JPH0675510B2 - モラノリン誘導体の製法 - Google Patents
モラノリン誘導体の製法Info
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- JPH0675510B2 JPH0675510B2 JP2031922A JP3192290A JPH0675510B2 JP H0675510 B2 JPH0675510 B2 JP H0675510B2 JP 2031922 A JP2031922 A JP 2031922A JP 3192290 A JP3192290 A JP 3192290A JP H0675510 B2 JPH0675510 B2 JP H0675510B2
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Description
本発明は、次の一般式〔Ｉ〕で表される、医薬品として
有用な、Ｎ−置換モラノリン誘導体の効率的かつ低廉な
取得方法に関する。 ここにＲは、水素又は低級アルキルを表す。 一般式〔Ｉ〕においてＲが水素の物質は、モラノリンと
して最初、生薬桑白皮より抽出され医薬品としての有用
性が確認されたものである（八木ら「日本農芸化学会
誌」〔50,571,（1976）〕。一般式〔Ｉ〕においてＲが
低級アルキルのものは、例えば特公昭59−43459号（特
許第1268030号）等により血糖上昇抑制等の薬理作用と
ともに公知にされている化合物である。 本発明に係る化合物はその後、抗ウイルス作用のあるこ
とが確認されており（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9229P 1
988）、医薬品としての重要性は非常に高いものであ
る。
有用な、Ｎ−置換モラノリン誘導体の効率的かつ低廉な
取得方法に関する。 ここにＲは、水素又は低級アルキルを表す。 一般式〔Ｉ〕においてＲが水素の物質は、モラノリンと
して最初、生薬桑白皮より抽出され医薬品としての有用
性が確認されたものである（八木ら「日本農芸化学会
誌」〔50,571,（1976）〕。一般式〔Ｉ〕においてＲが
低級アルキルのものは、例えば特公昭59−43459号（特
許第1268030号）等により血糖上昇抑制等の薬理作用と
ともに公知にされている化合物である。 本発明に係る化合物はその後、抗ウイルス作用のあるこ
とが確認されており（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9229P 1
988）、医薬品としての重要性は非常に高いものであ
る。
モラノリンは、モラノリン産生菌を培養することにより
取得する方法が確立されている（特公昭56−099195号
等）。 一般式〔Ｉ〕においてＲが低級アルキルであるものは、
モラノリンを通常の方法により、例えば、適当なアルキ
ル化剤（例えば、アルキルハライド等）を反応させる方
法、Ｎ−アシル化した後に還元してＮ−アルキル体とす
る方法、アルキルアルデヒドと還元剤を作用させる方法
等により、随時取得することができた。 ところで、上記したこれまでの方法を適用させるために
は、モラノリンをいったん純粋な形で取得することが必
須であった。 本発明者らは、モラノリンの高産生能を有する菌株を取
得するべく研究を重ね、多数の成果を挙げたが、これら
によるモラノリン産生培養液中には、目的物たるモラノ
リンの他、1,5−ジデオキシ−1,5−イミノ−Ｄ−マンニ
トールや２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンニトール
等の複数の低分子の塩基性水溶性物質が含まれているこ
とが判った。 これまでは、培養液中からモラノリンを取得するため
に、例えば、イオン交換法、活性炭素吸着法、セファデ
ックス、セルロース、シリカゲル等のカラムクロマト分
画等を適用して精製してきた。 これらの方法はなるほどモラノリンを単離する方法とし
ては順当なものではあったが、今日のように、モラノリ
ンが医薬品として又は医薬品の原料として極めて重要な
物質であることが判明してくると、更に効率よい方法が
望まれるようになり、高産生能を有する菌株の発見によ
り、培養液中からの目的物たるモラノリンの単離方法が
極めて重要な技術的課題として注目されるに到った。
取得する方法が確立されている（特公昭56−099195号
等）。 一般式〔Ｉ〕においてＲが低級アルキルであるものは、
モラノリンを通常の方法により、例えば、適当なアルキ
ル化剤（例えば、アルキルハライド等）を反応させる方
法、Ｎ−アシル化した後に還元してＮ−アルキル体とす
る方法、アルキルアルデヒドと還元剤を作用させる方法
等により、随時取得することができた。 ところで、上記したこれまでの方法を適用させるために
は、モラノリンをいったん純粋な形で取得することが必
須であった。 本発明者らは、モラノリンの高産生能を有する菌株を取
得するべく研究を重ね、多数の成果を挙げたが、これら
によるモラノリン産生培養液中には、目的物たるモラノ
リンの他、1,5−ジデオキシ−1,5−イミノ−Ｄ−マンニ
トールや２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンニトール
等の複数の低分子の塩基性水溶性物質が含まれているこ
とが判った。 これまでは、培養液中からモラノリンを取得するため
に、例えば、イオン交換法、活性炭素吸着法、セファデ
ックス、セルロース、シリカゲル等のカラムクロマト分
画等を適用して精製してきた。 これらの方法はなるほどモラノリンを単離する方法とし
ては順当なものではあったが、今日のように、モラノリ
ンが医薬品として又は医薬品の原料として極めて重要な
物質であることが判明してくると、更に効率よい方法が
望まれるようになり、高産生能を有する菌株の発見によ
り、培養液中からの目的物たるモラノリンの単離方法が
極めて重要な技術的課題として注目されるに到った。
従って、本発明の目的は、一般式〔Ｉ〕で表される化合
物を効率よい方法により取得することにあった。
物を効率よい方法により取得することにあった。
本発明者らは、上記課題解決のため鋭意研究を重ねた結
果、サイクロデキストリングリコシルトランスフェラ
ーゼ（CGTase）による糖転移反応は、モラノリン及びＮ
−低級アルキルモラノリンには反応するが、混在する塩
基性物質には反応しないこと、上記反応により取得さ
れるモラノリン及びＮ−置換モラノリン誘導体のグルコ
ースオリゴマーは、本発明者らの開示した方法により
（特公昭60−2038号公報）、容易にグルコシルモラノリ
ン及びグルコシル−Ｎ−低級アルキルモラノリンに変換
しうること、グルコシルモラノリン及びグルコシル−
Ｎ−低級アルキルモラノリンは本発明者らの開示した方
法により（特開昭62−242691号公報）、容易に単離しう
ること、グルコシルモラノリン及びグルコシル−Ｎ−
低級アルキルモラノリンは、酸又はグルコアミラーゼ
（GA）によりモラノリン及びＮ−低級アルキルモラノリ
ンに誘導しうること、等に着目し、これらの過程を経て
ゆけば、培養液から高収率で目的物を取得することがで
きることに想到した。 更に、実に意外なことではあったが、上記した過程を研
究するうち本発明者らは、モラノリン等をCGTaseにより
糖転移反応にかける際、及びその後モラノリン等のグル
コースオリゴマーをGAによってグルコシルモラノリン等
に誘導する際の酵素反応において、基質であるモラノリ
ン等の存在により、酵素活性が非常に安定化される事実
に遭遇した。このことは、後に更に詳しく説明する。 本発明は上記新知見を見出したことにより、初めて完成
をみた発明である。 以下に、本発明の構成を更に詳しく説明する。 本発明においては、まずモラノリンを産生する菌を培養
する。このような菌としては放線菌を挙げることがで
き、例えば本発明者らは特公昭56−9919号公報で開示し
た菌（微工研菌寄第4301号）等を用いることができる。 培養液中には、目的物たるモラノリンのほか、前述した
ように、1,5−ジデオキシ−1,5−イミノ−Ｄ−マンニト
ールや２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンニトール等
の複数の低分子の塩基性水溶性物質が混在することとな
る。 最終目的物としてＮ−低級アルキルモラノリンを取得し
たい場合には、この培養液をアルキル化反応に掛ける。 本発明において低級アルキルとは、例えば、メチル、エ
チル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、iso
−ブチル、tert−ブチル等を挙げることができる。 アルキル化は、例えば、適当なアルキル化剤（例えば、
アルキルハライド等）を反応させる方法を適用すること
ができる。 培養液中には、この状態ではＮ−低級アルキルモラノリ
ンのほか、Ｎ−低級アルキル−1,5−ジデオキシ−1,5−
イミノ−Ｄ−マンニトールやＮ−低級アルキル−２−ア
ミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンニトール等が混在すると
ころとなる。 本発明においては、その後、澱粉、デキストリン、サイ
クロデキストリン等のグルコースの供与体を培養液中に
加える。その後、サイクロデキストリングルコシルトラ
ンスフェラーゼ（CGTase）によって一般式〔II〕 （ここにＲは、前記と同じ。ｎは０から24までの整数を
表す）で表されるグルコースオリゴマーに変換し、その
後必要に応じてグルコアミラーゼ（GA）によって、一般
式〔II〕においてｎが０である化合物（グルコシル体）
に変換する。 一般式〔II〕においてＲが水素の化合物については、GA
を作用させるのが最も良い。後述するように一般式〔I
I〕においてＲが水素でｎが０である化合物（グルコシ
ルモラノリン）はメタノールとの分子化合物を形成して
分別結晶することができるという特異的性質があるから
である。 GAを作用させる必要のない場合には、収量を上げたり操
作の利便の目的のためにGA反応を省略することができ
る。 この過程において、混在する1,5−ジデオキシ−1,5−イ
ミノ−Ｄ−マンニトールや２−アミノ−２−デオキシ−
Ｄ−マンニトール、及びこれらのＮ−低級アルキル化物
は、CGTase等の作用を受けることがない。 上記したCGTase及びGAに基づく反応は酵素反応であり、
本発明の重要な要旨のひとつは、後述するようにこの酵
素反応を有利に実行することができる手法を確立したと
ころに存在する。 上記によって取得した〔II〕で表される化合物は、本発
明の目的化合物についてのみ生成する。〔II〕は、一般
式〔Ｉ〕で表される化合物に比して、例えば、分別結晶
という経済的な操作で非常に効率的に単離することがで
きる。これは〔II〕が〔Ｉ〕のグルコースオリゴマーで
あることによる物理化学的性質を利用しようとするもの
である。 例えば、グルコシルモラノリンについては、含水メタノ
ール中で攪拌することにより、メタノールとの分子化合
物を形成するから、非常に効率的に結晶化することがで
きるし、またＮ−低級アルキルモラノリンについては、
アリールスルホン酸を用いて、同様に非常に効率的に結
晶化することができる。 また、この反応においては、母液から〔II〕化合物を回
収した後にも、再度その残渣を原料として同じ操作を繰
り返すことにより、未回収の化合物〔II〕を容易に回収
することができるから、最終的な回収率を高めることが
できる。 このように、本発明の目的は混在物からの効率的な単離
にあり、〔II〕に誘導するのもその単離を高収率化する
ためであって、本発明の効果はこの時点で発揮されると
ころとなる。 上記の単離方法としては、例えば、本発明者らの発明に
係る特開昭61−115093号公報記載の方法等を適用するこ
とができる。 上記により取得された〔II〕は、更に、例えば塩酸水溶
液等の酸性水溶液中で加熱して加水分解することによ
り、又は過剰のGAを作用させて、モラノリン又はＮ−低
級アルキルモラノリンとグルコースとに分解することが
できる。 グルコースは中性物質であり、目的物は塩基性であるか
ら、例えば、強酸性イオン交換樹脂にかけて常法により
処理することにより、目的物のみを取得することができ
る。これらの実施にあたっては、本発明者らの発明に係
る特開昭62−242691号公報、特開昭62−242692号公報に
開示された方法を適用することができる。 この場合において、もし最終目的物を他の化合物に誘導
する反応に供するときには、必ずしも結晶化する必要は
ない。〔II〕化合物を加水分解した後においては、目的
物は、事実上合成反応に供することができるほどの純度
を有しているから、そのまま合成反応に適用することが
できる。 さて、以下に本発明の重要な要旨である、本発明に係る
酵素反応について述べる。 酵素反応の技術についての近年の技術的進歩は目覚まし
く、まさに隔世の感があり、ことにキトサンビーズを応
用した固定化酵素法は、例えば溶液中での酵素反応等の
これまでの従来方法に比べ使用酵素量が少なくて済む点
や効率的な反応を行うことができる点で格段の効果があ
った。 キトサンビーズ応用の固定化酵素法については複数の特
許出願がなされており、例えば、特開昭63−196290号公
報には、多孔質のキトサンビーズに、サイクロデキスト
リングルカノトランスフェラーゼを固定化させた後、さ
らに架橋剤で架橋処理する技術が開示されている。 本発明においても、固定化酵素法を適用することができ
る。 本発明において適用する固定化酵素の製造法について例
示すると、架橋剤をまずキトサンビーズと反応させて、
キトサンビーズ表面のアミノ基に架橋を形成させる。そ
の後、本発明に係るCGTase又はGAを架橋剤の末端に固定
する。 本発明に係る架橋剤として、例えば、グルタールアルデ
ヒド等を用いることができる。 本発明に係るキトサンビーズとしては、例えば、キトパ
ール（富士紡績（株）製）BCW−1000シリーズ等を使用
することができる。本発明に係る固定化酵素を生成させ
るためには、例えば適当な温度（例、室温）で適当な緩
衝液（例、pH6.0の0.1M酢酸バッファ）中に上記キトサ
ンビーズを加え、緩やかに振盪し、適当な濃度（例、25
W/V％）のグルタールアルデヒドを加え、適当な時間
（例、１〜48時間）、緩やかに振盪した後、濾過し、水
洗した後、適当な緩衝液（例pH6.0の0.025M酢酸バッフ
ァ）中で、適当な濃度（例１〜500mg/ml）のCGTase溶液
を加え、適当な時間（例１〜48時間）緩やかに振盪した
後、濾過し水洗して得ることができる。 上記の方法は、本発明者らによって初めて確立された手
法であって、これにより上記特開昭63−196290号公報に
開示された技術を使用しなくても固定化酵素法を実施す
ることができる。 以下に、本発明の実施に関する重要な新知見について詳
述する。 本発明者らは、本発明を完成させる過程で、上記した本
発明に係る酵素反応において、本発明に係るモラノリン
又はＮ−置換モラノリン誘導体、又はこれらのグルコー
スオリゴマーが存在すると、当該酵素反応が安定化し、
一定時間を経過してもその酵素活性が減衰しない、とい
う驚くべき新知見を見出した。 例えば、固定化CGTaseにおいては、55℃で366日経過し
ても初期活性の90％以上を保持することができ、固定化
GAでは、55℃で43日経過しても初期活性の80％以上、50
℃、175日では80％以上、40℃、133日では90％以上を保
持することができる。 この事実がいかなる理由により生じるかについては必ず
しも定かではないが、酵素反応の基質は酵素反応に対し
ては阻害剤として働くことから、この阻害作用との関係
において何らかの機能が発揮されているものと推測する
ことができる。 上記の知見は、この明細書において初めて開示する事実
である。 このことにより、固定化酵素は極めて安定化され、本発
明に適用するに際して、有利な条件を提供するところと
なる。
果、サイクロデキストリングリコシルトランスフェラ
ーゼ（CGTase）による糖転移反応は、モラノリン及びＮ
−低級アルキルモラノリンには反応するが、混在する塩
基性物質には反応しないこと、上記反応により取得さ
れるモラノリン及びＮ−置換モラノリン誘導体のグルコ
ースオリゴマーは、本発明者らの開示した方法により
（特公昭60−2038号公報）、容易にグルコシルモラノリ
ン及びグルコシル−Ｎ−低級アルキルモラノリンに変換
しうること、グルコシルモラノリン及びグルコシル−
Ｎ−低級アルキルモラノリンは本発明者らの開示した方
法により（特開昭62−242691号公報）、容易に単離しう
ること、グルコシルモラノリン及びグルコシル−Ｎ−
低級アルキルモラノリンは、酸又はグルコアミラーゼ
（GA）によりモラノリン及びＮ−低級アルキルモラノリ
ンに誘導しうること、等に着目し、これらの過程を経て
ゆけば、培養液から高収率で目的物を取得することがで
きることに想到した。 更に、実に意外なことではあったが、上記した過程を研
究するうち本発明者らは、モラノリン等をCGTaseにより
糖転移反応にかける際、及びその後モラノリン等のグル
コースオリゴマーをGAによってグルコシルモラノリン等
に誘導する際の酵素反応において、基質であるモラノリ
ン等の存在により、酵素活性が非常に安定化される事実
に遭遇した。このことは、後に更に詳しく説明する。 本発明は上記新知見を見出したことにより、初めて完成
をみた発明である。 以下に、本発明の構成を更に詳しく説明する。 本発明においては、まずモラノリンを産生する菌を培養
する。このような菌としては放線菌を挙げることがで
き、例えば本発明者らは特公昭56−9919号公報で開示し
た菌（微工研菌寄第4301号）等を用いることができる。 培養液中には、目的物たるモラノリンのほか、前述した
ように、1,5−ジデオキシ−1,5−イミノ−Ｄ−マンニト
ールや２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンニトール等
の複数の低分子の塩基性水溶性物質が混在することとな
る。 最終目的物としてＮ−低級アルキルモラノリンを取得し
たい場合には、この培養液をアルキル化反応に掛ける。 本発明において低級アルキルとは、例えば、メチル、エ
チル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、iso
−ブチル、tert−ブチル等を挙げることができる。 アルキル化は、例えば、適当なアルキル化剤（例えば、
アルキルハライド等）を反応させる方法を適用すること
ができる。 培養液中には、この状態ではＮ−低級アルキルモラノリ
ンのほか、Ｎ−低級アルキル−1,5−ジデオキシ−1,5−
イミノ−Ｄ−マンニトールやＮ−低級アルキル−２−ア
ミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンニトール等が混在すると
ころとなる。 本発明においては、その後、澱粉、デキストリン、サイ
クロデキストリン等のグルコースの供与体を培養液中に
加える。その後、サイクロデキストリングルコシルトラ
ンスフェラーゼ（CGTase）によって一般式〔II〕 （ここにＲは、前記と同じ。ｎは０から24までの整数を
表す）で表されるグルコースオリゴマーに変換し、その
後必要に応じてグルコアミラーゼ（GA）によって、一般
式〔II〕においてｎが０である化合物（グルコシル体）
に変換する。 一般式〔II〕においてＲが水素の化合物については、GA
を作用させるのが最も良い。後述するように一般式〔I
I〕においてＲが水素でｎが０である化合物（グルコシ
ルモラノリン）はメタノールとの分子化合物を形成して
分別結晶することができるという特異的性質があるから
である。 GAを作用させる必要のない場合には、収量を上げたり操
作の利便の目的のためにGA反応を省略することができ
る。 この過程において、混在する1,5−ジデオキシ−1,5−イ
ミノ−Ｄ−マンニトールや２−アミノ−２−デオキシ−
Ｄ−マンニトール、及びこれらのＮ−低級アルキル化物
は、CGTase等の作用を受けることがない。 上記したCGTase及びGAに基づく反応は酵素反応であり、
本発明の重要な要旨のひとつは、後述するようにこの酵
素反応を有利に実行することができる手法を確立したと
ころに存在する。 上記によって取得した〔II〕で表される化合物は、本発
明の目的化合物についてのみ生成する。〔II〕は、一般
式〔Ｉ〕で表される化合物に比して、例えば、分別結晶
という経済的な操作で非常に効率的に単離することがで
きる。これは〔II〕が〔Ｉ〕のグルコースオリゴマーで
あることによる物理化学的性質を利用しようとするもの
である。 例えば、グルコシルモラノリンについては、含水メタノ
ール中で攪拌することにより、メタノールとの分子化合
物を形成するから、非常に効率的に結晶化することがで
きるし、またＮ−低級アルキルモラノリンについては、
アリールスルホン酸を用いて、同様に非常に効率的に結
晶化することができる。 また、この反応においては、母液から〔II〕化合物を回
収した後にも、再度その残渣を原料として同じ操作を繰
り返すことにより、未回収の化合物〔II〕を容易に回収
することができるから、最終的な回収率を高めることが
できる。 このように、本発明の目的は混在物からの効率的な単離
にあり、〔II〕に誘導するのもその単離を高収率化する
ためであって、本発明の効果はこの時点で発揮されると
ころとなる。 上記の単離方法としては、例えば、本発明者らの発明に
係る特開昭61−115093号公報記載の方法等を適用するこ
とができる。 上記により取得された〔II〕は、更に、例えば塩酸水溶
液等の酸性水溶液中で加熱して加水分解することによ
り、又は過剰のGAを作用させて、モラノリン又はＮ−低
級アルキルモラノリンとグルコースとに分解することが
できる。 グルコースは中性物質であり、目的物は塩基性であるか
ら、例えば、強酸性イオン交換樹脂にかけて常法により
処理することにより、目的物のみを取得することができ
る。これらの実施にあたっては、本発明者らの発明に係
る特開昭62−242691号公報、特開昭62−242692号公報に
開示された方法を適用することができる。 この場合において、もし最終目的物を他の化合物に誘導
する反応に供するときには、必ずしも結晶化する必要は
ない。〔II〕化合物を加水分解した後においては、目的
物は、事実上合成反応に供することができるほどの純度
を有しているから、そのまま合成反応に適用することが
できる。 さて、以下に本発明の重要な要旨である、本発明に係る
酵素反応について述べる。 酵素反応の技術についての近年の技術的進歩は目覚まし
く、まさに隔世の感があり、ことにキトサンビーズを応
用した固定化酵素法は、例えば溶液中での酵素反応等の
これまでの従来方法に比べ使用酵素量が少なくて済む点
や効率的な反応を行うことができる点で格段の効果があ
った。 キトサンビーズ応用の固定化酵素法については複数の特
許出願がなされており、例えば、特開昭63−196290号公
報には、多孔質のキトサンビーズに、サイクロデキスト
リングルカノトランスフェラーゼを固定化させた後、さ
らに架橋剤で架橋処理する技術が開示されている。 本発明においても、固定化酵素法を適用することができ
る。 本発明において適用する固定化酵素の製造法について例
示すると、架橋剤をまずキトサンビーズと反応させて、
キトサンビーズ表面のアミノ基に架橋を形成させる。そ
の後、本発明に係るCGTase又はGAを架橋剤の末端に固定
する。 本発明に係る架橋剤として、例えば、グルタールアルデ
ヒド等を用いることができる。 本発明に係るキトサンビーズとしては、例えば、キトパ
ール（富士紡績（株）製）BCW−1000シリーズ等を使用
することができる。本発明に係る固定化酵素を生成させ
るためには、例えば適当な温度（例、室温）で適当な緩
衝液（例、pH6.0の0.1M酢酸バッファ）中に上記キトサ
ンビーズを加え、緩やかに振盪し、適当な濃度（例、25
W/V％）のグルタールアルデヒドを加え、適当な時間
（例、１〜48時間）、緩やかに振盪した後、濾過し、水
洗した後、適当な緩衝液（例pH6.0の0.025M酢酸バッフ
ァ）中で、適当な濃度（例１〜500mg/ml）のCGTase溶液
を加え、適当な時間（例１〜48時間）緩やかに振盪した
後、濾過し水洗して得ることができる。 上記の方法は、本発明者らによって初めて確立された手
法であって、これにより上記特開昭63−196290号公報に
開示された技術を使用しなくても固定化酵素法を実施す
ることができる。 以下に、本発明の実施に関する重要な新知見について詳
述する。 本発明者らは、本発明を完成させる過程で、上記した本
発明に係る酵素反応において、本発明に係るモラノリン
又はＮ−置換モラノリン誘導体、又はこれらのグルコー
スオリゴマーが存在すると、当該酵素反応が安定化し、
一定時間を経過してもその酵素活性が減衰しない、とい
う驚くべき新知見を見出した。 例えば、固定化CGTaseにおいては、55℃で366日経過し
ても初期活性の90％以上を保持することができ、固定化
GAでは、55℃で43日経過しても初期活性の80％以上、50
℃、175日では80％以上、40℃、133日では90％以上を保
持することができる。 この事実がいかなる理由により生じるかについては必ず
しも定かではないが、酵素反応の基質は酵素反応に対し
ては阻害剤として働くことから、この阻害作用との関係
において何らかの機能が発揮されているものと推測する
ことができる。 上記の知見は、この明細書において初めて開示する事実
である。 このことにより、固定化酵素は極めて安定化され、本発
明に適用するに際して、有利な条件を提供するところと
なる。
以下に、本発明に係る参考例及び実施例を掲げて、本発
明を更に詳しく説明する。 参考例１ CGTaseの固定化（１） 10lの富士紡績社製キトパールBCW−3010を2.5w/v％グル
タールアルデヒドを含む0.1M酢酸緩衝液（pH6.0）40l
に、室温で24時間浸漬処理した後、充分にイオン交換水
で洗浄した。ついでキトパール1ml当たり蛋白質20mg相
当のCGTase（林原生物化学研究所社製。バチルス・ステ
ロサーモフィリス（Bacillus stearothermophilus）由
来〕を加えて、さらに酢酸緩衝液（pH6.0）を最終濃度
が0.025Mになるように加えて、全液量が30lになるよう
にした。このまま室温で24時間浸漬してその後イオン交
換水で充分洗浄して、固定化CGTaseを得た。得られたビ
ーズの蛋白吸着量は、19.5mg/ml（ビーズ）であった。 参考例２ CGTaseの固定化（２） 参考例１と同様にして、蛋白質吸着量5mg/ml（ビーズ）
となるように、バチルス・ステロサーモフィリス（Baci
llus stearothermophilus）由来のCGTaseを固定化し
た。 参考例３ GAの固定化 天野製薬社製グルコザイムNL−３を透析した後、60〜65
mg/mlの蛋白質濃度にしたものをGA水溶液として用い
た。 富士紡績社製キトパールBCW−3010の１を2.5w/v％グ
ルタールアルデヒドを含む50mM酢酸緩衝液（pH5.0）3l
に室温で24時間浸漬処理した後、充分イオン交換水で洗
浄した。ついで、キトパール1ml当たり蛋白質100mg相当
のGA水溶液を加え、さらに水を加えて、全液量が3lにな
るようにした。このまま室温で24時間浸漬して、その後
イオン交換水で充分洗浄して固定化GAを得た。得られた
ビーズの蛋白質吸着量は、12.8mg/ml（ビーズ）であっ
た。 参考例４ 固定化CGTaseの安定化（モラノリンの糖転移反応） モラノリン2.5w/v％、アミコールNo.6L〔日澱化学社
製〕25w/v％、pH未調整の水溶液100mlに、参考例１で得
た固定化CGTaseを10ml加え、55℃で回転振盪を続けた。
一定時間経過後にグラスフィルターでビーズ（固定化CG
Tase）を濾過し充分水洗した後、次のようにして固定化
CGTaseの酵素活性を測定した。 （固定化CGTaseの酵素活性測定法） モラノリン2.5w/v％、アミコールNo.6L25w/v％、pH未調
整の水溶液10mlにビーズ（55℃で一定時間経過後の洗浄
固定化CGTase）1mlを加え、55℃で24時間反応させた。
反応液3mlを強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W×２
（H+）7mlに通過させ、充分水洗後、0.5Nアンモニア水
で溶出し、溶出液を減圧下に濃縮乾固して、3mlの水に
溶かし、その10μｌを高速液体クロマトグラフィーに注
入して分析し、未反応のモラノリンの濃度を求めた。高
速液体クロマトグラフィーの分析条件は、カラム（Nucl
eosil NH2、５μｍ、4mm i.d.×25cm）、展開溶媒（ア
セトニトリル−水＝70:30）、検出器（日立655A−30,RI
検出器）、データプロセッサー（日立 Ｄ−2000）。 55℃で回転振盪を開始した時点の反応進行率を100とし
た場合の一定時間経過後の相対的な反応進行率を上記式
により算出し、この値をもって酵素活性保持率とした。
結果を表１に示す。固定化CGTaseが本発明に係るモラノ
リンによって酵素活性が安定化された事実が明白であ
る。 参考例５ 固定化CGTaseの安定化（Ｎ−メチルモラノリンの糖転移
連続反応） 直径1cmのジャケット付きカラムに参考例１で得た固定
化CGTaseの20mlを充填し、Ｎ−メチルモラノリン、1.5w
/v％、可溶性澱粉9w/v％、pH未調整の溶液を160ml/日の
通過速度で55℃で連続的に通過反応させ、経時的に通過
液の反応進行率を求めた。反応進行率、活性保持率は参
考例４と同様にして求めた。その結果、140日を経過し
ても、ほぼ100％の活性を保持していることが判った。 参考例６ 固定化CGTaseの安定化（モラノリン、モラノリンのグル
コースオリゴマー） 参考例２で得た固定化CGTaseの1mlにモラノリン（2.5w/
v％）、モラノリンのグルコースオリゴマー（混合物）
（5.0w/v％）を加え、全容10mlで55℃で振盪した。モラ
ノリンのグルコースオリゴマーは、実施例７で得た糖転
移反応液を強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W×２
（H+）で処理し、充分水洗した後、0.5Nアンモニア水で
溶出後、溶出後を濃縮乾固した塩基製フラクションであ
る。 調整時の酵素活性を100としたときの残存酵素活性保持
率（％）を表２に示した。酵素活性の測定方法等はすべ
て参考例４と同様にした。 モラノリン、モラノリンのグルコースオリゴマーにCGTa
seの活性を保持する作用があることが明白である。 参考例７ 固定化酵素CGTaseの安定化（Ｎ−置換モラノリン、Ｎ−
置換グルコシルモラノリン） 参考例１で得た固定化CGTase1mlに、Ｎ−置換モラノリ
ン（0.5w/v％）、Ｎ−置換グルコシルモラノリン（0.5w
/v％）を加え、全容10mlで55℃で14日間振盪した後、残
存酵素活性を測定した。最初の酵素活性を100としたと
きの残存酵素活性率を表３に示した。酵素活性の測定方
法は参考例４と同じである。 本発明化合物が、良好なる安定化作用を示していること
は明白である。 参考例８ 固定化GAの安定化（モラノリンの糖転移反応液） 実施例７の方法によって製造した未反応のモラノリン、
未反応のアミコールNo.6L、オリゴグリコシルモラノリ
ンを含む反応液を、硫酸を用いてpH5.2に調整した水溶
液を、参考例３で得た固定GA20mlを充填した直径1cmの
ジャケット付カラムに480ml/日の通過速度で、50℃で連
続的に通過反応させた。一定時間反応させた後、カラム
内の固定化GAをとり、次の方法で酵素活性を測定し、反
応開始時の酵素活性を100％としたときの活性保持率
（安定性）を求めた。結果を表４に示した。（固定化GA
の活性測定法） 固定化GAの一定量（湿重量30〜80mg）を、Ｇ−２のグラ
スフィルター上にとり、軽く吸引して水分を濾過した
後、グラスフィルター上の固定化GAをレンズペーパー上
に乗せて過剰の水分を除去した後、栓つきサンプル瓶に
入れ、固定化GAの湿重量を求めた。次に、固定化GAを10
mlの５％マルトース溶液（0.05M酢酸緩衝液、pH4.6）に
加え、37℃で20分間インキュベートした。反応液の100
μｌを0.05Nの水酸化ナトリウム中に加え、反応を停止
させた。 この反応停止液の10μｌを用いてグルコースを定量し
た。グルコースの定量は、ダイヤカラーGC（小野薬品社
製）を用いて行った。 活性は次のように定義した。１分間に１μＭのグルコー
スを生成させる酵素活性を１ユニットとした。ブランク
には反応液のかわりに基質と等容に混合した0.05N水酸
化ナトリウムを用いた。 このとき、固定化GAの活性は、5.56×ODSA／ODSTD／固
定化GAの湿重量。ここでODSAは、サンプル（固定化GA）
の500nmの吸光度、ODSTDは、1mg/mlのグルコース水溶液
の500nmの吸光度を意味する。表４で活性保持率の値が
変動しているが、これは測定誤差である。本発明化合物
の固定化GAに対する安定化作用が明白である。 参考例９ 固定化GAの安定化（モラノリンの糖転移反応液） 参考例８と同様にして40℃で実験した。結果を表５に示
した。 参考例10 GA（水溶液）での安定化（モラノリン、Ｎ−メチルモラ
ノリン） モラノリン、Ｎ−メチルモラノリンは、グルコアミラー
ゼの酵素活性を阻害するので溶液状グルコアミラーゼに
対する安定化効果は次のようにして検討した。酵素は生
化学工業社製のリゾプス・ニベウス（Rhizopus niveu
s）由来の試薬グルコアミラーゼを用いた。 酵素5mgを1mlの0.1M酢酸緩衝液（pH5.0）に溶解したも
のに、モラノリン、Ｎ−メチルモラノリンを6000μg/ml
となるように溶解させ、ネジ口試験管に入れて50℃にて
インキュベートした。それぞれの酵素液は、測定時に0.
1M酢酸緩衝液（pH5.0）で100倍に希釈してその100μｌ
をとり、５％マルトース液（0.05M酢酸緩衝液、pH4.6）
400μｌを加えて40℃で20分間反応させる。その反応液
の100μｌをとり、0.05Nの水酸化ナトリウム100μｌを
加えて反応を停止させる。この中から更に100μｌをと
り、3.0mlのグルコース測定試薬ダイヤカラーGCを加え
て、37℃で30分間静置し発色させ、その後氷冷し、500n
mで吸光度を測定しグルコース量を測定した。このグル
コース産生量を阻害剤共存下での酵素活性とした。初め
の酵素活性（グルコース産生量）を100としたときの相
対的な酵素活性を求めた。結果を図１に示した。本発明
化合物の酵素安定化作用が明白である。 実施例１ モラノリン産生菌の培養 澱粉２％、大豆粉１％、塩化カリウム0.05％、硫酸マグ
ネシウム0.05％、食塩0.2％、炭酸カルシウム0.35％（p
H7.2）の組成の培地200mlを、500ml容三角フラスコに取
り、常法通り滅菌後、これにストレプトミセス・ラベン
デュレ（Streptomyces lavendulae）SEN−158株（微工
研菌寄第4301号）の斜面培養から数白金耳胞子を接種
し、27℃で３日間200回転で振盪培養し、これを種培養
液とした。 澱粉８％、大豆粉３％、酵母エキス1.5％、塩化カリウ
ム0.05％、硫酸マグネシウム七含水塩0.05％、食塩0.1
％、炭酸カルシウム0.15％（pH7.2）の組成の培地250l
を420l容ジャーファーメンターに入れ、常法通り滅菌し
た後、種培養液2.4lを接種した。これを100回転／分、
通気量125l/分、27℃で10日間培養した。参考例４に記
載した方法と同様にして、培養液中のモラノリンを高速
液体クロマトグラフィーによって定量した結果、約3500
μg/mlのモラノリンが含まれていた。 実施例２ モラノリン含有培養液の部分精製（１） 実施例１の方法で得た培養液を、限外濾過膜（UF Modul
e;MU−6303−HG;クラレ社製）にかけ、通過液を更に逆
浸透膜（HR−5155 F1;ホローファイバー型；東洋紡社
製）にかけ、濃縮した非通過液を部分精製品とした。 実施例３ モラノリン含有培養液の部分精製（２） 実施例１の方法で得た培養液をプレスフィルターで濾過
した培養濾液を強酸性イオン交換樹脂ダイヤイオンSK−
104（H+）70lのカラムにかけ、充分水洗後、1Nアンモニ
ア水で溶出した。 溶出液を減圧下に濃縮した後、強塩基性イオン交換樹脂
ダイヤイオンSA−11A（OH-）35lのカラムにかけ、水で
溶出した。溶出液を減圧下に濃縮し、部分精製品とし
た。 実施例４ モラノリン含有培養液のＮ−メチル化 実施例１で得た培養液1000mlに、ハイフロースーパーセ
ル100gに加えて濾過し、培養濾液850mlを得た。これに
ホルマリン30ml、市販工業用ラネーニッケル触媒約15ml
を加えて、常温常圧で接触還元した。 反応終了後、触媒を濾別し、濾液を強酸性イオン交換樹
脂ダウエックス50W×２（H+）500mlのカラムにかけ、充
分水洗後、1Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下
に濃縮しアンモニアを除去した。このようにして次反応
に用いることができるＮ−メチルモラノリンを含む培養
液の部分精製品を得た。 実施例５ モラノリン含有培養液のＮ−（ｎ−ブチル）化（１） 実施例１で得た培養液200mlにハイフロースーパーセル1
00gを加えて濾過し、培養濾液1800mlを得た。これを減
圧下に濃縮乾固した後、N,N−ジメチルホルムアミド200
mlを加え、攪拌後、濾過した。更に100mlのN,N−ジメチ
ルホルムアミドで洗浄した。濾液と洗液を合わせ、これ
に臭化ｎ−ブチル16.1g、炭酸カリウム21.8gを加えて11
0℃で７時間反応させた。 反応後、濾過して減圧下に溶媒を除去して、次反応に用
いることができるＮ−（ｎ−ブチル）化された培養液の
部分精製品を得た。 実施例６ モラノリン含有培養液のＮ−（ｎ−ブチル）化（２） 実施例１で得た培養濾液1000mlを実施例３の方法で処理
した部分精製品を減圧下に濃縮乾固した。これにメタノ
ール50mlを加え氷冷下で攪拌した。ｎ−ブチルアルデヒ
ド20.5ml、５％塩酸メタノール溶液12.0ml、水素化シア
ノホウ素ナトリウム2.5gを加え、30分攪拌後、室温で16
時間反応させた。 減圧下に溶媒を留去し、水25mlに溶解し、15mlのクロロ
ホルムで３回分配した。水層を強酸性イオン交換樹脂ダ
イヤイオンSK−104（H+）100mlのカラムにかけ、充分水
洗後、0.5Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下に
濃縮して次反応に用いることができるＮ−（ｎ−ブチ
ル）化された培養液の部分精製品を得た。 実施例７ モラノリン含有培養液の部分精製品（１）の糖転移反応 実施例１と同様の方法で培養した培養液（2000l）を、
実施例２と同様の方法で処理した部分精製品（150l;モ
ラノリン約7kg含有）を420l容ジャーファーメンターと5
0l容カラムを連結した反応装置のジャーファーメンター
に加えた。 更にアミコールNo.6L 70kgを加え加熱溶解した。6N水酸
化ナトリウムでpHを9.0に調整した後、水を加えて全容
を280lとした。参考例１の方法で製造した固定化CGTase
30lをカラムに充填し、3l/分の流速で循環させながら55
℃で48時間反応させてモラノリンの糖転移反応液を得
た。 実施例８ モラノリン含有培養液の部分精製品（２）の糖転移反応 実施例１と同様の方法で培養した培養液（2000l）を実
施例３と同様の方法で処理した部分精製品（100l;モラ
ノリン約7kg含有）を420l容ジャーファーメンターと50l
容カラムを連結した反応装置のジャーファーメンターに
加えた。 更にアミコールNo.6L 70kgを加え加熱溶解した。pH未調
整のまま水を加えて全容を300lにした。参考例１の方法
で製造した固定化CGTase30lをカラムに充填し、3l/分の
流速で循環させながら55℃で72時間反応させてモラノリ
ンの糖転移反応液を得た。 実施例９ Ｎ−メチルモラノリン含有培養液の糖転移反応 実施例４の方法で製造したＮ−メチルモラノリン含有培
養液（50ml;N−メチルモラノリン約3g含有）に、可溶性
澱粉12gを加温溶解した後、水を加えて全容を100mlとし
た。参考例１の方法で製造した固定化CGTase10mlを加
え、55℃で48時間反応後、グラスフィルターで濾過して
Ｎ−メチルモラノリンの糖転移反応液を得た。 実施例10 Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリン含有培養液の糖転移反応
（１） 実施例５の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンを含む培養液の部分精製品の一部〔18.3g;このうち約
4.0gがＮ−（ｎ−ブチル）モラノリンである〕を、水10
0mlに溶解し、アミコールNo.6L30gを加温溶解し、水を
加えて全容を200mlとした。 参考例２の方法で製造した固定化CGTase10mlを加え、55
℃で48時間反応後、グラスフィルターで濾過してＮ−
（ｎ−ブチル）モラノリンの糖転移反応液を得た。 実施例11 Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリン含有培養液の糖転移反応
（２） 実施例６の方法で製造じたＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンを含む培養液の部分精製品の一部〔10.0g;このうち約
8.0gがＮ−（ｎ−ブチル）モラノリンである〕を水80ml
に溶解し、アミコールNo.6L 80gを加温溶解し、水を加
えて全容を160mlとした。 参考例１の方法で製造した固定化CGTase20mlを加え、55
℃で48時間反応後、グラスフィルターで濾過してＮ−
（ｎ−ブチル）モラノリンの糖転移反応液を得た。 実施例12 実施例７に係るGA反応（モラノリン） 420l容ジャーファーメンターと50l容カラムを凍結した
反応装置において、50l容カラムには参考例３の方法で
製造した固定化GA 15lを充填し、ジャーファーメンタ
ーには実施例７の方法で製造したモラノリンの糖転移反
応液280l（モラノリン約7kgを反応した糖転移反応液）
を入れ、濃硫酸でpHを5.2に調整した後、3l/分の流速で
循環させながら50℃で19時間反応させた。 実施例13 実施例８に係るGA反応（モラノリン） 420l容ジャーファーメンターと50l容カラムを連結した
反応装置において、50l容カラムには参考例３の方法で
製造した固定化GA 15lを充填し、ジャーファーメンタ
ーには実施例８の方法で製造したモラノリンの糖転移反
応液300l（モラノリン約7kgを反応した糖転移反応液）
を入れ、濃硫酸でpHを5.2に調整した後、3l/分の流速で
循環させながら40℃で18時間反応させた。 実施例14 実施例９に係るGA反応（Ｎ−メチルモラノリン） 実施例９の方法で製造したＮ−メチルモラノリンの糖転
移反応液100ml（糖転移反応の前にてＮ−メチルモラノ
リンを約3g含有）を、濃硫酸でpHを5.2に調整した後、
参考例３の方法で製造した固定化GA 10mlを加えて50℃
で20時間反応させた。グラスフィルターで濾過して固定
化GAを除き、GA反応液を得た。 実施例15 実施例10に係るGA反応（Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ン） 実施例10の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンの糖転移反応液 200ml〔糖転移反応の前にてＮ−
（ｎ−ブチル）モラノリンを約3g含有〕を、濃硫酸でpH
を5.2に調整した後、参考例３の方法で製造した固定化G
A 20mlを加えて50℃で20時間反応させた。グラスフィル
ターで濾過して固定化GAを除き、GA反応を得た。 実施例16 実施例11に係るGA反応（Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ン） 実施例11の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンの糖転移反応液160ml〔糖転移反応の前にてＮ−（ｎ
−ブチル）モラノリンを約8g含有〕を、濃硫酸でpHを5.
2に調整した後、参考例３の方法で製造した固定化GA 20
mlを加えて50℃で20時間反応させた。グラスフィルター
で濾過して固定化GAを除き、GA反応液を得た。 実施例17 グルコシルモラノリンの精製（１） 実施例12の方法で製造したGA反応液280lを、脱色用樹脂
HS（北越炭素社製）のカラム（120l）に通過させて水洗
した。通過後と洗液を合わせ強酸性イオン交換樹脂ダイ
ヤイオンSK−104（H+）180lのカラムに通過させた。充
分水洗後、1Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下
に濃縮しながらアンモニアを除去した。濃縮液を強塩基
性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）のカラム180lに通過さ
せて水で溶出した。溶出液を約18lまで濃縮し、攪拌し
ながらメタノール320lを加え、終夜攪拌した。生じた結
果を濾過して集め、乾燥して、グルコシルモラノリンの
メタノール付加物7.9kgを得た。 このものは、参考例４に記載したものと同じ条件で高速
液体クロマトグラフィーで分析した結果、約３％のモラ
ノリンを含んでいたが、その他の不純物は事実上認めな
かった。 実施例18 グルコシルモラノリンの精製（２） 実施例13の方法で製造したGA反応液300lを強酸性イオン
交換樹脂ダイヤイオンSK−104（H+）180lのカラムに通
過させた。充分水洗後、1Nアンモニア水で溶出した。溶
出液を減圧下に濃縮しながらアンモニアを除去した。濃
縮液を強塩基性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）のカラム
50lに通過させて水で溶出した。溶出液を約20lまで濃縮
し、攪拌しながらメタノール350lを加え、終夜攪拌し
た。生じた結晶を濾過して集め、乾燥してグルコシルモ
ラノリンのメタノール付加物7.3kgを得た。 このものは、参考例４に記載したものと同じ条件で高速
液体クロマトグラフィーで分析した結果、約0.5％のモ
ラノリンを含んでいたが、その他の不純物は事実上認め
なかった。 実施例19 グルコシル−Ｎ−メチルモラノリンの精製 実施例14の方法で製造したGA反応液100mlを強酸性イオ
ン交換樹脂ダウエックス50×２（H+）のカラム100mlに
通過させた。充分水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出し
た。溶出液を減圧下に濃縮しながらアンモニアを除去し
た。濃縮液を強塩基性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）の
カラム100mlに通過させて水で溶出した。通過液と溶出
液とを合わせ減圧下に濃縮乾固し、メタノール50mlに溶
解した後、ｐ−トルエンスルホン酸（−水和物）4.8gを
加え、室温で終夜放置した。生じた結晶を濾過して集
め、乾燥してグルコシル−Ｎ−メチルモラノリンのｐ−
トルエンスルホネート4.4gを得た。 このものは、その一部をとり塩基性フラクションとした
後、参考例４に記載したものと同じ条件で高速液体クロ
マトグラフィーで分析した結果、約0.5％のＮ−メチル
モラノリンを含んでいたが、その他の不純物は事実上認
めなかった。 実施例20 グルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製
（１） 実施例15の方法で製造したGA反応液200mlを強酸性イオ
ン交換樹脂ダウエックス50×２（H+）のカラム200mlに
通過させた。充分水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出し
た。溶出液を減圧下に濃縮しながらアンモニアを除去し
た。濃縮液を強塩基性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）の
カラム100mlに通過させて水で溶出した。通過液と溶出
液とを合わせ減圧下に濃縮乾固し、メタノール50mlに溶
解した後、Ｐ−トルエンスルホン酸（−水和物）5.2gを
加え、室温で終夜放置した。生じた結晶を濾過して集
め、乾燥してグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンのｐ−トルエンスルホネート5.5gを得た。 このものは、その一部をとり塩基性フラクションとした
後、参考例４に記載したものと同じ条件で高速液体クロ
マトグラフィーで分析した結果、約1.5％のＮ−（ｎ−
ブチル）モラノリンを含んでいたが、その他の不純物は
事実上認めなかった。 実施例21 グルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製
（２） 実施例16の方法で製造したGA反応液160mlを強酸性イオ
ン交換樹脂ダウエックス50×２（H+）のカラム200mlに
通過させた。充分水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出し
た。溶出液を減圧下に濃縮しながらアンモニアを除去し
た。濃縮液を強塩基性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）の
カラム100mlに通過させて水で溶出した。通過液と溶出
液とを合わせ減圧下に濃縮乾固し、メタノール50mlに溶
解した後、Ｐ−トルエンスルホン酸（−水和物）5.2gを
加え、室温で終夜放置した。生じた結晶を濾過して集
め、乾燥してグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンのｐ−トルエンスルホネート10.0gを得た。 このものは、その一部をとり塩基性フラクションとした
後、参考例４に記載したものと同じ条件で高速液体クロ
マトグラフィーで分析した結果、約0.5％のＮ−（ｎ−
ブチル）モラノリンを含んでいたが、その他の不純物は
事実上認めなかった。 実施例22 グルコシルモラノリン精製時の回収母液残渣を用いた糖
転移反応、GA反応及びモラノリンの精製 実施例17において、メタノールによる分別結晶をした母
液の溶媒（メタノール）を回収除去したときに得られた
残渣（実施例７及び実施例12と同様の反応をして実施例
17と同様の処理をした３ロット分の回収残渣）を原料と
して、実施例７、実施例12、及び実施例17と同様の操作
を実施した結果、9.0kgのグルコシルモラノリンのメタ
ノール付加物を得た。 実施例23 モラノリンの精製 実施例17の方法で精製したグルコシルモラノリンのメタ
ノール付加物1kgを、1Nの塩酸（5l）に溶解し、90℃で
３時間反応させた。反応液を弱塩基性イオン交換樹脂ダ
イヤイオンWA−20（OH-）10lのカラムにかけ、充分水洗
した。通過液と洗液を合わせ、強酸性イオン交換樹脂ダ
イヤイオンSK−104（H+）5lのカラムにかけ、充分水洗
した後、1Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下に
濃縮乾固して、モラノリン468gを得た。 本品は、結晶化しなくとも高純度であり、このままで充
分に合成原料として使用することができるものである。 実施例24 Ｎ−メチルモラノリンの精製 実施例19の方法で製造したグルコシル−Ｎ−メチルモラ
ノリンのｐ−トルエンスルホネート2gを、1N塩酸（10m
l）に溶解し、90℃で３時間反応させた。反応液を弱塩
基性イオン交換樹脂ダイヤイオンWA−20（OH-）100mlの
カラムにかけ、充分水洗した。通過液と洗液を合わせ、
強酸性イオン交換樹脂ダイヤイオンSK−104（H+）50ml
のカラムにかけ、充分水洗した後、0.5Nアンモニア水で
溶出した。溶出液を減圧下に濃縮乾固した後、エタノー
ルから再結晶して、Ｎ−メチルモラノリン590mgを得
た。 実施例25 Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製（１） 実施例20の方法で製造したグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチ
ル）モラノリンのｐ−トルエンスルホネート3gを、1N塩
酸（30ml）に溶解し、90℃で３時間反応させた。反応液
を弱塩基性イオン交換樹脂ダイヤイオンWA−20（OH-）2
00mlのカラムにかけ、充分水洗した。通過液と洗液を合
わせ、強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50×２（H+）
100mlのカラムにかけ、充分水洗した後、0.5Nアンモニ
ア水で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮乾固した後、エ
タノールから再結晶して、Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ン850mgを得た。 実施例26 Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製（２） 実施例21の方法で製造したグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチ
ル）モラノリンのｐ−トルエンスルホネート5gを水に溶
かし、1N塩酸でpHを5.2に調整した。全容を1000mlとし
た後、参考例３の方法で製造した固定化GA 50mlを加え
て50℃で24時間反応させた。グラスフィルターで濾過し
て固定化GAを除き、濾液を、弱塩基性イオン交換樹脂ダ
イヤイオンWA−20（OH-）100mlのカラムにかけ、充分水
洗した。通過液と洗液を合わせ、強酸性イオン交換樹脂
ダウエックス50×２（H+）100mlのカラムにかけ、充分
水洗した後、0.5Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減
圧下に濃縮乾固した後、エタノールから再結晶して、Ｎ
−（ｎ−ブチル）モラノリン1.6gを得た。
明を更に詳しく説明する。 参考例１ CGTaseの固定化（１） 10lの富士紡績社製キトパールBCW−3010を2.5w/v％グル
タールアルデヒドを含む0.1M酢酸緩衝液（pH6.0）40l
に、室温で24時間浸漬処理した後、充分にイオン交換水
で洗浄した。ついでキトパール1ml当たり蛋白質20mg相
当のCGTase（林原生物化学研究所社製。バチルス・ステ
ロサーモフィリス（Bacillus stearothermophilus）由
来〕を加えて、さらに酢酸緩衝液（pH6.0）を最終濃度
が0.025Mになるように加えて、全液量が30lになるよう
にした。このまま室温で24時間浸漬してその後イオン交
換水で充分洗浄して、固定化CGTaseを得た。得られたビ
ーズの蛋白吸着量は、19.5mg/ml（ビーズ）であった。 参考例２ CGTaseの固定化（２） 参考例１と同様にして、蛋白質吸着量5mg/ml（ビーズ）
となるように、バチルス・ステロサーモフィリス（Baci
llus stearothermophilus）由来のCGTaseを固定化し
た。 参考例３ GAの固定化 天野製薬社製グルコザイムNL−３を透析した後、60〜65
mg/mlの蛋白質濃度にしたものをGA水溶液として用い
た。 富士紡績社製キトパールBCW−3010の１を2.5w/v％グ
ルタールアルデヒドを含む50mM酢酸緩衝液（pH5.0）3l
に室温で24時間浸漬処理した後、充分イオン交換水で洗
浄した。ついで、キトパール1ml当たり蛋白質100mg相当
のGA水溶液を加え、さらに水を加えて、全液量が3lにな
るようにした。このまま室温で24時間浸漬して、その後
イオン交換水で充分洗浄して固定化GAを得た。得られた
ビーズの蛋白質吸着量は、12.8mg/ml（ビーズ）であっ
た。 参考例４ 固定化CGTaseの安定化（モラノリンの糖転移反応） モラノリン2.5w/v％、アミコールNo.6L〔日澱化学社
製〕25w/v％、pH未調整の水溶液100mlに、参考例１で得
た固定化CGTaseを10ml加え、55℃で回転振盪を続けた。
一定時間経過後にグラスフィルターでビーズ（固定化CG
Tase）を濾過し充分水洗した後、次のようにして固定化
CGTaseの酵素活性を測定した。 （固定化CGTaseの酵素活性測定法） モラノリン2.5w/v％、アミコールNo.6L25w/v％、pH未調
整の水溶液10mlにビーズ（55℃で一定時間経過後の洗浄
固定化CGTase）1mlを加え、55℃で24時間反応させた。
反応液3mlを強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W×２
（H+）7mlに通過させ、充分水洗後、0.5Nアンモニア水
で溶出し、溶出液を減圧下に濃縮乾固して、3mlの水に
溶かし、その10μｌを高速液体クロマトグラフィーに注
入して分析し、未反応のモラノリンの濃度を求めた。高
速液体クロマトグラフィーの分析条件は、カラム（Nucl
eosil NH2、５μｍ、4mm i.d.×25cm）、展開溶媒（ア
セトニトリル−水＝70:30）、検出器（日立655A−30,RI
検出器）、データプロセッサー（日立 Ｄ−2000）。 55℃で回転振盪を開始した時点の反応進行率を100とし
た場合の一定時間経過後の相対的な反応進行率を上記式
により算出し、この値をもって酵素活性保持率とした。
結果を表１に示す。固定化CGTaseが本発明に係るモラノ
リンによって酵素活性が安定化された事実が明白であ
る。 参考例５ 固定化CGTaseの安定化（Ｎ−メチルモラノリンの糖転移
連続反応） 直径1cmのジャケット付きカラムに参考例１で得た固定
化CGTaseの20mlを充填し、Ｎ−メチルモラノリン、1.5w
/v％、可溶性澱粉9w/v％、pH未調整の溶液を160ml/日の
通過速度で55℃で連続的に通過反応させ、経時的に通過
液の反応進行率を求めた。反応進行率、活性保持率は参
考例４と同様にして求めた。その結果、140日を経過し
ても、ほぼ100％の活性を保持していることが判った。 参考例６ 固定化CGTaseの安定化（モラノリン、モラノリンのグル
コースオリゴマー） 参考例２で得た固定化CGTaseの1mlにモラノリン（2.5w/
v％）、モラノリンのグルコースオリゴマー（混合物）
（5.0w/v％）を加え、全容10mlで55℃で振盪した。モラ
ノリンのグルコースオリゴマーは、実施例７で得た糖転
移反応液を強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50W×２
（H+）で処理し、充分水洗した後、0.5Nアンモニア水で
溶出後、溶出後を濃縮乾固した塩基製フラクションであ
る。 調整時の酵素活性を100としたときの残存酵素活性保持
率（％）を表２に示した。酵素活性の測定方法等はすべ
て参考例４と同様にした。 モラノリン、モラノリンのグルコースオリゴマーにCGTa
seの活性を保持する作用があることが明白である。 参考例７ 固定化酵素CGTaseの安定化（Ｎ−置換モラノリン、Ｎ−
置換グルコシルモラノリン） 参考例１で得た固定化CGTase1mlに、Ｎ−置換モラノリ
ン（0.5w/v％）、Ｎ−置換グルコシルモラノリン（0.5w
/v％）を加え、全容10mlで55℃で14日間振盪した後、残
存酵素活性を測定した。最初の酵素活性を100としたと
きの残存酵素活性率を表３に示した。酵素活性の測定方
法は参考例４と同じである。 本発明化合物が、良好なる安定化作用を示していること
は明白である。 参考例８ 固定化GAの安定化（モラノリンの糖転移反応液） 実施例７の方法によって製造した未反応のモラノリン、
未反応のアミコールNo.6L、オリゴグリコシルモラノリ
ンを含む反応液を、硫酸を用いてpH5.2に調整した水溶
液を、参考例３で得た固定GA20mlを充填した直径1cmの
ジャケット付カラムに480ml/日の通過速度で、50℃で連
続的に通過反応させた。一定時間反応させた後、カラム
内の固定化GAをとり、次の方法で酵素活性を測定し、反
応開始時の酵素活性を100％としたときの活性保持率
（安定性）を求めた。結果を表４に示した。（固定化GA
の活性測定法） 固定化GAの一定量（湿重量30〜80mg）を、Ｇ−２のグラ
スフィルター上にとり、軽く吸引して水分を濾過した
後、グラスフィルター上の固定化GAをレンズペーパー上
に乗せて過剰の水分を除去した後、栓つきサンプル瓶に
入れ、固定化GAの湿重量を求めた。次に、固定化GAを10
mlの５％マルトース溶液（0.05M酢酸緩衝液、pH4.6）に
加え、37℃で20分間インキュベートした。反応液の100
μｌを0.05Nの水酸化ナトリウム中に加え、反応を停止
させた。 この反応停止液の10μｌを用いてグルコースを定量し
た。グルコースの定量は、ダイヤカラーGC（小野薬品社
製）を用いて行った。 活性は次のように定義した。１分間に１μＭのグルコー
スを生成させる酵素活性を１ユニットとした。ブランク
には反応液のかわりに基質と等容に混合した0.05N水酸
化ナトリウムを用いた。 このとき、固定化GAの活性は、5.56×ODSA／ODSTD／固
定化GAの湿重量。ここでODSAは、サンプル（固定化GA）
の500nmの吸光度、ODSTDは、1mg/mlのグルコース水溶液
の500nmの吸光度を意味する。表４で活性保持率の値が
変動しているが、これは測定誤差である。本発明化合物
の固定化GAに対する安定化作用が明白である。 参考例９ 固定化GAの安定化（モラノリンの糖転移反応液） 参考例８と同様にして40℃で実験した。結果を表５に示
した。 参考例10 GA（水溶液）での安定化（モラノリン、Ｎ−メチルモラ
ノリン） モラノリン、Ｎ−メチルモラノリンは、グルコアミラー
ゼの酵素活性を阻害するので溶液状グルコアミラーゼに
対する安定化効果は次のようにして検討した。酵素は生
化学工業社製のリゾプス・ニベウス（Rhizopus niveu
s）由来の試薬グルコアミラーゼを用いた。 酵素5mgを1mlの0.1M酢酸緩衝液（pH5.0）に溶解したも
のに、モラノリン、Ｎ−メチルモラノリンを6000μg/ml
となるように溶解させ、ネジ口試験管に入れて50℃にて
インキュベートした。それぞれの酵素液は、測定時に0.
1M酢酸緩衝液（pH5.0）で100倍に希釈してその100μｌ
をとり、５％マルトース液（0.05M酢酸緩衝液、pH4.6）
400μｌを加えて40℃で20分間反応させる。その反応液
の100μｌをとり、0.05Nの水酸化ナトリウム100μｌを
加えて反応を停止させる。この中から更に100μｌをと
り、3.0mlのグルコース測定試薬ダイヤカラーGCを加え
て、37℃で30分間静置し発色させ、その後氷冷し、500n
mで吸光度を測定しグルコース量を測定した。このグル
コース産生量を阻害剤共存下での酵素活性とした。初め
の酵素活性（グルコース産生量）を100としたときの相
対的な酵素活性を求めた。結果を図１に示した。本発明
化合物の酵素安定化作用が明白である。 実施例１ モラノリン産生菌の培養 澱粉２％、大豆粉１％、塩化カリウム0.05％、硫酸マグ
ネシウム0.05％、食塩0.2％、炭酸カルシウム0.35％（p
H7.2）の組成の培地200mlを、500ml容三角フラスコに取
り、常法通り滅菌後、これにストレプトミセス・ラベン
デュレ（Streptomyces lavendulae）SEN−158株（微工
研菌寄第4301号）の斜面培養から数白金耳胞子を接種
し、27℃で３日間200回転で振盪培養し、これを種培養
液とした。 澱粉８％、大豆粉３％、酵母エキス1.5％、塩化カリウ
ム0.05％、硫酸マグネシウム七含水塩0.05％、食塩0.1
％、炭酸カルシウム0.15％（pH7.2）の組成の培地250l
を420l容ジャーファーメンターに入れ、常法通り滅菌し
た後、種培養液2.4lを接種した。これを100回転／分、
通気量125l/分、27℃で10日間培養した。参考例４に記
載した方法と同様にして、培養液中のモラノリンを高速
液体クロマトグラフィーによって定量した結果、約3500
μg/mlのモラノリンが含まれていた。 実施例２ モラノリン含有培養液の部分精製（１） 実施例１の方法で得た培養液を、限外濾過膜（UF Modul
e;MU−6303−HG;クラレ社製）にかけ、通過液を更に逆
浸透膜（HR−5155 F1;ホローファイバー型；東洋紡社
製）にかけ、濃縮した非通過液を部分精製品とした。 実施例３ モラノリン含有培養液の部分精製（２） 実施例１の方法で得た培養液をプレスフィルターで濾過
した培養濾液を強酸性イオン交換樹脂ダイヤイオンSK−
104（H+）70lのカラムにかけ、充分水洗後、1Nアンモニ
ア水で溶出した。 溶出液を減圧下に濃縮した後、強塩基性イオン交換樹脂
ダイヤイオンSA−11A（OH-）35lのカラムにかけ、水で
溶出した。溶出液を減圧下に濃縮し、部分精製品とし
た。 実施例４ モラノリン含有培養液のＮ−メチル化 実施例１で得た培養液1000mlに、ハイフロースーパーセ
ル100gに加えて濾過し、培養濾液850mlを得た。これに
ホルマリン30ml、市販工業用ラネーニッケル触媒約15ml
を加えて、常温常圧で接触還元した。 反応終了後、触媒を濾別し、濾液を強酸性イオン交換樹
脂ダウエックス50W×２（H+）500mlのカラムにかけ、充
分水洗後、1Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下
に濃縮しアンモニアを除去した。このようにして次反応
に用いることができるＮ−メチルモラノリンを含む培養
液の部分精製品を得た。 実施例５ モラノリン含有培養液のＮ−（ｎ−ブチル）化（１） 実施例１で得た培養液200mlにハイフロースーパーセル1
00gを加えて濾過し、培養濾液1800mlを得た。これを減
圧下に濃縮乾固した後、N,N−ジメチルホルムアミド200
mlを加え、攪拌後、濾過した。更に100mlのN,N−ジメチ
ルホルムアミドで洗浄した。濾液と洗液を合わせ、これ
に臭化ｎ−ブチル16.1g、炭酸カリウム21.8gを加えて11
0℃で７時間反応させた。 反応後、濾過して減圧下に溶媒を除去して、次反応に用
いることができるＮ−（ｎ−ブチル）化された培養液の
部分精製品を得た。 実施例６ モラノリン含有培養液のＮ−（ｎ−ブチル）化（２） 実施例１で得た培養濾液1000mlを実施例３の方法で処理
した部分精製品を減圧下に濃縮乾固した。これにメタノ
ール50mlを加え氷冷下で攪拌した。ｎ−ブチルアルデヒ
ド20.5ml、５％塩酸メタノール溶液12.0ml、水素化シア
ノホウ素ナトリウム2.5gを加え、30分攪拌後、室温で16
時間反応させた。 減圧下に溶媒を留去し、水25mlに溶解し、15mlのクロロ
ホルムで３回分配した。水層を強酸性イオン交換樹脂ダ
イヤイオンSK−104（H+）100mlのカラムにかけ、充分水
洗後、0.5Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下に
濃縮して次反応に用いることができるＮ−（ｎ−ブチ
ル）化された培養液の部分精製品を得た。 実施例７ モラノリン含有培養液の部分精製品（１）の糖転移反応 実施例１と同様の方法で培養した培養液（2000l）を、
実施例２と同様の方法で処理した部分精製品（150l;モ
ラノリン約7kg含有）を420l容ジャーファーメンターと5
0l容カラムを連結した反応装置のジャーファーメンター
に加えた。 更にアミコールNo.6L 70kgを加え加熱溶解した。6N水酸
化ナトリウムでpHを9.0に調整した後、水を加えて全容
を280lとした。参考例１の方法で製造した固定化CGTase
30lをカラムに充填し、3l/分の流速で循環させながら55
℃で48時間反応させてモラノリンの糖転移反応液を得
た。 実施例８ モラノリン含有培養液の部分精製品（２）の糖転移反応 実施例１と同様の方法で培養した培養液（2000l）を実
施例３と同様の方法で処理した部分精製品（100l;モラ
ノリン約7kg含有）を420l容ジャーファーメンターと50l
容カラムを連結した反応装置のジャーファーメンターに
加えた。 更にアミコールNo.6L 70kgを加え加熱溶解した。pH未調
整のまま水を加えて全容を300lにした。参考例１の方法
で製造した固定化CGTase30lをカラムに充填し、3l/分の
流速で循環させながら55℃で72時間反応させてモラノリ
ンの糖転移反応液を得た。 実施例９ Ｎ−メチルモラノリン含有培養液の糖転移反応 実施例４の方法で製造したＮ−メチルモラノリン含有培
養液（50ml;N−メチルモラノリン約3g含有）に、可溶性
澱粉12gを加温溶解した後、水を加えて全容を100mlとし
た。参考例１の方法で製造した固定化CGTase10mlを加
え、55℃で48時間反応後、グラスフィルターで濾過して
Ｎ−メチルモラノリンの糖転移反応液を得た。 実施例10 Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリン含有培養液の糖転移反応
（１） 実施例５の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンを含む培養液の部分精製品の一部〔18.3g;このうち約
4.0gがＮ−（ｎ−ブチル）モラノリンである〕を、水10
0mlに溶解し、アミコールNo.6L30gを加温溶解し、水を
加えて全容を200mlとした。 参考例２の方法で製造した固定化CGTase10mlを加え、55
℃で48時間反応後、グラスフィルターで濾過してＮ−
（ｎ−ブチル）モラノリンの糖転移反応液を得た。 実施例11 Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリン含有培養液の糖転移反応
（２） 実施例６の方法で製造じたＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンを含む培養液の部分精製品の一部〔10.0g;このうち約
8.0gがＮ−（ｎ−ブチル）モラノリンである〕を水80ml
に溶解し、アミコールNo.6L 80gを加温溶解し、水を加
えて全容を160mlとした。 参考例１の方法で製造した固定化CGTase20mlを加え、55
℃で48時間反応後、グラスフィルターで濾過してＮ−
（ｎ−ブチル）モラノリンの糖転移反応液を得た。 実施例12 実施例７に係るGA反応（モラノリン） 420l容ジャーファーメンターと50l容カラムを凍結した
反応装置において、50l容カラムには参考例３の方法で
製造した固定化GA 15lを充填し、ジャーファーメンタ
ーには実施例７の方法で製造したモラノリンの糖転移反
応液280l（モラノリン約7kgを反応した糖転移反応液）
を入れ、濃硫酸でpHを5.2に調整した後、3l/分の流速で
循環させながら50℃で19時間反応させた。 実施例13 実施例８に係るGA反応（モラノリン） 420l容ジャーファーメンターと50l容カラムを連結した
反応装置において、50l容カラムには参考例３の方法で
製造した固定化GA 15lを充填し、ジャーファーメンタ
ーには実施例８の方法で製造したモラノリンの糖転移反
応液300l（モラノリン約7kgを反応した糖転移反応液）
を入れ、濃硫酸でpHを5.2に調整した後、3l/分の流速で
循環させながら40℃で18時間反応させた。 実施例14 実施例９に係るGA反応（Ｎ−メチルモラノリン） 実施例９の方法で製造したＮ−メチルモラノリンの糖転
移反応液100ml（糖転移反応の前にてＮ−メチルモラノ
リンを約3g含有）を、濃硫酸でpHを5.2に調整した後、
参考例３の方法で製造した固定化GA 10mlを加えて50℃
で20時間反応させた。グラスフィルターで濾過して固定
化GAを除き、GA反応液を得た。 実施例15 実施例10に係るGA反応（Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ン） 実施例10の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンの糖転移反応液 200ml〔糖転移反応の前にてＮ−
（ｎ−ブチル）モラノリンを約3g含有〕を、濃硫酸でpH
を5.2に調整した後、参考例３の方法で製造した固定化G
A 20mlを加えて50℃で20時間反応させた。グラスフィル
ターで濾過して固定化GAを除き、GA反応を得た。 実施例16 実施例11に係るGA反応（Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ン） 実施例11の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンの糖転移反応液160ml〔糖転移反応の前にてＮ−（ｎ
−ブチル）モラノリンを約8g含有〕を、濃硫酸でpHを5.
2に調整した後、参考例３の方法で製造した固定化GA 20
mlを加えて50℃で20時間反応させた。グラスフィルター
で濾過して固定化GAを除き、GA反応液を得た。 実施例17 グルコシルモラノリンの精製（１） 実施例12の方法で製造したGA反応液280lを、脱色用樹脂
HS（北越炭素社製）のカラム（120l）に通過させて水洗
した。通過後と洗液を合わせ強酸性イオン交換樹脂ダイ
ヤイオンSK−104（H+）180lのカラムに通過させた。充
分水洗後、1Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下
に濃縮しながらアンモニアを除去した。濃縮液を強塩基
性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）のカラム180lに通過さ
せて水で溶出した。溶出液を約18lまで濃縮し、攪拌し
ながらメタノール320lを加え、終夜攪拌した。生じた結
果を濾過して集め、乾燥して、グルコシルモラノリンの
メタノール付加物7.9kgを得た。 このものは、参考例４に記載したものと同じ条件で高速
液体クロマトグラフィーで分析した結果、約３％のモラ
ノリンを含んでいたが、その他の不純物は事実上認めな
かった。 実施例18 グルコシルモラノリンの精製（２） 実施例13の方法で製造したGA反応液300lを強酸性イオン
交換樹脂ダイヤイオンSK−104（H+）180lのカラムに通
過させた。充分水洗後、1Nアンモニア水で溶出した。溶
出液を減圧下に濃縮しながらアンモニアを除去した。濃
縮液を強塩基性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）のカラム
50lに通過させて水で溶出した。溶出液を約20lまで濃縮
し、攪拌しながらメタノール350lを加え、終夜攪拌し
た。生じた結晶を濾過して集め、乾燥してグルコシルモ
ラノリンのメタノール付加物7.3kgを得た。 このものは、参考例４に記載したものと同じ条件で高速
液体クロマトグラフィーで分析した結果、約0.5％のモ
ラノリンを含んでいたが、その他の不純物は事実上認め
なかった。 実施例19 グルコシル−Ｎ−メチルモラノリンの精製 実施例14の方法で製造したGA反応液100mlを強酸性イオ
ン交換樹脂ダウエックス50×２（H+）のカラム100mlに
通過させた。充分水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出し
た。溶出液を減圧下に濃縮しながらアンモニアを除去し
た。濃縮液を強塩基性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）の
カラム100mlに通過させて水で溶出した。通過液と溶出
液とを合わせ減圧下に濃縮乾固し、メタノール50mlに溶
解した後、ｐ−トルエンスルホン酸（−水和物）4.8gを
加え、室温で終夜放置した。生じた結晶を濾過して集
め、乾燥してグルコシル−Ｎ−メチルモラノリンのｐ−
トルエンスルホネート4.4gを得た。 このものは、その一部をとり塩基性フラクションとした
後、参考例４に記載したものと同じ条件で高速液体クロ
マトグラフィーで分析した結果、約0.5％のＮ−メチル
モラノリンを含んでいたが、その他の不純物は事実上認
めなかった。 実施例20 グルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製
（１） 実施例15の方法で製造したGA反応液200mlを強酸性イオ
ン交換樹脂ダウエックス50×２（H+）のカラム200mlに
通過させた。充分水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出し
た。溶出液を減圧下に濃縮しながらアンモニアを除去し
た。濃縮液を強塩基性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）の
カラム100mlに通過させて水で溶出した。通過液と溶出
液とを合わせ減圧下に濃縮乾固し、メタノール50mlに溶
解した後、Ｐ−トルエンスルホン酸（−水和物）5.2gを
加え、室温で終夜放置した。生じた結晶を濾過して集
め、乾燥してグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンのｐ−トルエンスルホネート5.5gを得た。 このものは、その一部をとり塩基性フラクションとした
後、参考例４に記載したものと同じ条件で高速液体クロ
マトグラフィーで分析した結果、約1.5％のＮ−（ｎ−
ブチル）モラノリンを含んでいたが、その他の不純物は
事実上認めなかった。 実施例21 グルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製
（２） 実施例16の方法で製造したGA反応液160mlを強酸性イオ
ン交換樹脂ダウエックス50×２（H+）のカラム200mlに
通過させた。充分水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出し
た。溶出液を減圧下に濃縮しながらアンモニアを除去し
た。濃縮液を強塩基性イオン交換樹脂SA−11A（OH-）の
カラム100mlに通過させて水で溶出した。通過液と溶出
液とを合わせ減圧下に濃縮乾固し、メタノール50mlに溶
解した後、Ｐ−トルエンスルホン酸（−水和物）5.2gを
加え、室温で終夜放置した。生じた結晶を濾過して集
め、乾燥してグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンのｐ−トルエンスルホネート10.0gを得た。 このものは、その一部をとり塩基性フラクションとした
後、参考例４に記載したものと同じ条件で高速液体クロ
マトグラフィーで分析した結果、約0.5％のＮ−（ｎ−
ブチル）モラノリンを含んでいたが、その他の不純物は
事実上認めなかった。 実施例22 グルコシルモラノリン精製時の回収母液残渣を用いた糖
転移反応、GA反応及びモラノリンの精製 実施例17において、メタノールによる分別結晶をした母
液の溶媒（メタノール）を回収除去したときに得られた
残渣（実施例７及び実施例12と同様の反応をして実施例
17と同様の処理をした３ロット分の回収残渣）を原料と
して、実施例７、実施例12、及び実施例17と同様の操作
を実施した結果、9.0kgのグルコシルモラノリンのメタ
ノール付加物を得た。 実施例23 モラノリンの精製 実施例17の方法で精製したグルコシルモラノリンのメタ
ノール付加物1kgを、1Nの塩酸（5l）に溶解し、90℃で
３時間反応させた。反応液を弱塩基性イオン交換樹脂ダ
イヤイオンWA−20（OH-）10lのカラムにかけ、充分水洗
した。通過液と洗液を合わせ、強酸性イオン交換樹脂ダ
イヤイオンSK−104（H+）5lのカラムにかけ、充分水洗
した後、1Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下に
濃縮乾固して、モラノリン468gを得た。 本品は、結晶化しなくとも高純度であり、このままで充
分に合成原料として使用することができるものである。 実施例24 Ｎ−メチルモラノリンの精製 実施例19の方法で製造したグルコシル−Ｎ−メチルモラ
ノリンのｐ−トルエンスルホネート2gを、1N塩酸（10m
l）に溶解し、90℃で３時間反応させた。反応液を弱塩
基性イオン交換樹脂ダイヤイオンWA−20（OH-）100mlの
カラムにかけ、充分水洗した。通過液と洗液を合わせ、
強酸性イオン交換樹脂ダイヤイオンSK−104（H+）50ml
のカラムにかけ、充分水洗した後、0.5Nアンモニア水で
溶出した。溶出液を減圧下に濃縮乾固した後、エタノー
ルから再結晶して、Ｎ−メチルモラノリン590mgを得
た。 実施例25 Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製（１） 実施例20の方法で製造したグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチ
ル）モラノリンのｐ−トルエンスルホネート3gを、1N塩
酸（30ml）に溶解し、90℃で３時間反応させた。反応液
を弱塩基性イオン交換樹脂ダイヤイオンWA−20（OH-）2
00mlのカラムにかけ、充分水洗した。通過液と洗液を合
わせ、強酸性イオン交換樹脂ダウエックス50×２（H+）
100mlのカラムにかけ、充分水洗した後、0.5Nアンモニ
ア水で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮乾固した後、エ
タノールから再結晶して、Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ン850mgを得た。 実施例26 Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製（２） 実施例21の方法で製造したグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチ
ル）モラノリンのｐ−トルエンスルホネート5gを水に溶
かし、1N塩酸でpHを5.2に調整した。全容を1000mlとし
た後、参考例３の方法で製造した固定化GA 50mlを加え
て50℃で24時間反応させた。グラスフィルターで濾過し
て固定化GAを除き、濾液を、弱塩基性イオン交換樹脂ダ
イヤイオンWA−20（OH-）100mlのカラムにかけ、充分水
洗した。通過液と洗液を合わせ、強酸性イオン交換樹脂
ダウエックス50×２（H+）100mlのカラムにかけ、充分
水洗した後、0.5Nアンモニア水で溶出した。溶出液を減
圧下に濃縮乾固した後、エタノールから再結晶して、Ｎ
−（ｎ−ブチル）モラノリン1.6gを得た。
図１は、参考例10における、GAでの安定化作用を図示し
たものである。横軸は時間（日）を、縦軸は相対的酵素
活性を示す。 ○は、コントロールを、●は6mg/mlのモラノリンを、△
は6mg/mlのＮ−メチルモラノリンを、それぞれ表す。
たものである。横軸は時間（日）を、縦軸は相対的酵素
活性を示す。 ○は、コントロールを、●は6mg/mlのモラノリンを、△
は6mg/mlのＮ−メチルモラノリンを、それぞれ表す。
Claims (2)
- 【請求項１】次の一般式〔Ｉ〕 （ここにＲは、水素又は低級アルキルを表す）で表され
るN-置換モラノリン誘導体を取得するにあたり、 （１）モラノリン産生菌を培養した培養液をそのまま、
又はこれにアルキル化反応を施し、 （２）グルコース供与体を加えた後、サイクロデキスト
リングリコシルトランスフェラーゼ（CGTase）を作用さ
せて次の一般式〔II〕 （ここにＲは、前記と同じ。ｎは０から24までの整数を
表す）で表されるオリゴグリコシル‐N-置換モラノリン
誘導体を生成させ、必要に応じてグルコアミラーゼ（G
A）を作用せしめて一般式〔II〕においてｎが０である
化合物を生成させ、 （３）分別操作を施して一般式〔II〕で表される化合物
を単離し、 （４）単離した式〔II〕で表される化合物を加水分解し
て一般式〔Ｉ〕で表されるN-置換モラノリン誘導体を取
得し、 上記（１）〜（４）までの一連の操作を順次行うことを
特徴とする、一般式〔Ｉ〕で表されるN-置換モラノリン
誘導体の製造方法。 - 【請求項２】次の一般式〔Ｉ〕 （ここにＲは、水素又は低級アルキルを表す）で表され
るN-置換モラノリン誘導体を取得するにあたり、 （１）モラノリン産生菌を培養した培養液をそのまま、
又はこれにアルキル化反応を施し、 （２）グルコース供与体を加えた後、サイクロデキスト
リングリコシルトランスフェラーゼ（CGTase）を作用さ
せて次の一般式〔II〕 （ここにＲは、前記と同じ。ｎは０から24までの整数を
表す）で表されるオリゴグリコシル‐N-置換モラノリン
誘導体を生成させ、 （３）グルコアミラーゼ（GA）を作用せしめて、一般式
〔II〕においてｎが０であるグルコシル N-置換モラノ
リン誘導体を生成させ、 （４）分別操作を施してグルコシル N-置換モラノリン
誘導体を単離し、 （５）単離したグルコシル N-置換モラノリン誘導体を
加水分解して一般式〔Ｉ〕で表されるN-置換モラノリン
誘導体を取得し、 上記（１）〜（５）までの一連の操作を順次行うことを
特徴とする、一般式〔Ｉ〕で表されるN-置換モラノリン
誘導体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2031922A JPH0675510B2 (ja) | 1989-02-13 | 1990-02-13 | モラノリン誘導体の製法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3348089 | 1989-02-13 | ||
| JP1-33480 | 1989-02-13 | ||
| JP2031922A JPH0675510B2 (ja) | 1989-02-13 | 1990-02-13 | モラノリン誘導体の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04262791A JPH04262791A (ja) | 1992-09-18 |
| JPH0675510B2 true JPH0675510B2 (ja) | 1994-09-28 |
Family
ID=26370440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2031922A Expired - Lifetime JPH0675510B2 (ja) | 1989-02-13 | 1990-02-13 | モラノリン誘導体の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0675510B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104876855A (zh) * | 2006-05-24 | 2015-09-02 | 联合治疗公司 | 脱氧吉瑞霉素和d-阿拉伯胶素醇类似物及使用方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS569919A (en) * | 1979-07-05 | 1981-01-31 | Tokyo Shibaura Electric Co | Device for monitoring breaker tripping circuit |
-
1990
- 1990-02-13 JP JP2031922A patent/JPH0675510B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04262791A (ja) | 1992-09-18 |
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