JPH066070B2 - 化学発光法によるｎａｄｈ又はｎａｄｐｈの定量法 - Google Patents
化学発光法によるｎａｄｈ又はｎａｄｐｈの定量法Info
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- JPH066070B2 JPH066070B2 JP25117186A JP25117186A JPH066070B2 JP H066070 B2 JPH066070 B2 JP H066070B2 JP 25117186 A JP25117186 A JP 25117186A JP 25117186 A JP25117186 A JP 25117186A JP H066070 B2 JPH066070 B2 JP H066070B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は化学発光法によるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの定
量法に関するものである。
量法に関するものである。
（従来の技術） 従来からＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの定量法としては、紫
外部吸光法により直接測定する方法が非常によく知られ
ているが、濁質の妨害を受け易いこと、その感度が終濃
度として１０−６Ｍ程度であって、高感度測定を行ない
難いしことなどが欠点である。感度を増加させるため
に、ＮＡＤＨにジアホラーゼおよびレサズリンを作用さ
せて、生成するレゾルフィンの螢光を測定する方法が公
知であるが、濁質の影響を避けることができず、終濃度
として１０−７Ｍ程度が限度であるので、微量成分を検
出する上で十分な感度とは言えない。また現在使用され
ているジアホラーゼーレサズリン系によるＮＡＤＨの測
定では複雑な計算を要するなど実用的ではない。また螢
光測定装置は高価であって、上記方法の普及を妨げる要
因ともなっている。なお、ＮＡＤＰＨに対して適当な螢
光法はまだ見出されていない。
外部吸光法により直接測定する方法が非常によく知られ
ているが、濁質の妨害を受け易いこと、その感度が終濃
度として１０−６Ｍ程度であって、高感度測定を行ない
難いしことなどが欠点である。感度を増加させるため
に、ＮＡＤＨにジアホラーゼおよびレサズリンを作用さ
せて、生成するレゾルフィンの螢光を測定する方法が公
知であるが、濁質の影響を避けることができず、終濃度
として１０−７Ｍ程度が限度であるので、微量成分を検
出する上で十分な感度とは言えない。また現在使用され
ているジアホラーゼーレサズリン系によるＮＡＤＨの測
定では複雑な計算を要するなど実用的ではない。また螢
光測定装置は高価であって、上記方法の普及を妨げる要
因ともなっている。なお、ＮＡＤＰＨに対して適当な螢
光法はまだ見出されていない。
（発明の解決しようとする問題点） 上記実情から高感度にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを測定す
る方法が求められている。
る方法が求められている。
（問題点を解決するための手段） 本発明者は化学発光法より高感度に過酸化水素を定量す
る方法を見出し、既に提案している（特開昭６０−２０
０１６７号公報）が、今回ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを過
酸化水素へ導き、化学発光法によって過酸化水素を測定
することにより、高感度にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを定
量することが可能であることを見出し、本発明に到達し
た。
る方法を見出し、既に提案している（特開昭６０−２０
０１６７号公報）が、今回ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを過
酸化水素へ導き、化学発光法によって過酸化水素を測定
することにより、高感度にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを定
量することが可能であることを見出し、本発明に到達し
た。
すなわち本発明はＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを含む試料に
ＮＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＨ
−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオ
キシドレダクターゼ、ジアホラーゼおよび旧黄色酵素か
らなる群から選ばれた少なくとも１種の酵素をフラビン
類の存在下、作用させ、生成する還元型フラビン類を酸
素の存在下、自動酸化させることにより、過酸化水素を
生成させ、得られた過酸化水素を化学発光法により測定
して試料中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを定量することを
特徴とする化学発光法によるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの
定量法である。
ＮＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＨ
−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオ
キシドレダクターゼ、ジアホラーゼおよび旧黄色酵素か
らなる群から選ばれた少なくとも１種の酵素をフラビン
類の存在下、作用させ、生成する還元型フラビン類を酸
素の存在下、自動酸化させることにより、過酸化水素を
生成させ、得られた過酸化水素を化学発光法により測定
して試料中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを定量することを
特徴とする化学発光法によるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの
定量法である。
本発明では試料中のＮＡＤＨを定量するに当り、まずＮ
ＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＨ−
ＦＭＮオキシドレダクターゼ又はジアホラーゼをフラビ
ン類の存在下に作用させる。
ＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＨ−
ＦＭＮオキシドレダクターゼ又はジアホラーゼをフラビ
ン類の存在下に作用させる。
ＮＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ又はＮＡＤ
Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼは発光細菌ビブリオフ
ィッシエリ（Vibrio fischeri）又はビブリオハーベア
イ（Vibrio harveyi）から得ることができる（バイオケ
ミストリーＶｏ１６、No.１３、ｐ２９３２、１９７
７、同Ｖｏｌ．No.４，ｐ６７２，１９７８，など）。
ジアホラーゼはＥＣ１，６，４，３として分類される酵
素であり、動物起源又は微生物起源のものがある。
Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼは発光細菌ビブリオフ
ィッシエリ（Vibrio fischeri）又はビブリオハーベア
イ（Vibrio harveyi）から得ることができる（バイオケ
ミストリーＶｏ１６、No.１３、ｐ２９３２、１９７
７、同Ｖｏｌ．No.４，ｐ６７２，１９７８，など）。
ジアホラーゼはＥＣ１，６，４，３として分類される酵
素であり、動物起源又は微生物起源のものがある。
ＮＡＤＨを定量するに当り、上記酵素はフラビン類、例
えばＦＭＮ、ＦＡＤ又はリボフラビンとＮＡＤＨを含む
試料に添加して反応させて還元型フラビンを生成させ、
酸素の存在下、自動酸化させることにより過酸化水素を
生成させる。
えばＦＭＮ、ＦＡＤ又はリボフラビンとＮＡＤＨを含む
試料に添加して反応させて還元型フラビンを生成させ、
酸素の存在下、自動酸化させることにより過酸化水素を
生成させる。
ＮＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＨ
−ＦＭＮオキシドレダクターゼまたはジアホラーゼは通
常１〜５０ｍｕ終濃度で使用する。還元型フラビンは通
常０．１〜１００μＭの濃度で使用する。
−ＦＭＮオキシドレダクターゼまたはジアホラーゼは通
常１〜５０ｍｕ終濃度で使用する。還元型フラビンは通
常０．１〜１００μＭの濃度で使用する。
また本発明では試料中のＮＡＤＰＨを定量するに当り、
まずＮＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡ
ＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ又は旧黄色酵素を
フラビン類の存在下に作用させる。
まずＮＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡ
ＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ又は旧黄色酵素を
フラビン類の存在下に作用させる。
ＮＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ又はＮＡＤ
ＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼは発光細菌ビブリオ
フィッシェリ（Vibrio fischeri）又はビブリオハーベ
アイ（Vibrio farveyi）から得ることができる（バイオ
ケミストリーVol．１６，No.３，ｐ２９３２，１９７
７，同Ｖｏｌ．１７，No.４，ｐ６７２，１９７８な
ど）。旧黄色酵素はＥＣ１，６，９９，１として分類さ
れる酵素であり、酵母、海洋発光細菌などから得られ
る。
ＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼは発光細菌ビブリオ
フィッシェリ（Vibrio fischeri）又はビブリオハーベ
アイ（Vibrio farveyi）から得ることができる（バイオ
ケミストリーVol．１６，No.３，ｐ２９３２，１９７
７，同Ｖｏｌ．１７，No.４，ｐ６７２，１９７８な
ど）。旧黄色酵素はＥＣ１，６，９９，１として分類さ
れる酵素であり、酵母、海洋発光細菌などから得られ
る。
ＮＡＤＰＨを定量するに当り、上記酵素はフラビン類、
例えばＦＭＮ、ＦＡＤ又はリボフラビンとＮＡＤＰＨを
含む試料に添加して反応させて、還元型フラビンを生成
させ、酸素の存在下、自動酸化させることにより過酸化
水素を生成させる。
例えばＦＭＮ、ＦＡＤ又はリボフラビンとＮＡＤＰＨを
含む試料に添加して反応させて、還元型フラビンを生成
させ、酸素の存在下、自動酸化させることにより過酸化
水素を生成させる。
ＮＡＤ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰ
Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼまたは旧黄色酵素は通
常１〜５０ｍｕ終濃度で使用する。
Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼまたは旧黄色酵素は通
常１〜５０ｍｕ終濃度で使用する。
本発明では生成した過酸化水素を化学発光法により定量
する。化学発光法としてはルミノール、又はルシゲニン
による化学発光法または蓚酸ジエステルと螢光物質によ
る化学発光法を使用することができる。
する。化学発光法としてはルミノール、又はルシゲニン
による化学発光法または蓚酸ジエステルと螢光物質によ
る化学発光法を使用することができる。
生成した過酸化水素をルミノール反応で定量する場合、
ルミノールは１０−６〜１０−７Ｍの濃度で使用し、触
媒として例えば約１０ｍＭフェリシアン化カリウムを１
００ｍＭホウ酸緩衝液（pH１０）中で使用する。触媒と
してパーオキシダーゼを使用する場合、例えば１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（pH７〜７．５）又は１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（pH７〜８．５）を使用してもよい。
ルミノールは１０−６〜１０−７Ｍの濃度で使用し、触
媒として例えば約１０ｍＭフェリシアン化カリウムを１
００ｍＭホウ酸緩衝液（pH１０）中で使用する。触媒と
してパーオキシダーゼを使用する場合、例えば１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（pH７〜７．５）又は１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（pH７〜８．５）を使用してもよい。
生成した過酸化水素を蓚酸ジエステルと螢光物質で化学
発光させて定量する場合、約１〜１０μＭフルオレセイ
ン又は８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸を約１
〜１０μＭ加え、約０．１〜５０ｍＭの蓚酸ジエステ
ル、例えばビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オ
キザレート（ＴＣＰＯ）、ビス（２，４−ジニトロフェ
ニル）オキザレート（ＤＮＰＯ）などを使用する。
発光させて定量する場合、約１〜１０μＭフルオレセイ
ン又は８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸を約１
〜１０μＭ加え、約０．１〜５０ｍＭの蓚酸ジエステ
ル、例えばビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オ
キザレート（ＴＣＰＯ）、ビス（２，４−ジニトロフェ
ニル）オキザレート（ＤＮＰＯ）などを使用する。
本発明者が開発した２′，７′−ジクロロフルオレシン
−ジアセテートによる発螢光反応を、蓚酸ジエステルと
新たに添加した過酸化水素で発光させる方法が、化学発
光法として感度あるいは精度の点から好ましい。次に生
成した過酸化水素を本発明者の開発した化学発光法によ
り定量する方法について詳述する。すなわち生成した過
酸化水素を含む試料に、酸化触媒を介して被酸化性の非
螢光物質を反応させて、非螢光物質を螢光物質に転換さ
せ、次いで酸化触媒の阻害条件下に該螢光物質を蓚酸ジ
エステル類および過酸化水素と反応させ、生成する発光
量を測定することにより、試料中の過酸化水素を定量す
る。
−ジアセテートによる発螢光反応を、蓚酸ジエステルと
新たに添加した過酸化水素で発光させる方法が、化学発
光法として感度あるいは精度の点から好ましい。次に生
成した過酸化水素を本発明者の開発した化学発光法によ
り定量する方法について詳述する。すなわち生成した過
酸化水素を含む試料に、酸化触媒を介して被酸化性の非
螢光物質を反応させて、非螢光物質を螢光物質に転換さ
せ、次いで酸化触媒の阻害条件下に該螢光物質を蓚酸ジ
エステル類および過酸化水素と反応させ、生成する発光
量を測定することにより、試料中の過酸化水素を定量す
る。
この方法を反応式で示すと次の通りである。
螢光物質＋蓚酸ジエステル＋Ｈ２Ｏ２→ｈν＋生成物…
……(2) すなわち被酸化性の非螢光物質を前記反応により生成し
た過酸化水素によって、酸化触媒の存在下に螢光物質に
転換させ（第１反応）、次いで酸化触媒を阻害条件下、
例えば阻害剤を加えて酸化触媒を阻害させた後、生成し
た螢光物質を蓚酸ジエステル類と改めて加えた過酸化水
素の存在下に発光させ（第２反応）、この発光量を測定
することにより第１段反応での過酸化水素の定量を行な
う。
……(2) すなわち被酸化性の非螢光物質を前記反応により生成し
た過酸化水素によって、酸化触媒の存在下に螢光物質に
転換させ（第１反応）、次いで酸化触媒を阻害条件下、
例えば阻害剤を加えて酸化触媒を阻害させた後、生成し
た螢光物質を蓚酸ジエステル類と改めて加えた過酸化水
素の存在下に発光させ（第２反応）、この発光量を測定
することにより第１段反応での過酸化水素の定量を行な
う。
本発明において使用する被酸化性の非螢光物質としては
ロイコフルオレセイン（フルオレシン）、２′，７′−
ジクロロフルオレシン−ジアセテートなどがある。非螢
光物質の使用量は一般に０．００１〜５ｍＭである。
ロイコフルオレセイン（フルオレシン）、２′，７′−
ジクロロフルオレシン−ジアセテートなどがある。非螢
光物質の使用量は一般に０．００１〜５ｍＭである。
本発明において使用する酸化触媒としては、ペルオキシ
ダーゼ、ミクロペルキシダーゼ、ヘミン、ヘマチンなど
がある。酸化触媒の使用量は一般に１〜１００単位であ
る。
ダーゼ、ミクロペルキシダーゼ、ヘミン、ヘマチンなど
がある。酸化触媒の使用量は一般に１〜１００単位であ
る。
本発明において使用する蓚酸ジエステル類としては、ビ
ス（２，４，６，−トリクロロフェニル）オキザレート
（ＴＣＰＯ）、ビス（２，４−ジニトロフェニル）オキ
ザレート（ＤＮＰＯ）などがある。蓚酸ジエステル類の
使用量は一般に０．１〜５０ｍＭである。
ス（２，４，６，−トリクロロフェニル）オキザレート
（ＴＣＰＯ）、ビス（２，４−ジニトロフェニル）オキ
ザレート（ＤＮＰＯ）などがある。蓚酸ジエステル類の
使用量は一般に０．１〜５０ｍＭである。
本発明の酸化触媒の阻害剤としては、シアン化カリウ
ム、シアン化ナトリウム、ナトリウムアジド、スルファ
イド、フルオライド、フェロシアナイド、ヒドロキシフ
ェニルヒドラジン、２，３−ジメルカプトプロパノー
ル、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、アセト
ンなどがある。
ム、シアン化ナトリウム、ナトリウムアジド、スルファ
イド、フルオライド、フェロシアナイド、ヒドロキシフ
ェニルヒドラジン、２，３−ジメルカプトプロパノー
ル、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、アセト
ンなどがある。
本発明では前記第１反応を水系で行なうことが必要であ
る。この反応は通常約２０〜４０゜C、pH５〜９で行な
う。第１反応終了後、酸化触媒は阻害されなければなら
ない。失活されない酸化触媒が存在していると第２反応
において、改めて加えられた過酸化水素と残存する非螢
光物質が反応して、過剰量の螢光物質を生成してしま
う。第１反応系には１０−５〜１０−１Ｍのシクロデキ
ストリンを添加すると、非螢光物質の安定化ならびに生
成した螢光物質の発光性の増加が見られる。
る。この反応は通常約２０〜４０゜C、pH５〜９で行な
う。第１反応終了後、酸化触媒は阻害されなければなら
ない。失活されない酸化触媒が存在していると第２反応
において、改めて加えられた過酸化水素と残存する非螢
光物質が反応して、過剰量の螢光物質を生成してしま
う。第１反応系には１０−５〜１０−１Ｍのシクロデキ
ストリンを添加すると、非螢光物質の安定化ならびに生
成した螢光物質の発光性の増加が見られる。
また本発明では酸化触媒（ペルオキシダーゼ）存在下
に、非螢光物質（ロイコフルオレセイン）の酸化を防ぐ
ために、硫酸亜鉛・７水和物を望ましくは約０．０４mg
／ｍ終濃度になるように、第１反応系に添加すること
が好ましい。
に、非螢光物質（ロイコフルオレセイン）の酸化を防ぐ
ために、硫酸亜鉛・７水和物を望ましくは約０．０４mg
／ｍ終濃度になるように、第１反応系に添加すること
が好ましい。
本発明の前記第２反応は水を含む有機溶媒中で行なう。
有機溶媒としては、例えば酢酸エチル、アセトン、アセ
トニトリルなどが挙げられる。有機溶媒は単独でもある
いは２種以上の混和物であってもよい。第２反応は通常
約２０〜４０゜C、アルカリ性下、pH８〜１２で行なう。
有機溶媒としては、例えば酢酸エチル、アセトン、アセ
トニトリルなどが挙げられる。有機溶媒は単独でもある
いは２種以上の混和物であってもよい。第２反応は通常
約２０〜４０゜C、アルカリ性下、pH８〜１２で行なう。
第２反応系に添加する過酸化水素の量は一般に０．１〜
５０ｍＭである。
５０ｍＭである。
第２反応系で生じた発光活性は通常の測定法に従って測
定する。例えばピークの発光量をルミフォトメータ−Ｔ
Ｄ４０００（ラボサイエンス社製）にてカウントする。
発光活性では発光値はの常に反応の時間あたりで表現さ
れるため、そのまま反応速度を表現している。
定する。例えばピークの発光量をルミフォトメータ−Ｔ
Ｄ４０００（ラボサイエンス社製）にてカウントする。
発光活性では発光値はの常に反応の時間あたりで表現さ
れるため、そのまま反応速度を表現している。
この方法では他の物質の妨害を受けることなく、化学発
光法により過酸化水素を高感度に定量することができ
る。
光法により過酸化水素を高感度に定量することができ
る。
従来の知見ではビス（２，４，６−トリクロロフェニ
ル）オキザレートと螢光物質による過酸化水素の定量性
は感度が悪く、通常１０−７〜１０−６Ｍ以上でないと
検出されない。ところが本発明では被酸化性の非螢光物
質を選択することで、１０−９Ｍまで過酸化水素を測定
することが可能となる。また本発明では第１反応を水系
中で行ない螢光物質を生成するに際し、ペルオキシダー
ゼなどの酵素による酸化を行なえば、付随する過酸化水
素生成系反応、例えばグルコース定量におけるグルコー
スオキシダーゼなどを損うことなく、温和な条件で過酸
化水素、ひいてはグルコースの定量を行なうことができ
る。
ル）オキザレートと螢光物質による過酸化水素の定量性
は感度が悪く、通常１０−７〜１０−６Ｍ以上でないと
検出されない。ところが本発明では被酸化性の非螢光物
質を選択することで、１０−９Ｍまで過酸化水素を測定
することが可能となる。また本発明では第１反応を水系
中で行ない螢光物質を生成するに際し、ペルオキシダー
ゼなどの酵素による酸化を行なえば、付随する過酸化水
素生成系反応、例えばグルコース定量におけるグルコー
スオキシダーゼなどを損うことなく、温和な条件で過酸
化水素、ひいてはグルコースの定量を行なうことができ
る。
本発明では、生体試料中の成分から共存する反応によっ
て生成する微量の過酸化水素を高感度に、特に１０−９
〜１０−５Ｍの範囲で測定することが可能である。また
生体成分分析に際して、水系の反応を阻害することな
く、安定な螢光物質を生成させ、かつ生体試料中のカタ
ラーゼなどの妨害により生成した過酸化水素を減じるこ
となく、真に定量的にかつ高感度に生体成分の分析を行
なうことができる。本発明では特に第２反応が生体試料
中の妨害物質の影響を受けないので、感度の高い発光活
性を得ることができる。
て生成する微量の過酸化水素を高感度に、特に１０−９
〜１０−５Ｍの範囲で測定することが可能である。また
生体成分分析に際して、水系の反応を阻害することな
く、安定な螢光物質を生成させ、かつ生体試料中のカタ
ラーゼなどの妨害により生成した過酸化水素を減じるこ
となく、真に定量的にかつ高感度に生体成分の分析を行
なうことができる。本発明では特に第２反応が生体試料
中の妨害物質の影響を受けないので、感度の高い発光活
性を得ることができる。
本発明で定量するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、生体内の
成分、例えばコール酸ナトリウム、グルタミン酸などの
物質から生成したものであってもよい。
成分、例えばコール酸ナトリウム、グルタミン酸などの
物質から生成したものであってもよい。
本発明はＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを定量するばかりでな
く、生体内の成分、例えばコール酸ナトリウム、グルタ
ミン酸などを定量することもできる。
く、生体内の成分、例えばコール酸ナトリウム、グルタ
ミン酸などを定量することもできる。
（効果） 本発明ではＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ過酸化水素へ変換
し、さらに化学発光法によって高感度でかつ精度がよく
定量することができる。
し、さらに化学発光法によって高感度でかつ精度がよく
定量することができる。
（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１（ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼによ
るＮＡＤＨの定量） ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）１ｍ中に、Ｎ
ＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ２０ｍｕ、パーオ
キシダーゼ５ｕを加え、さらに２′，７′，−ジクロロ
フルオレシン−ジアセテート溶液（２５μｇ／ｍ）３
ｍおよび１ｍＭＦＭＮ５μを添加した後、各種濃度
のＮＡＤＨ溶液１ｍを加えて、３０゜Cで１時間インキ
ュベートした。発螢光した溶液０．５ｍに０．１ｍＭ
ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザレート
および０．４ｍＭ過酸化水素溶液を添加して発光をルミ
フォトメーターにより測定した。
るＮＡＤＨの定量） ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）１ｍ中に、Ｎ
ＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ２０ｍｕ、パーオ
キシダーゼ５ｕを加え、さらに２′，７′，−ジクロロ
フルオレシン−ジアセテート溶液（２５μｇ／ｍ）３
ｍおよび１ｍＭＦＭＮ５μを添加した後、各種濃度
のＮＡＤＨ溶液１ｍを加えて、３０゜Cで１時間インキ
ュベートした。発螢光した溶液０．５ｍに０．１ｍＭ
ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザレート
および０．４ｍＭ過酸化水素溶液を添加して発光をルミ
フォトメーターにより測定した。
発光強度と０．５ｍ溶液中のＮＡＤＨ濃度との関係を
第１図に示す。第１図から明らかなようにＮＡＤＨの濃
度５×１０−９Ｍ〜１０−５Ｍが定量可能である。
第１図に示す。第１図から明らかなようにＮＡＤＨの濃
度５×１０−９Ｍ〜１０−５Ｍが定量可能である。
実施例２（ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼによ
るコール酸ナトリウムの定量） ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）１ｍ中に３α
−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ２５ｕ、１ｍ
Ｍ ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ
２０ｍｕ、パーオキシダーゼ５ｕを溶解し、さらに
２′，７′−ジクロロフルオレシン−ジアセテート溶液
（２５μｇ／ｍ）３ｍおよび１ｍＭＦＭＮ５μを
添加した後、各種濃度のコール酸ナトリウムを加え、３
０゜Cで１時間インキュベートした。発螢光した溶液０．
５ｍに０．１ｍＭビス（２，４，６−トリクロロフェ
ニル）オキザレートおよび０．４ｍＭ過酸化水素溶液を
添加して、発光をルミフオトメーターにより測定した。
るコール酸ナトリウムの定量） ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）１ｍ中に３α
−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ２５ｕ、１ｍ
Ｍ ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ
２０ｍｕ、パーオキシダーゼ５ｕを溶解し、さらに
２′，７′−ジクロロフルオレシン−ジアセテート溶液
（２５μｇ／ｍ）３ｍおよび１ｍＭＦＭＮ５μを
添加した後、各種濃度のコール酸ナトリウムを加え、３
０゜Cで１時間インキュベートした。発螢光した溶液０．
５ｍに０．１ｍＭビス（２，４，６−トリクロロフェ
ニル）オキザレートおよび０．４ｍＭ過酸化水素溶液を
添加して、発光をルミフオトメーターにより測定した。
発光強度と０．５ｍ溶液中のコール酸ナトリウム濃度
との関係はコール酸ナトリウム濃度５×１０−９Ｍ〜１
０−５Ｍにおいて相関関係が見られる。すなわちコール
酸ナトリウム濃度５×１０−９Ｍ〜１０−５Ｍが定量可
能である。
との関係はコール酸ナトリウム濃度５×１０−９Ｍ〜１
０−５Ｍにおいて相関関係が見られる。すなわちコール
酸ナトリウム濃度５×１０−９Ｍ〜１０−５Ｍが定量可
能である。
実施例３（ＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼに
よるＮＡＤＰＨの定量） ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）１ｍ中に、Ｎ
ＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ２０ｍｕ、パー
オキシダーゼ５ｕを加え、さらに２′，７′−ジクロロ
フルオレシン−ジアセテート溶液（２５μｇ／ｍ）３
ｍおよび１ｍＭＦＭＮ５μを加えた後、各種濃度の
ＮＡＤＰＨ溶液１ｍを加えて、３０゜Cで１時間インキ
ュベートした。発螢光した溶液０．５ｍに、実施例１
と同様にして蓚酸ジエステルと過酸化水素を加えて発光
をルミフォトメーターにより測定した。
よるＮＡＤＰＨの定量） ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）１ｍ中に、Ｎ
ＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ２０ｍｕ、パー
オキシダーゼ５ｕを加え、さらに２′，７′−ジクロロ
フルオレシン−ジアセテート溶液（２５μｇ／ｍ）３
ｍおよび１ｍＭＦＭＮ５μを加えた後、各種濃度の
ＮＡＤＰＨ溶液１ｍを加えて、３０゜Cで１時間インキ
ュベートした。発螢光した溶液０．５ｍに、実施例１
と同様にして蓚酸ジエステルと過酸化水素を加えて発光
をルミフォトメーターにより測定した。
発光速度と０．５ｍ溶液中のＮＡＤＰＨ濃度との関係
を第２図に示す。第２図から明かなようにＮＡＤＰＨ濃
度５×１０−９Ｍ〜５×１０−５Ｍが定量可能である。
を第２図に示す。第２図から明かなようにＮＡＤＰＨ濃
度５×１０−９Ｍ〜５×１０−５Ｍが定量可能である。
実施例４（ＮＡＤＰＨ−ＦＭＮ オキシドレダクターゼ
によるグルタミン酸の定量） ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）１ｍ中に、グ
ルタメートデヒドロゲナーゼ２５ｕ、１ｍＭ ＮＡＤＰ
＋、ＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ２０ｍ
ｕ、パーオキシダーゼ５ｕを加え、さらに２′，７′−
ジクロロフルオレシン−ジアセテート溶液（２５μｇ／
ｍ）３ｍおよび１ｍＭＦＭＮ５μを添加した後、
各種濃度のグルタミン酸を加え、３０゜Cで１時間インキ
ュベートした。発螢光した溶液０．５ｍに０．１ｍＭ
ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザレート
および０．４ｍＭ過酸化水素溶液を添加して発光をルミ
フォトメーターにより測定した。
によるグルタミン酸の定量） ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）１ｍ中に、グ
ルタメートデヒドロゲナーゼ２５ｕ、１ｍＭ ＮＡＤＰ
＋、ＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ２０ｍ
ｕ、パーオキシダーゼ５ｕを加え、さらに２′，７′−
ジクロロフルオレシン−ジアセテート溶液（２５μｇ／
ｍ）３ｍおよび１ｍＭＦＭＮ５μを添加した後、
各種濃度のグルタミン酸を加え、３０゜Cで１時間インキ
ュベートした。発螢光した溶液０．５ｍに０．１ｍＭ
ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキザレート
および０．４ｍＭ過酸化水素溶液を添加して発光をルミ
フォトメーターにより測定した。
発光強度と０．５ｍ溶液中のグルタミン酸濃度との関
係はグルタミン酸濃度１０−９Ｍ〜１０−５Ｍにおいて
相関関係が見られる。すなわちグルタミン酸濃度１０
−９Ｍ〜１０−５Ｍが定量可能である。
係はグルタミン酸濃度１０−９Ｍ〜１０−５Ｍにおいて
相関関係が見られる。すなわちグルタミン酸濃度１０
−９Ｍ〜１０−５Ｍが定量可能である。
第１図はＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼを用い
たＮＡＤＨの定量曲線を示し、縦軸は発光強度（ピーク
値）、横軸はＮＡＤＨの量を示す。 第２図はＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼを用
いたＮＡＤＰＨの定量曲線を示し、縦軸は発光強度（ピ
ーク値）、横軸はＮＡＤＰＨの量を示す。
たＮＡＤＨの定量曲線を示し、縦軸は発光強度（ピーク
値）、横軸はＮＡＤＨの量を示す。 第２図はＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼを用
いたＮＡＤＰＨの定量曲線を示し、縦軸は発光強度（ピ
ーク値）、横軸はＮＡＤＰＨの量を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを含む試料にＮＡ
Ｄ(P)Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＨ−Ｆ
ＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシ
ドレダクターゼ、ジアホラーゼおよび旧黄色酵素からな
る群から選ばれた少なくとも１種の酵素をフラビン類の
存在下作用させ、生成する還元型フラビン類を酸素の存
在下、自動酸化させることにより、過酸化水素を生成さ
せ、得られた過酸化水素を化学発光法により測定して試
料中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを定量することを特徴と
する化学発光法によるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの定量
法。 - 【請求項２】得られた過酸化水素に酸化触媒を介して被
酸化性の非螢光物質を反応させて、非螢光物質を螢光物
質に転換させ、次いで酸化触媒の阻害条件下に該螢光物
質を修酸ジエステル類および過酸化水素と反応させ、生
成する発光量を測定することにより、試料中のＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨを定量することを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載される化学発光法によるＮＡＤＨ又は
ＮＡＤＰＨの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25117186A JPH066070B2 (ja) | 1986-10-21 | 1986-10-21 | 化学発光法によるｎａｄｈ又はｎａｄｐｈの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25117186A JPH066070B2 (ja) | 1986-10-21 | 1986-10-21 | 化学発光法によるｎａｄｈ又はｎａｄｐｈの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63105697A JPS63105697A (ja) | 1988-05-10 |
| JPH066070B2 true JPH066070B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=17218734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25117186A Expired - Lifetime JPH066070B2 (ja) | 1986-10-21 | 1986-10-21 | 化学発光法によるｎａｄｈ又はｎａｄｐｈの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH066070B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103196897A (zh) * | 2013-02-22 | 2013-07-10 | 北京源德生物医学工程有限公司 | 一种苯丙氨酸定量检测试剂盒及其检测方法 |
| CN111007049B (zh) * | 2019-12-26 | 2022-06-14 | 合肥工业大学 | 一种以黄素单核苷酸为荧光探针测定磷酸根含量的方法 |
-
1986
- 1986-10-21 JP JP25117186A patent/JPH066070B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63105697A (ja) | 1988-05-10 |
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