JPH0710236B2 - ジデオキシアデノシンの精製方法 - Google Patents
ジデオキシアデノシンの精製方法Info
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- JPH0710236B2 JPH0710236B2 JP25700287A JP25700287A JPH0710236B2 JP H0710236 B2 JPH0710236 B2 JP H0710236B2 JP 25700287 A JP25700287 A JP 25700287A JP 25700287 A JP25700287 A JP 25700287A JP H0710236 B2 JPH0710236 B2 JP H0710236B2
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Landscapes
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- Saccharide Compounds (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物又は酵素の作用により生産された
２′,3′−ジデオキンアデノシン（以下、DDAと略
す。）の新規精製方法に関するものである。
２′,3′−ジデオキンアデノシン（以下、DDAと略
す。）の新規精製方法に関するものである。
従来のDDAの製造方法としては、ヌクレオシド類の２′
位あるいは３′位の脱酸素反応が行われている（Chem.P
harm.Bull.,22,128（1974））が、以下のような理由に
より、報告例は少ない。
位あるいは３′位の脱酸素反応が行われている（Chem.P
harm.Bull.,22,128（1974））が、以下のような理由に
より、報告例は少ない。
反応に先立ち保護基を導入しなければならないこ
と。
と。
２′位,3′位は立体障害が大きく反応が起きにくい
こと。
こと。
この為、単離精製法についても、わずかに実験室レベル
で液体クロマトグラフィーによる分取の繰り返し精製が
実施されている程度で、工業的に利用できる精製方法は
未だ確立していなかった。
で液体クロマトグラフィーによる分取の繰り返し精製が
実施されている程度で、工業的に利用できる精製方法は
未だ確立していなかった。
２′,3′−ジデオキシウリジン（以下、DDUと略す。）
又は2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸を基質とし
て微生物又は酵素の作用により生産された酵素反応液中
には、目的生成物のDDAの他に不純物として未反応基質
であるDDUとアデニン（以下Adと略す。）及び基質の分
解物であるウラシル（以下Ｕと略す。）、他若干の副生
する核酸類が含まれている。
又は2,3−ジデオキシリボース−１−リン酸を基質とし
て微生物又は酵素の作用により生産された酵素反応液中
には、目的生成物のDDAの他に不純物として未反応基質
であるDDUとアデニン（以下Adと略す。）及び基質の分
解物であるウラシル（以下Ｕと略す。）、他若干の副生
する核酸類が含まれている。
この反応液中から効率良く、高純度のDDAを取得する為
に、一般的に用いられている濃縮晶析等の手段だけでは
不適当であった。その理由として、Ad,Uは共に溶解度が
小さいため濃縮によってある程度は除去できるのである
が、未反応DDUと目的生成物であるDDAは共に溶解度が高
いため分離精製が困難だからである。
に、一般的に用いられている濃縮晶析等の手段だけでは
不適当であった。その理由として、Ad,Uは共に溶解度が
小さいため濃縮によってある程度は除去できるのである
が、未反応DDUと目的生成物であるDDAは共に溶解度が高
いため分離精製が困難だからである。
またDDAは、酸性条件下において加水分解を受け、2,3−
ジデオキシリボース残基とアデニン基とが容易に切断さ
れるため、酸を必要とするイオン交換樹脂処理による分
離精製も困難であった。
ジデオキシリボース残基とアデニン基とが容易に切断さ
れるため、酸を必要とするイオン交換樹脂処理による分
離精製も困難であった。
上記の欠点を解消するようなDDAの工業上優れた精製方
法の開発が望まれている。
法の開発が望まれている。
本発明者らは、前記問題点を解決すべく鋭意検討した結
果、DDA含有溶液を例えば除菌、除蛋白、脱色後に濃縮
し、過した後、液（以下、DDA濃縮液と略す。）を
非極性多孔質樹脂で処理することにより、DDAをAd,U,DD
U等の不純物から分離し、高純度のDDAを分取できること
を見い出し、この発見に基づいて本発明を完成するに到
った。
果、DDA含有溶液を例えば除菌、除蛋白、脱色後に濃縮
し、過した後、液（以下、DDA濃縮液と略す。）を
非極性多孔質樹脂で処理することにより、DDAをAd,U,DD
U等の不純物から分離し、高純度のDDAを分取できること
を見い出し、この発見に基づいて本発明を完成するに到
った。
即ち、本発明は、微生物又は酵素の作用により生産され
たDDAを精製するに際し、DDAを非極性多孔質樹脂に吸着
せしめることを特徴とするDDAの精製方法である。
たDDAを精製するに際し、DDAを非極性多孔質樹脂に吸着
せしめることを特徴とするDDAの精製方法である。
本発明の出発物質は未精製のDDAであればよく純度の程
度は問わない。微生物又は酵素の作用により、例えば、
2,3−ジデオキシリボース残基とアデニン残基を結合せ
しめた反応溶液やその中間処理物が採用される。
度は問わない。微生物又は酵素の作用により、例えば、
2,3−ジデオキシリボース残基とアデニン残基を結合せ
しめた反応溶液やその中間処理物が採用される。
微生物としては、エシェリヒア属、フラボバクテリウム
属、セラチア属、エンテロバクター属、エルビニア属、
シトロバクター属、コリネバクテリウム属、ハフニア
属、クルイヘラ属、サルモネラ属、又は、キサントモナ
ス属等DDAを生産できるものであればよい。又、酵素
は、上記微生物が有しているもの、その他同一機能を有
するものであれば特に制限されない。
属、セラチア属、エンテロバクター属、エルビニア属、
シトロバクター属、コリネバクテリウム属、ハフニア
属、クルイヘラ属、サルモネラ属、又は、キサントモナ
ス属等DDAを生産できるものであればよい。又、酵素
は、上記微生物が有しているもの、その他同一機能を有
するものであれば特に制限されない。
本発明に用いるDDA濃縮液は、不純物であるDDU,Ad,U,若
干の副生成する核酸類のうち、いずれを含有していても
よい。また、この溶液のDDA濃度は、DDAの溶解度以下で
あれば制限されるものではない。
干の副生成する核酸類のうち、いずれを含有していても
よい。また、この溶液のDDA濃度は、DDAの溶解度以下で
あれば制限されるものではない。
次に、ここで用いる非極性多孔質樹脂は、例えばその母
体が、スチレン−ジビニルベンゼン系の共重合体又は、
その誘導体例えばこれにハロゲン化し高比重化したポリ
マーである物質であれ、いずれも使用可能である。例え
ば、ダイヤイオンHPシリーズ,SPシリーズ（以上、三菱
化成工業）,XAD−４（ローム・アンド・ハース社）、OC
1031（バイエル社）等が利用できるが、その他の非極性
多孔質樹脂であっても同等の性質を有するものであれば
いずれであっても良い。特に高比重化したSP207（三菱
化成工業）が、DDAの濃縮液をフィードした時に樹脂が
浮上したりすることなく、操作性が良い点で適してい
る。
体が、スチレン−ジビニルベンゼン系の共重合体又は、
その誘導体例えばこれにハロゲン化し高比重化したポリ
マーである物質であれ、いずれも使用可能である。例え
ば、ダイヤイオンHPシリーズ,SPシリーズ（以上、三菱
化成工業）,XAD−４（ローム・アンド・ハース社）、OC
1031（バイエル社）等が利用できるが、その他の非極性
多孔質樹脂であっても同等の性質を有するものであれば
いずれであっても良い。特に高比重化したSP207（三菱
化成工業）が、DDAの濃縮液をフィードした時に樹脂が
浮上したりすることなく、操作性が良い点で適してい
る。
非極性多孔質樹脂とDDA濃縮液との接液方法は、バッチ
式とカラム式があるが、カラム式の方が操作上簡便で好
ましい。
式とカラム式があるが、カラム式の方が操作上簡便で好
ましい。
カラムへの通液速度は、特に制限はなく、通常SV＝0.5
〜4.0、好ましくはSV＝１〜２程度がよい。
〜4.0、好ましくはSV＝１〜２程度がよい。
カラムにフィードするDDA濃縮液の体積負荷量としてはD
DA濃縮液の濃度によって異なり、DDAの樹脂負荷量（g/l
−Ｒ）は５〜40g/l−Ｒ、好ましくは10〜30g/l−Ｒが分
離性及び経済性の点で適している。
DA濃縮液の濃度によって異なり、DDAの樹脂負荷量（g/l
−Ｒ）は５〜40g/l−Ｒ、好ましくは10〜30g/l−Ｒが分
離性及び経済性の点で適している。
カラムへの接液温度については、10〜60℃であれば特に
制限されない。この温度ではDDAと濃縮液中の不純物Ad,
U,DDUとの分離性の相違は殆んどない。
制限されない。この温度ではDDAと濃縮液中の不純物Ad,
U,DDUとの分離性の相違は殆んどない。
次に、カラムからのDDA溶離方法に関して記述する。溶
離剤は、低級脂肪族アルコール水溶液が適している。例
えば、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロ
ピルアルコール等の水溶液である。溶離速度は、通常の
SV＝１〜２程度が良い。
離剤は、低級脂肪族アルコール水溶液が適している。例
えば、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロ
ピルアルコール等の水溶液である。溶離速度は、通常の
SV＝１〜２程度が良い。
実際の非極性多孔質樹脂を用いた精製操作は次の様にす
ると良い。すなわち、当該樹脂を充填したカラムにDDA
濃縮液を一定量フィード後、水押し、Ｕを溶離する。次
に、アルコール水溶液を用いて、DDU,Adを溶離し、更に
アルコール濃度を上げることによりDDAを溶離する。そ
して、このDDA画分を濃縮し、晶析後、冷却することに
より、高純度のDDAを分取せしめることができる。
ると良い。すなわち、当該樹脂を充填したカラムにDDA
濃縮液を一定量フィード後、水押し、Ｕを溶離する。次
に、アルコール水溶液を用いて、DDU,Adを溶離し、更に
アルコール濃度を上げることによりDDAを溶離する。そ
して、このDDA画分を濃縮し、晶析後、冷却することに
より、高純度のDDAを分取せしめることができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例１ 酵母エキス0.5g/dl、ペプトン1.0g/dl、肉エキス1.0g/d
lおよびNaCl0.5g/dlを含む培地（pH7.0）50mlを500ml容
肩付フラスコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨン
寒天培地にて30℃、16時間前培養したエシェリヒアコリ
ATCC10798を１白金耳ずつ接種し、30℃にて16時間振と
う培養した。得られた培養液より菌体を遠心分離により
分離した後、0.05Mリン酸バッファー（pH7.0）で洗浄
し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
lおよびNaCl0.5g/dlを含む培地（pH7.0）50mlを500ml容
肩付フラスコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨン
寒天培地にて30℃、16時間前培養したエシェリヒアコリ
ATCC10798を１白金耳ずつ接種し、30℃にて16時間振と
う培養した。得られた培養液より菌体を遠心分離により
分離した後、0.05Mリン酸バッファー（pH7.0）で洗浄
し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
このエシェリヒアコリATCC10798の洗浄菌体を、20mMのD
DUと20mMのAdとを含む100mMのリン酸バッファー（pH＝
7.0）１に、１％になるように添加し、50℃、24時間
反応させた。この結果、85mg/dlのDDAが生成していた。
（回収率18％） この溶液を遠心分離（7000G,40分）で除菌後、除菌液に
活性炭（白サギ炭、武田薬品工業）を50mg添加し、除蛋
白、脱色（50℃,1hr）後、過（孔径0.45μｍフィル
タ）した。液を15mlまで濃縮後、過（No.5C紙）
した。このDDA濃縮液13ml（DDA6.2g/dl）を非極性多孔
質合成吸着樹脂SP207（三菱化成工業）65ml（φ×Ｌ＝2
0mm×210mm）にSV＝１でフィード後、水押を260ml行っ
た（SV＝２），（画分−１とする）。次に、10％エチル
アルコール−水溶液390mlで溶離した（SV＝２），（画
分−２とする）。最後に、20％エチルアルコール−水溶
液390mlで溶離した（SV＝２），（画分−３とする）。
DUと20mMのAdとを含む100mMのリン酸バッファー（pH＝
7.0）１に、１％になるように添加し、50℃、24時間
反応させた。この結果、85mg/dlのDDAが生成していた。
（回収率18％） この溶液を遠心分離（7000G,40分）で除菌後、除菌液に
活性炭（白サギ炭、武田薬品工業）を50mg添加し、除蛋
白、脱色（50℃,1hr）後、過（孔径0.45μｍフィル
タ）した。液を15mlまで濃縮後、過（No.5C紙）
した。このDDA濃縮液13ml（DDA6.2g/dl）を非極性多孔
質合成吸着樹脂SP207（三菱化成工業）65ml（φ×Ｌ＝2
0mm×210mm）にSV＝１でフィード後、水押を260ml行っ
た（SV＝２），（画分−１とする）。次に、10％エチル
アルコール−水溶液390mlで溶離した（SV＝２），（画
分−２とする）。最後に、20％エチルアルコール−水溶
液390mlで溶離した（SV＝２），（画分−３とする）。
各画分を液体クロマトグラフィー分析で測定した。その
結果、画分−１にはＵのみ検出され回収率は99％、画分
−２にはAd,DDU、若干のDDAが含まれておりAdとDDUのそ
れぞれ回収率は99％,98％，画分−３にはDDAが含まれて
おり回収率95％であった。
結果、画分−１にはＵのみ検出され回収率は99％、画分
−２にはAd,DDU、若干のDDAが含まれておりAdとDDUのそ
れぞれ回収率は99％,98％，画分−３にはDDAが含まれて
おり回収率95％であった。
画分−３を濃縮し、DDAを晶析後、10℃まで冷却し、高
純度のDDA600mgを取した。取得したDDAの元素分析値
は表−１のとおりである。
純度のDDA600mgを取した。取得したDDAの元素分析値
は表−１のとおりである。
実施例２ 実施例１と同様に処理し取得したDDA濃縮液13ml（DDA6.
2g/dl）を、非極性多孔質合成吸着樹脂SP207（三菱化成
工業）65ml（φ×Ｌ＝20mm×210mm）にSV＝１でフィー
ド後、水押をSV＝２で260ml行つた。（画分−１とす
る）。次に、20％メチルアルコール−水溶液520mlで溶
離した（SV＝２），（画分−２とする）。最後に、40％
メチルアルコール−水溶液390mlで溶離した（SV＝
２），（画分−３とする）。
2g/dl）を、非極性多孔質合成吸着樹脂SP207（三菱化成
工業）65ml（φ×Ｌ＝20mm×210mm）にSV＝１でフィー
ド後、水押をSV＝２で260ml行つた。（画分−１とす
る）。次に、20％メチルアルコール−水溶液520mlで溶
離した（SV＝２），（画分−２とする）。最後に、40％
メチルアルコール−水溶液390mlで溶離した（SV＝
２），（画分−３とする）。
各画分を液体クロマトグラフィー分析によって測定し
た。その結果、画分−１にはＵのみ検出され回収率は98
％、画分−２にはAd,DDU若干のDDAが含まれており、Ad
とDDUのそれぞれ回収率が98％,98％、画分−３にはDDA
が含まれており回収率93％であった。画分−３を濃縮
し、DDAを晶析後、10℃まで冷却し、高純度のDDA580mg
を取した。取得したDDAの元素分析値は表−２のとお
りである。
た。その結果、画分−１にはＵのみ検出され回収率は98
％、画分−２にはAd,DDU若干のDDAが含まれており、Ad
とDDUのそれぞれ回収率が98％,98％、画分−３にはDDA
が含まれており回収率93％であった。画分−３を濃縮
し、DDAを晶析後、10℃まで冷却し、高純度のDDA580mg
を取した。取得したDDAの元素分析値は表−２のとお
りである。
〔発明の効果〕 以上述べた如く、本発明は非極性樹脂処理によりDDAを
効率的に分離精製できるので、工業化への道が大いに期
待されるものである。
効率的に分離精製できるので、工業化への道が大いに期
待されるものである。
Claims (4)
- 【請求項１】微生物又は酵素の作用により生産された
２′,3′−ジデオキシアデノシンを精製するに際し、
２′,3′−ジデオキシアデノシンを非極性多孔質樹脂に
吸着せしめることを特徴とする２′,3′−ジデオキシア
デノシンの精製方法。 - 【請求項２】２′,3′−ジデオキシアデノシンの生産反
応が2,3−ジデオキシリボース残基とアデニン残基を微
生物又は酵素の作用により結合せしめるものである特許
請求の範囲第（１）項記載の方法。 - 【請求項３】被精製物が不純物として２′,3′−ジデオ
キシウリジン、アデニン及びウラシルの少なくとも一種
を含有することを特徴とする特許請求の範囲第（１）項
記載の方法。 - 【請求項４】非極性多孔質樹脂がスチレン−ジビニルベ
ンゼン系の共重合体、又はその誘導体を含有するもので
ある特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25700287A JPH0710236B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-10-12 | ジデオキシアデノシンの精製方法 |
| US08/161,071 US6306647B1 (en) | 1987-06-16 | 1993-12-03 | Process for producing and purifying 2′,3′-dideoxynucleosides, and process for producing 2′,3′-dideoxy-2′,3′-didehydronucleosides |
| US08/385,888 USRE35609E (en) | 1987-06-16 | 1995-02-09 | Process for purifying 2',3'-dideoxynucleosides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25700287A JPH0710236B2 (ja) | 1987-10-12 | 1987-10-12 | ジデオキシアデノシンの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0198496A JPH0198496A (ja) | 1989-04-17 |
| JPH0710236B2 true JPH0710236B2 (ja) | 1995-02-08 |
Family
ID=17300359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25700287A Expired - Fee Related JPH0710236B2 (ja) | 1987-06-16 | 1987-10-12 | ジデオキシアデノシンの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0710236B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5451671A (en) * | 1992-07-27 | 1995-09-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of purifying 2',3'-dideoxynucleosides |
| WO2001023400A1 (fr) * | 1999-09-30 | 2001-04-05 | Yamasa Corporation | Fucose de guanosine 5'-diphosphate hautement pur et procede de production correspondant |
-
1987
- 1987-10-12 JP JP25700287A patent/JPH0710236B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0198496A (ja) | 1989-04-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |