JPH0645636B2 - 免疫刺激活性を有するトリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は免疫刺激活性を有するトリペプチドに関する。

発明の概要 通常の溶液法によって合成されたトリペプチドＡｒｇ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｕおよびその塩は、未成熟Ｔ細胞の成熟お
よびＴ細胞機能の両方に対し免疫刺激活性を示す。

発明の詳説 〈化学的特性〉 分子量：４３１．５２ 施光度：▲［α］^２０ _Ｄ▼＝５．１３（ｃ＝１、酢酸） ＨＰＬＣ分析：以下に記載の分離条件に従い、イオン・
ペアリングＨＰＬＣによりトリペプチドを分析した。

溶離剤：ＮａＨ_２ＰＯ_４ ０．０５Ｍ pH4.3＋ＳＤＳ
５×１０^−４Ｍ：ＭｅＯＨ；５０：５０ 流速：１ｍ／分 検出：２２５nm 注入容量：２０μ 試料：２０μｇ カラム：ｕボンダパック(Bondapack)Ｃ１８（ウオター
ズ）、３００×３．９mm 以下の測定法を用いた。

液体クロマトグラフィー：シリーズ（ＳＥＲＩＥＳ）４
（パーキン・エルマー(Perkin Elmer)） 注入バルブ：レオダイン(Reodyne)モデル７１２５−０
７５、２０μループ 検出器：分光光度計ＬＣ９５（パーキン・エルマー(Per
kin Elmer)） 計算積分機：データ・ステーション３６００（パーキン
・エルマー） 添付の図面はトリペプチドのＨＰＬＣを示す。

イン・ビトロ模擬胃周囲に対する耐性 該トリペプチドはイン・ビトロ模擬胃周囲に耐性を示
す。この実験において、胃模擬汁米国第２１改正局方
（ＨＣ＋ペプシン）を３７℃で５時間用いた。

〈合成〉 （０．１モル）を塩化メチレンに溶解し、０℃に冷却
し、Ｎ−メチルモルホリン（０．１モル）に加えた。

溶液を−１５℃±１に冷却し、イソブチルクロロホルメ
ート（０．１モル）を攪拌下に−１５℃の温度に維持し
ながら加えた。反応混合物をこの温度で１５分間攪拌し
た後、ジメチルホルムアミド中グルタミン酸−ジベンジ
ルエステル−ｐ−トシレート（０．１モル）およびＮ−
メチルモルホリン（ＮＭＭ）の予め冷却した溶液をゆっ
くり加え、反応混合物を一夜攪拌した。溶媒を減圧下で
除去し、残渣を酢酸エチルにとかした。酢酸エチルを
水、１Ｎ塩酸、５％重炭酸ナトリウム水溶液および水で
洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し
た。生成物はシロップである。ＴＬＣシステムＣＨＣ
_３：ＭｅＯＨ：ＨＯＡｃ（９０：８：２）。純度９５
％、収率８０％。

前記(1)を１ｇ当り５０％トリフルオロ酢酸−塩化メチ
レン混合物（１：１）１０ｍで３０分間脱保護反応に
付した。これを減圧下に蒸発させ、エーテルでトリチュ
レートし、濾過し、エーテルで洗浄し、真空下で乾燥さ
せた。収率９８％。

をＮＭＭで中和し、ジメチルホルムアミド−テトラヒド
ロフラン混合物中Ｚ３−Ａｒｇに、ＮＭＭおよびイソブ
チルクロロホルメートを用いて結合させ、(1)と同様に
処理した。収率６０％。ＴＬＣシステムＣＨＣ_３：Ｍ
ｅＯＨ（９２：８）。１つの大きなスポット。

上記トリペプチドを酢酸−水メタノール混合物中、pd/c
の存在下にその完結まで水素添加させた。これを触媒か
ら濾過し、濾液を真空下に蒸発させた。

生成物、トリペプチドをＮ−ブタノール：酢酸：水
（４：１：５）システムを用い向流分配で精製した。収
率５０％。ＴＬＣシステム−ブタノール：酢酸：水：ピ
リジン（３２：６：２２：２０）。１つの大きなスポッ
ト。ＨＰＬＣ９７％。

〈生物学的活性〉 １−Ａ ＴＨＹ１．２抗原のイン・ビトロ誘発 リンパ球発現Ｔ細胞マーカーへのマウスＴ細胞前駆体の
分化をイン・ビトロで誘発するＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
の能力をＴｈｙ膜抗原の誘発を立証することでテストし
た。

物質および方法 マウス：特定の病原菌非存在条件下に維持されたＣ３Ｈ
／Ｈｅ環境上で交配された８週令の無胸腺症(nu/nu)マ
ウスを用いた。

細胞の調整：マウスを頚部脱臼で殺した。脾臓を無菌状
態で取り出し、最後にハンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）
（ギブコ(Gibco)社、パイスリー）、スコットランド）
中、ピンセットで細かくした。脾臓細胞を洗浄し、１％
ＢＳＡ（ボエリンガー・マンハイム(Boehringer Mannhe
im)およびゲンタマイシン１００μｇ／ｍを補足した
１９９培地（キブコ社）中に再懸濁させ、ジュリウス(J
ulius)らの方法［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イ
ムノロジイ(Eur.J.Immunol)３、６４５、１９７３］に
従い平衡ナイロンウールカラム中で４５分間インキュベ
ートした。前駆体Ｔ細胞が富化した流出(effluent)細胞
群をバイオアッセイに用いた。

誘導バイオアッセイ：0.1ｍの培地中０．５×１０^６
流出細胞を０．１ｍのトリペプチドと共にまたは培地
単独で、３７℃１８時間インキュベートした。培養を２
連で行った。インキュベーションの終了時において、細
胞を０．８７％塩化アンモニウムで洗浄して赤血球を溶
解し、ついでＨＢＳＳで洗浄した。

膜Ｔｈｙ１．２抗原の誘発は直接免疫けい光法で測定し
た。

直接免疫けい光法：細胞をフルオロレスセイン結合モノ
クロナール抗体［バイオ−イエダ(Bio-Yeda)）と共に
１：２００の希釈比で、４℃にて２０分間インキュベー
トした。混合物を３００ｇで５分間遠心分離し、ＨＢＳ
Ｓで２回洗浄し、ついで懸濁させて、けい光顕微鏡（ラ
イツ・オルソプラン(Leitz Orthoplan)）で計数した。
トリペプチドを含む培養物と含まない培養物の間のけい
光化細胞の割合の差によって、生産物の誘導活性が得ら
れる。

第１表に示すように、トリペプチドは１μｇ／ｍにお
ける最適応答で未成熟Ｔ細胞に対するマーカーＴｈｙ
１．２の出現を誘導する。用量−応答の相関曲線は、該
ペプチドの低濃度および高濃度の両方においてより小さ
い誘発が誘導されるような、ベル形である。

結果を第１表に示す。

１−Ｂ ＴＨＹ１．２抗原のイン・ビボ誘発 ＥＬＳ１を４日間連続して投与し、この後マウスにて２
４時間休息を与え、ついで脾臓を採取し、細胞をけい光
法によりＴｈｙ１．２抗原の発現について調べた。対照
マウスには薬剤を溶解した培地１９９（Ｍ１９９）を与
えた。マウスの平均体重は約２４ｇであった。

結果を第２表に示す。

データによれば、ＥＬＳ１（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）
は経口および腹腔内投与の両方の後脾細胞の成熟を誘発
できることが判明した。

最適投与量は２１１０μｇ／kgである一方、投与量を多
くすればプラトー応答が観察される。

２．リンホカイン生産物のイン・ビトロ刺激 物質および方法 ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製 末梢神経を静脈穿刺により健康な献血者から得る。赤血
球を白血球からフイコール・ハイパキュー(Ficall-Hipa
que)勾配で分離する。軟層（ＰＢＭＣ）を除去し、洗浄
し、細胞をＲＰＭＩ１６４０中に、１×１０^６細胞／ｍ
で再懸濁し、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、
１％グルタミンおよび１％熱不活化インキュベート胎児
ウシ血清（ＦＣＳ、５６℃、３０分）を補足する。

成長因子の調製 １％熱不活化ＦＣＳ中ＰＢＭＣ１×１０^６細胞／ｍを
0.75％濃度（Ｖ／Ｖ）のフィトヘムアグルチニン（ＰＨ
Ａ）を用いるかまたは用いないでインキュベートする。
テストされるペプチドを濃度１μｇ／ｍで適当な培地
に加える。インキュベーション期間は湿潤雰囲気中、３
７℃で１８〜２４時間である。培養細胞を０．２２ｍＭ
のフィルターに通してろ過し、上澄液を成長因子の存在
について調べる。

上澄液中の成長因子の測定 Ａ．テスト細胞 Ｂ細胞成長因子（ＢＣＧＦ）の存在のテストに使用され
るＢ細胞はＢＣＧＦ上に維持された長期間培養セルライ
ンであり、およびＥＢＶネガテイブ(negative)である。
これらの細胞を血清非含有培地の中で、ニュートリドマ
(Nutridoma)（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルズ）を用いて増殖させたが、ＩＬ−２に対し応答し
ない。

ＩＬ−２の存在のテストに使用されるＴ細胞を新鮮な状
態で単離する。これらを、まず０．７５％ＰＨＡで刺激
し、基底値を減少させ、かつＩＬ−２の依存性を確立す
るために使用前に少なくとも１０日間培地中に維持す
る。

Ｂ．アッセイに用いるテスト細胞の調製 ＢＣＧＦの最後の供給後４日のＢ細胞を通常使用す
る。これらをＲＰＭＩ１６４０で４回洗浄して残存し得
るＢＣＧＦをも除去し、ＲＰＭＩ１６４０およびニュー
トリドマ中、１５×１０^４細胞／ｍに調整する（最終
濃度１％）。

ＩＬ−２の最後の供給後４日のＴ細胞を用いる。これ
らを４回洗浄し、５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中、
５０×１０^４細胞／ｍに調製する。

Ｃ．アッセイ手順 長期間培養Ｂ細胞を９６平底マイクロタイター・プレ
ートを用い種々の濃度の、ＰＢＭＣ培養の上澄液とイン
キュベートする。各ウエルは１００μのＢ細胞（１５
×１０^３細胞）および１００μの上澄液を含み、総容
量２００μである。本発明者らは、本発明者らのＢ細
胞の効力について、それらを種々の濃度の精製ＢＣＧＦ
（セルラー・プロダクト(Cellular Products)社、バッ
ファロー、Ｎ．Ｙ．）とインキュベートすることで、調
べた。

培養物を２４時間インキュベートし、この後１μＣｉの
［^３Ｈ−Ｔｄｒ］を添加し、ついで付加的に１２時間イ
ンキュベートする。ついで、培養物を収穫し、シンチレ
ーション・カウンターで計数する。

Ｔ細胞を平底ウエル中でインキュベートする。各ウエ
ルの総容量は２００μで、５０×１０^３のＴ細胞／ウ
エルを含む。インキュベーション期間は１２時間の［^３
Ｈ−Ｔｄｒ］のラベル化を含み、７２時間である。

結果 成長因子生産 ＲＮＡ合成に対する効果^３ Ｈ−ウリジンの取り込みによって観察されるような、
ヒトＴ細胞におけるＲＮＡ合成に対するＥＬＳ１の効
果、１分当りのカウント数（ＣＰＭ） 結果は２４時間のインキュベーション後に得た。

Ｔ ３７３２ Ｔ＋ＰＨＡ ２０７５２ ＤＮＡ合成に対する効果^３ Ｈ−チミジンの取り込みによって観察されるような、
ヒトＴ細胞におけるＤＮＡ合成に対するＥＬＳ１の効
果、１分当りのカウント数（ＣＰＭ） 結果は３日間のインキュベーション後に得た。

Ｔ １５４ Ｔ＋ＰＨＡ ６０７６ 細胞数のイン・ビトロの増加 ３０日間、５μｇ／ｍの濃度で４日ごとにＴリンパ球
またはＴおよびＢリンパ球の混合物のいずれかの培地に
トリペプチドを加えると、実験の第１０日と１５日の間
に観察されるように対照培地に対し、最大＋５０％で細
胞数を増加させることができる。

毒性 急性毒性 マウスおよびラットに対し行った急性毒性の実験によれ
ば、１０００mg／kgの用量（筋肉内）まで該トリペプチ
ドが毒性作用を全く示さないことが証明された。

耐性 ウサギおよびマウスに対する実験によれば、該生成物は
静脈内または腹腔内各々１００mg／kgの投与量で、いず
れの血行力学的変化および行動的効果をも引き起こさな
かった。特に、ペントバルビタール−誘発睡眠時間は、
わずかな増加だけが示された。

アレルギー誘発活性 該生成物は、１００mg／kgの用量（筋肉内）でモルモッ
トにおいていずれの感作症状も誘発しなかった。

トリペプチドの塩 前記実験はトリペプチドの酢酸塩で行ったが、当該分野
では同様な結果が、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩および
硫酸塩のような他の塩を用いることにより得ることが理
解できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のトリペプチドの高速液体クロマトグラ
フィーの測定結果を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式： Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ で示される構造式を有するＬ−Ａｒｇ（アルギニン）、
   Ｌ−Ｌｙｓ（リジン）およびＬ−Ｇｌｕ（グルタミン
   酸）からなるトリペプチドまたはその医薬上許容される
   塩類。
2. 【請求項２】酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩また
   は硫酸塩である、特許請求の範囲第１項記載のトリペプ
   チドの医薬上許容される塩類。
3. 【請求項３】式： Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ で示される構造式を有するＬ−Ａｒｇ（アルギニン）、
   Ｌ−Ｌｙｓ（リジン）およびＬ−Ｇｌｕ（グルタミン
   酸）からなるトリペプチドまたはその医薬上許容される
   塩類を有効成分として含む免疫刺激剤。