JPH0573397B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、臨床検査または生化学的研究におけ
る血液、尿等体液および組織切片等生体試料中の
成分の定量法に関する。 （従来の技術） 生体試料中の成分の分析法としては、従来、吸
光光度法、螢光光度法、電極法などが有効に広く
使用されてきている。しかしながら、いずれの分
析法でも検出感度に限界があつて、臨床検査また
は生化学的研究において、従来に増して試料中の
含量が低い成分の検出、定量が必要とされる状況
に対して、検出法としてその感度の要求に対応出
来ない場合がある。化学発光および生物発光の原
理を用いた検出、定量法は感度が高いという点で
注目されてきている。吸光光度法の感度限界が
μMであるのに対し、係る発光法はその1/1000以
下の限界を有す。従つて、このことは目的物の試
料中の含量が低い場合と共に貴重な試料の場合に
は分析に供する試料量を少くしようという要求に
も応え得る。また、従来の吸光法又は螢光法の場
合には光源及びその単色光化のための装置を要す
ると共にその取扱いは厳密でなければならない
が、発光法においてはこのような装置に基く取扱
いの繁雑さを要しない。 従来からルミノール法、ルシゲニン法などの化
学発光法による過酸化水素の定量法は周知である
が、これらの反応はアルカリ性下で行われないと
過酸化水素の定量として感度が十分に出ないとい
う欠点がある。この化学発光法を臨床検査分野に
おける生化学的検査に用いる場合は、血清、尿な
どの生体試料中の成分の影響を強くうけ、発光活
性が減弱するだけでなく測定値にバラツキが生じ
信頼がおかれていない。このため生体試料を希釈
して用いる工夫がなされたが、逆に試料量を減少
させるため測定感度を低下させるという矛盾に遭
遇する。 （発明の解決しようとする問題点） 本発明は、化学発光法による生体試料中の微量
成分、すなわち基質又は酵素活性を生体試料中の
存在物質の妨害を受けることなく、定量できる方
法を提供する。 （問題点を解決するための手段） 本発明は、生体試料中の基質又は生体試料中の
酵素による酵素反応により生成した物質に、酸化
酵素を作用させ、生成した過酸化水素に酸化触媒
下、被酸化性の非螢光性物質を反応させて該非螢
光性物質を螢光物質に転換させ、次いで酸化触媒
の阻害条件下、該螢光物質を修酸ジエステルおよ
び過酸化水素を加えて反応させ、生成する発光量
を測定することにより、生成試料中の基質又は酵
素活性を定量することを特徴とする化学発光法に
よる生体成分の定量法である。 本発明は、次のようなプロセスからなる。 プロセス；生体成分である基質に酵素を作用せ
しめるか、或は生体成分である酵素に基質を作
用せしめるかして、単一又は複数の酵素反応過
程を経て、最終的に酸化酵素を作用せしめるこ
とにより過酸化水素を生成せしめるプロセス。 プロセス；プロセスで得られた過酸化水素に
非螢光性物質及び酸化触媒を作用し、螢光物質
を生成せしめるプロセス。 プロセス；プロセスで得られた螢光物質に修
酸ジエステル及び過酸化水素を作用し、光を発
生し、この強度を測定するプロセス。 生体成分としては血液、尿、唾液、涙液、その
他の体液及び組織に含まれる基質又は酵素をい
う。 生体試料中の基質としては具体的には尿酸、コ
レステロールエステル、遊離コレステロール、ト
リグリセリド、プレトシン、カタベリン、スペル
ミン、スペルミジン等のポリアミン、ラクテー
ト、ピルベート、遊離脂肪酸、クレアチン、クレ
アチニンなどがある。 生成試料中の酵素としてはポリアミンオキシダ
ーゼ（例プレトシンオキシダーゼ）、コリンエス
テラーゼ、α−アミラーゼ、GPTなどがある。 酸化酵素としては、次のものが例示される。ウ
リカーゼ（尿酸）、コレステロールオキシダーゼ
（コレステロールステル、遊離コレステロール）、
グリセロリン酸オキシダーゼ（トリグリセリド）、
ポリアミンオキシダーゼ（ポリアミン）、ラクテ
ートオキシダーゼ（ラクテート）、ピルビン酸オ
キシダーゼ（ピルベート、GPT）、アシルCoAオ
キシダーゼ（遊離脂肪酸）、ザルコシンオキシダ
ーゼ（クレアチン、クレアチニン）、コリンオキ
シダーゼ（コリンエステラーゼ）、グルコースオ
キシダーゼ（α−アミラーゼ）、NAD〓Ｈオキシ
ダーゼ（デヒドロゲナーゼ反応を利用して測定す
ることが知られた基質類又は酵素類）など。 本発明において、公知の種々な過酸化水素生成
反応を適用し得る。次にその例を示すが、本発明
はこれに限定されない。 尿酸より過酸化水素の生成 尿酸＋O₂＋2H₂Oウリカーゼ −――――→ アラントイン＋H₂O₂ コレステロールエステルより過酸化水素の生成 コレステロールエステル＋H₂Oコレステロールエ
ステラーゼ ―――――――――――――→ コレステロール＋脂肪酸 コレステロール＋O₂コレステロールオキシダ
ーゼ ―――――――――――――→ △⁴−コレステノン＋H₂O₂ プトレシンより過酸化水素の生成 プトレシン＋O₂＋H₂Oプトレシンオキシダーゼ ―――――――――――→ ４−アミノブチルアルデヒド＋NH⁺ ₄＋H₂O₂ トリグリセリドより過酸化素の生成 トリグリセリド＋3H₂Oリパーゼ ――――→ グリセロール⁺3脂肪酸 グリセロール＋ATPグリセロールキナーゼ ――――――――――→ Mg²＋Ｌ−α−グリセロリン酸＋ADP Ｌ−α−グリセロリン酸＋O₂グリセロリン酸オキシダ
ーゼ ―――――――――――――→ H₂O₂＋ジヒドロキシアセトンリン酸 コリンエステラーゼの作用による過酸水素の生成 ベンゾイルコインコリンエステラー
ゼ ―――――――――→ コリン＋安息香酸 コリン＋2O₂＋H₂Oコリンオキシダー
ゼ ―――――――――→ ベタイン＋2H₂O₂ α−アミラーゼ作用による過酸化素の生成 マルトペンタオース＋H₂Oα−アミラーゼ ―――――――→ マルトース＋マルトトリオース マルトース＋マルトトリオース＋3H₂Oα−グ
ルコシダーゼ ―――――――――→ グルコース＋O₂＋H₂Oグルコースオキシ
ダーゼ ―――――――――――→ H₂O₂＋グルコン酸 プロセスにおいて用いる酸化触媒としては、
ペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘ
ミン、ヘマチンなどが挙げられる。 非螢光物質とは、前記プロセスで生成した過
酸化水素と前記酸化触媒によつて酸化され螢光物
質に変換されるものを指すが、フルオレセインの
ロイコ体、例えばロイコ−2′，7′−ジクロロフル
オレセインジアセテート等またはローダミンＢの
ロイコ体などが好適に使用出来る。これらの化合
物の他にもロイコローダミン、ロイコエオシンな
どの還元型が酸化されることにより、発螢光する
群とホモバニリン酸、ｐ−クレゾール、３−（ｐ
−ヒドロキシフエニル）プロピオン酸、チラミン
などの過酸化水素の存在下に酸化縮合して発螢光
する群などがある。ロイコ体としては、特にロイ
コ−2′，7′−ジクロロフルオレセインジアセテー
ト（LDADCF）は安定性に優れ、アルカリ又は
エステラーゼによる加水分解によつて容易に本発
明で言う非螢光物質、ロイコ−2′，7′−ジクロロ
フルオレセイン（LDCF）となし得る点で取扱い
容易な好適な化合物である。 プロセスとプロセスとは、一般的には水系
で反応を行い、逐次操作によつても、同時操作に
よつても遂行し得る。試料中の基質から酵素反応
による過酸化水素の誘導、試料中の酵素の作用に
よる過酸化水素の誘導は前記例示の如く、公知な
反応系であり、これらは１−ステツプ或は複数−
ステツプの操作により行われるが、少くとも最終
の過酸化水素生成反応は、プロセスと共役下に
同時操作で実施されるのが簡便で良い。 プロセスにおいて用いる修酸ジエステルとし
ては、ビス（２，４，６−トリクロロフエニル）
オキザレート、ビス（２，４−ジニトロフエニ
ル）オキザレート等がある。 本発明のプロセスはプロセスで用いた酸化
触媒の阻害条件下で実施される。それはプロセス
においては過剰量の過酸化水素を反応系外から
添加するから、酸化触媒を阻害させないで反応を
行うと、プロセスで過剰の蛍光物質が生成し、
発光のバツクグラウンドを増加させることにな
る。従つてプロセスはそれ以前のプロセスとは
必然的に操作上分離され逐次的に実施される。酸
化触媒を阻害させるには、シアン化ナトリウム、
シアン化カリウム、アジ化ナトリウム等、公知の
阻害剤を使用することが出来るが、好適には有機
溶媒の使用によつてその目的（阻害）を達成する
ことが出来る。何故ならプロセスの反応は水を
含む有機溶媒中で行うことが発光量の増大即ち感
度の増加のために必要であるからである。従つ
て、酸化触媒の阻害と発光量の増加という観点か
ら有機溶媒が選定される。有機溶媒としては、例
えば酢酸エチル、アセトン、アセトニトリルなど
が挙げられる。有機溶媒は単独でも、あるいは２
種以上の混合物であつてもよい。 反応は温度20〜40℃、中性又はアルカリ性のPH
下で行う。 プロセスで添加する過酸化水素の量は0.1〜
50ｍＭである。 発光量の測定は通常のフオトマルチプライヤ
ー、フオトカウンター等の検知器を装置した市販
の計測機を使用し得る。例えばピークの発光量を
ルミフオトメーターTD4000（ラボサイエンス社
製）を用いてカウントする。 本発明によつて生体試料中の極めて多種の基質
又は酵素を測定することが出来る。基質としては
例えばコレステロール・エステル、コレステロー
ル、グルコース、トリグリセライド、プトレシ
ン、カタベリン、スペルミン、スペルミジン等の
ポリアミン、尿酸、ラクテート、ピルベート、遊
離脂肪酸、クレアチン、クレアチニン等のオキシ
ダーゼ反応を利用して測定することが知られた基
質がある。酵素としてはアミラーゼ、コリンエス
テラーゼ、グルタメートピルベートトランスアミ
ナーゼ等のオキシダーゼ反応を組合せて測定する
ことが知られた酵素類がある。 また、デヒドロゲナーゼ反応を利用して測定す
ることが知られた基質類又は酵素類もNAD(D)Ｈ
オキシダーゼを使用するか又はNADHよりのメ
チレンブルーを増感剤として光照射下に過酸化水
素を生成して測定し得る。このような基質として
はトリグリセライド、胆汁酸、グルコース、コレ
ステロール等、酵素としてアミラーゼ、トランス
アミナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ等が挙
げられる。 また、生体試料中に存在する過酸化物、例えば
過酸化脂質は、プロセスを経ることなくプロセ
スによつて蛍光性物質に導かれ、プロセスに
おいて修酸ジエステル及び過酸化水素と反応して
光を発生し、この発光強度を測定する。 （発明の効果） 本発明では生体試料中の共存物質の妨害を受け
ることなく、生体試料中の微量成分を高感度に定
量することができる。即ち、吸光光度法では
10^-6M、螢光光度法では10^-7M、電極法では
10^-6M迄の微量成分を測定できるのに対して、本
発明では10^-9M迄の微量成分も測定できる。ま
た、本発明では測定セルの形状に依存することな
く、微量成分の絶対量に対応して測定することが
できる。さらに本発明では試料中の混濁に影響さ
れない。 （実施例） 次に本発明を実施例により説明する。 実施例 １ 尿酸の定量 発螢光試薬の調製：５mgのロイコ−2′，7′−ジ
クロロフルオレセインジアセテートを10mlのエタ
ノールに溶解し、40mlの0.01NNaOHを加えてア
セチル基を加水分解した。これに75mlの２％β−
シクロデキストリンを含む25ｍＭリン酸バツフア
ー（PH７）を加えて撹拌し、更に75mlの25ｍＭリ
ン酸バツフアーPH７）を加えて全量を200mlとし
た。この発螢光物質（非螢光物質）は常温で２日
間安定である。 酵素試薬の調製：西洋ワサビ大根ペルオキシダ
ーゼをプルプロガリンユニツトで5U／ml、ウリ
カーゼを1.5U／mlになるように25ｍＭリン酸バ
ツフアーPH７に加えた。 発光試薬の調製：酢酸エチルに溶解した0.5ｍ
Ｍビス（２，４，６−トリクロロフエニル）オキ
ザレート（TCPO）と水に溶解した２ｍＭ
H₂O₂をアセトニトリルで全量を調製して用意し
た。更に測定前に、アセトニトリルで1/5に希釈
して発光試薬として用いた。 尿酸の調製：尿酸は尿酸を含まないコントロー
ルを含めて、５×10^-6mg／dl〜５×10^-2mg／dlの
範囲で25ｍＭリン酸バツフアーに溶解させた。 測定操作としては、３mlの発螢光試薬をとり、
１mlの酵素液を加え、１mlの尿酸試料を加えて30
℃１時間インキユベートし、発螢光したサンプル
0.5mlをとり、これに0.5mlの発光試薬を注射器で
加えて、発光のピークを測定装置で読みとつた。
この結果を第１図に示す。測定感度は発螢光反応
（反応１、２）の段階で10^-6mg／dl（5.95×
10^-9M）であり、範囲は10^-6mg／dl〜10^-3mg／dl
で直線であつた。 なお、発光試薬にアセトニトリルが含有される
ことにより、酵素試薬中のペルオキシダーゼが阻
害を受ける。 次に生体試薬として血清を使用した場合の吸光
法との相関を示す。吸光法の測定は、市販の尿酸
測定試薬、ウリカラーエース（東洋紡製）で行つ
た。本発明による測定はあらかじめ血清を100倍
希釈した上で、上記発蛍光試薬に上記酵素液を加
えた反応系に血清希釈液１ml加えて（尿酸試料の
替りに血清希釈液を加える）以下同じ操作で測定
した。結果は第２図に示すように、ｙ＝0.987x＋
0.098r＝0.9991とよい相関を得た。 実施例 ２ コリンエステラーゼの活性測定 発螢光試薬及び発光試薬は実施例１と同様にし
て調製した。 基質試薬の調製：塩化ベンゾイルコリン2.4ｍ
ＭをＮ／50の塩酸水溶液に溶解した。 酵素試薬の調製：コリンオキシダーゼ5U／ml、
ペルオキシダーゼ5U／mlを0.1Mトリス緩衝液
（PH7.55）に溶解した。 停止液の調製：メチル硫酸ネオスチグミン12ｍ
Ｍを水に溶解した。 標準液の調製：塩化コリン５ｍＭの水溶液を作
製した。更に下記血清と同様に希釈した。 サンプルの希釈：血清サンプルを0.1Mトリス
緩衝液（PH7.55）にて500倍に希釈した。 測定操作：希釈サンプル、希釈標準液または水
（ブランク）を各20μとり酵素試薬１mlを加え
37℃にて５分間予備加温を行つて後、基質試薬１
mlを添加し、37℃にて正確に５分間加温の後、停
止液２mlを添加し更に発蛍光試薬（ロイコ−2′，
7′−ジクロロフルオレセインジアセテートを溶解
したエタノール溶液にβ−シクロデキストリンを
含むリン酸緩衝液を添加した試薬）３mlを加えて
20分間加温した。この発蛍光したサンプル0.5ml
をとり、これに0.5mlの発光試薬（酢酸エチルに
溶解したビス（２，４，６−トリクロロフエニ
ル）オキザレート（TCPO）と水に溶解した過酸
化水素をアセトニトリルで調製した試薬）を注射
器を用いて添加し、発光のピークを測定装置で読
み取つた。なお、発光試薬にアセトニトリルが含
有されることにより、酵素試薬中のペルオキシダ
ーゼが阻害を受ける。 血清サンプル中のコリンオキシダーゼ活性を次
式により算出した。 ChE活性値（IU／）＝血清サンプルでの発光カウ
ント数−ブランクカウント共／標準液での発光カウント
数−ブランクカウント共×1000 一方で、同じ血清サンプルを吸光光度法を用い
た試薬キツトダイヤカラー、CHE（東洋紡績(株)
製）のワンポイントアツセイ法を用いて測定し比
較した。結果は第１表の通りであり相関関係のあ
るデータが得られた。

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は本発明法による尿酸濃度と発光強度
（相対値）を示す。第２図は本発明法と従来の吸
光法による血清中の尿酸測定の相関性を示してい
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 生体試料中の基質又は生体試料中の酵素によ
   る酵素反応により生成した物質に、酸化酵素を作
   用させ、生成した過酸化水素に、酸化触媒存在
   下、被酸化性の非蛍光物質を反応させて該非蛍光
   物質を蛍光物質に転換させ、次いで酸化触媒の阻
   害条件下、該蛍光物質に修酸ジエステルおよび過
   酸化水素を加えて反応させ、生成する発光量を測
   定することにより、生体試料中の基質又は酵素活
   性を定量することを特徴とする化学発光法による
   生体成分の定量法。