分散を防ぐフイルターが配置されたカラム
内に充填したことを特徴とする細胞分離器。５特許請求の範囲第４項において、前記ハイド
ロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体は、600
〜1350℃で焼結され、造粒されたものである細胞
分離器。６特許請求の範囲第４項または第５項におい
て、前記ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト
焼結体は、Ca／Ｐが1.4〜1.8とされている細胞分
離器。７ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト焼結
体からなり、平均粒径50〜2000μmである細胞分
離材に、細胞浮遊液を接触させて、特定細胞を前
記分離材に吸着させることを特徴とする細胞分離
方法。８特許請求の範囲第７項において、前記ハイド
ロキシ・カルシウム・アパタイト焼結体は、600
〜1350℃で焼結され、造粒されたものである細胞
分離方法。９特許請求の範囲第７項または第８項におい
て、前記ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト
焼結体は、Ca／Ｐが1.4〜1.8とされている細胞分
離方法。