JPH0753755B2

JPH0753755B2 - Ｈｉｖに対するヒトモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH0753755B2
Application number: JP1083856A
Authority: JP
Inventors: 安彦増保; 徹菅野; 洋一松本; エム．ハーシュエバン; エー．ピーターソンエスキルド; レイクダクラス
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1989-03-31
Publication date: 1995-06-07
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: US5298419A; KR890014730A; JPH02219592A; AU627698B2; ATE125870T1; EP0339163A2; JPH07292000A; CA1339858C; EP0339163B1; KR0149848B1; AU2456888A; DE3854267D1; DE3854267T2; EP0339163A3

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はHIV（human immunodeficiency virus）に対す
るヒト・モノクローナル抗体（monoclonal antibody,MC
Aと略す）とそれを産生するハイブリドーマに関する。
その目的とするところは、HIV感染症の診断、予防及び
治療に役立つところの、HIVに特異的なヒトMCAを提供す
ることにある。

〔従来の技術〕

HIVは主にヘルパーＴリンパ球に感染し、それを破壊す
ることによって著しい免疫不全を引き起こし、AIDS（ac
quired immunodeficiency syndrome）を発症させる。HI
Vに感染した初期には、一部の患者において、発熱、倦
怠、頭痛等を伴なう伝染性単核症様の症状を起こす。そ
の後、患者は無症状であるが、血中に抗HIV抗体を有す
るキャリヤーとなり、数年の潜伏期を経た後、ARC（AID
S-related complex）患者に移行する。ARC患者は全身リ
ンパ腺腫脹、発熱、全身倦怠、体重減少、血小板やリン
パ球の減少等の症状を呈する。これが進行すると、カポ
ジ肉腫や、カリニ肺炎、真菌症、サイトメガロウイルス
感染症等の日和見感染症を起し、死に至る。最も著しい
特徴は、ヘルパーＴリンパ球（T4）が減少し、サプレッ
サーＴリンパ球（T8）との比、T4/T8が病気の進行と共
に小さくなっていくことである。

AIDSは1981年に米国で初めて報告され、現在では米国の
みで20,000人余の患者が報告され、キャリアーは100万
人ともいわれている。米国と共にアフリ、ヨーロッパに
も多くの患者がおり、その診断、予防そして治療につい
て膨大な量の研究が進められている。

AIDSの病原体であるHIVはレトロウイルスの１つであ
り、約9,700塩基対のRNAとgag蛋白（分子量55,000,24,0
00,17,000ダルトンの３種）、逆転写酵素（分子量66,00
0,51,000ダルトンの２種）、エンベロープ（envelope）
構成成分の糖蛋白（分子量120,000と41,00ダルトンの２
分子とその前駆体である160,000ダルトンの分子、以下g
p120,gp41,gp160と略す）等から成っている。特にウイ
ルス感染とその防御という観点から見ると、ウイルス表
面に露出しているエンベロープが重要な意味を持ってい
る。gp160は蛋白分解によって、gp120とgp41とに切断さ
れる。gp41はウイルス・エンベロープの脂質二重層の中
に埋め込まれたトランスメンブレンプロティン（transm
embrane protein）であり、gp120の方が外側に露出して
おり、gp120は部分的にウイルスから離脱する。両方と
も糖結合サイトを多く有しており、gp120分子の約半分
は糖から成っている。このgp120分子は、ヘルパーＴ細
胞等の細胞表面にあるCD4抗原ないしその近傍に結合
し、ウイルスの感染を起すと共に、合胞体形成（syncyt
ium formation）を細胞に引き起す活性を有している。g
p120は米国特許No.4,725,669に詳細に記載されている。

例えば、M.Robert-Guroffら（J.Immunol.,138,3731,198
7）は血中にウイルス中和抗体を有する患者は、そうで
ない患者よりも病状の進行が遅いと述べている。また患
者血中の中和抗体はgp120に結合すると報告されている
（L.A.Laskyら、Science,233,209、並びに1986とT.J.Ma
tthewらのPro.Natl.Acad.Sci.USA.,83、9709,1986）。
さらに重要なことは、高力価抗p24抗体を有する血漿の
受動免疫によってHIV感染患者の抗原血漿の改善及び予
後の改善が認められたと報告されている（A.Kanpas等、
Pro.Natl.Acad.Sci.USA 85:9234,1988;G.G.Jachson等、
Lancet2:647,1988）。この様に、ウイルス又はウイルス
感染細胞の表面に露出されているウイルス抗原に対する
中和抗体は当然、感染防御又は治療上重要な意義をもっ
ている。

既に、gp120に対するマウスMCAはいくつかの研究グルー
プによって報告されている。T.C.Chanhら（Eur.J.Immun
ol.,16,1465,1986）は、gp120のペプチド鎖の一部を化
学的に合成し、これに対するマウスMCAを作製した。こ
のMCAによる間接蛍光抗体法は、逆転写酵素測定よりも
感度よくHIVの感染を検出したと述べている。また、Gos
tingら（J.Clin.Microbiol.,25,845,1987）は、可溶化
ウイルス抗原をlentil lectin-Sepharose 4Bにかけて、
その糖蛋白を取り、それをマウスに免疫し、抗gp120・
マウスMCAと抗gp41・マウスMCAを作製した。また松下ら
（Medical Immunol.,14,307,1987）は抗gp120・マウスM
CAにウイルス中和活性を認めた。これらのMCAはHIV感染
の診断に役立つが、感染症の予防や治療という点では不
適当である。というのは、マウス蛋白であるために、人
体に投与したときに異物として人体の免疫により認識さ
れてしまう。その結果、MCAの活性は生じた抗体等によ
って阻止されてしまうのみでなく、アナフィラキシー様
の副作用を生じることになる。そこで、人体に投与し、
HIV感染症の予防及び治療に役立てるには、マウス由来
でなく、ヒト由来のMCAが不可欠となる。

一般に、ヒト由来のMCAは、HIV特異的な抗体産生能力を
持つヒトＢリンパ球と、ミエローマ細胞等のリンパ系樹
立細胞との融合によって得られるハイブリドーマから産
生されるか、または上記ヒトＢリンパ球を、EBウイルス
によって形質転換することによって得られるリンパ芽球
様細胞から産生される。1980年頃から現在に至るまで、
多くのヒトMCA作製研究が行なわれてきたが、上記の両
方法ともにそれぞれ固有の問題をかかえており、マウス
MCAのように確立した技術となっていない。

1987年に、HIVに対するヒトMCAに関し２つの報告があっ
た。L.Evansら（Proceedings of the third Congress o
n AIDS,TP130,1987）は、HIV感染患者のリンパ球をEBウ
イルスで形質転換し、55,41及び25キロダルトンのgag蛋
白に反応するヒトMCAを得た。このヒトMCAはIgG4であ
り、ウイルス中和活性はなかった。また、B.Banapourら
（ibid,tp114）は、HIV抗体陽性者のリンパ球をEBウイ
ルスで形質転換し、さらにヘテロミエローマ細胞と融合
し、gp41に対するヒトMCAを得ている。このMCAはIgGで
あるが、サブクラスの種類は報告されておらず、また中
和活性はなかった。両報告とも共通してEBウイルスによ
る形質転換法を用いている。本方法は、極めて効率よく
ヒトＢリンパ球を免疫感作する点で、細胞融合法よりも
ずっと優れている。しかしながら、得られたリンパ芽球
細胞株は、EBウイルスを産生したり、産生していなくと
も産生しうるDNAを組み込んでいる。EBウイルスはリン
パ球を形質転換、ひいては癌化させる能力を持ってお
り、人体に投与する医薬品を生産するということを考え
たとき、安全性上問題がある。

EBウイルスによって形質転換したリンパ芽球細胞は、HI
Vにも感染することが知られており、ヒトMCAを産生する
細胞株がEBウイルスと共に、HIVにも感染している惧れ
がある。また、リンパ芽球細胞株の抗体産生は一般にハ
イブリドーマのそれよりも量が少なく、かつ不安定であ
るという欠点を持っている。Banapourらが、リンパ芽球
細胞株をさらに細胞融合しているのは、抗体産生能を改
善するための１つの試みである。

以上のように、もし細胞融合により効率よくヒトＢリン
パ球を免疫感作でき、かつHIVに対するヒトMCA産生能の
あるハイブリドーマが得られるならば、これから得られ
るMCAは生産性が高くかつ医薬品としての安全性上も望
ましいものとなる。

また、IgGのサブクラスとしては、補体を活性化する活
性を有し、そしてマクロファージやリンパ球のFcリセプ
ターに結合するサブクラスが望ましい。クラシック経路
（Classical pathway）で補体を活性化できるのはIgG1
とIgG3であり、IgG2とIgG4は活性化できない（J.L.Wink
elhake,Immunochem.,15,695,1978）。また、モノサイト
のFcリセプターへの結合も、IgG1とIgG3が強い親和性を
持っている（Cosioら、Immunol.,44,773,1981）。従っ
て、感染防御上IgG1とIgG3が望ましい。しかし、MCA精
製の過程では、プロティンＡによるアフィニティークロ
マトグラフィーが有効であることが非常に多いが、プロ
ティンＡにIgG1は結合し、IgG3は結合しないので、精製
しやすいという点ではIgG1サブクラスのヒトMCAがより
望ましいことになる。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、HIV粒子の表面に結合することができ
るIgG1サブクラスに属するモノクローナル抗体、及び該
ハイブリドーマの製造方法に関する。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、抗HIV・ヒトMCAを取得することを目的として
鋭意研究を行なった結果、HIV抗体陽性患者のリンパ節
又は脾臓由来リンパ球と、マウス・ミエローマ細胞とを
融合させる方法によって、gp120に対するヒトMCA（IgG1
サブクラス）を産生するハイブリドーマ、gp120とgp41
の両方に反応するヒトMCA（IgG1サブクラス）を産生す
るハイブリドーマ、及びgp120とp24の両方に反応するヒ
トMCA（IgG1サブクラス）を産生するハイブリドーマを
得ることができる。そして、このハイブリドーマ及び／
又はそれに由来する細胞株を培養し、その培養上清から
抗HIV・ヒトMCAを採取することができた。

即ち、本発明は、HIVに特異的な、サブクラスがIgG1で
あるヒト・モノクローナル抗体に関し、そして特にHIV
のgp120に結合するIgG1抗体、HIVのgp120とgp41の両方
に結合するIgG1抗体、及びHIVのgp120とp24の両方に結
合するIgG1抗体に関する。また、本発明は、ヒト・リン
パ球とマウス・ミエローマ細胞との融合によって形成さ
れた、上記の各抗体を産生するハイブリドーマに関す
る。gp120に結合するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマNo.1はATCC HB 9670として、gp120及びgp4
1の両者に結合するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマNo.86はATCC HB 9669として、いずれもブタ
ペスト条約に基きATCCに国際寄託されている。かかるハ
イブリドーマは、ヒト・リンパ球を、補体と抗ヒトＴリ
ンパ球マウスMCAとにより、あるいはAET（Aminoethylis
othiouronium Bromide Hydrobromide）処理赤血球とFic
ollとによりあらかじめ処理し、この処理されたヒト・
リンパ球とマウス・ミエローマ細胞とを融合することに
よって、効率よく製造することができるが、これもまた
本発明の１つである。

〔具体的な説明〕

本発明において用いられるヒト・リンパ球は、抗体陽性
患者の脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、扁桃、アデノイ
ド等の中に含まれている。本発明の目的のためには、い
かなる材料のリンパ球でも用いることができるが、望ま
しくは抗体陽性患者又はリンパ腺大症患者由来のリンパ
節、脾臓、扁桃である。

マウスのミエローマ細胞としては、８−アザグアニン耐
性株を用いるのが有利であり、公知のものとしては、BA
LB/CマウスのP3×65Ag8株、P3-NS1/1−Ag4−１株、P3×
63AgU1株、SP2/OAg14株、P3×63Ag8.6.5.3.株、MPC11-4
5.6.TG1.7株、SP−１株等がある。

本発明においては、ヒトリンパ球とマウスミエローマ細
胞融合に先立って、ヒトリンパ球を補体とヒトＴリンパ
球に対するマウスMCA〔例えば、オルト・ダイアグノス
ティク社（Ortho Diagnostic社）のOKT3〕とで処理し、
あるいはAETで処理した羊赤血球とFicollとで処理し、
Ｔリンパ球を除去しておくことが望ましい。本発明の実
施においては、例えばヒト固型リンパ組織を抗体陽性患
者から手術によって摘出し、摘出組織をハサミとメスに
よっておだやかにほぐし、細胞分散液を得る。細胞分散
液からＴリンパ球を除去するために次の２つの方法を用
いる。（１）細胞分散液をFicoll-Paque層に重層し、遠
心することによってリンパ球を分離する。さらに、補体
1/2容と抗ヒトＴリンパ球・マウスMCAで処理し、あらか
じめＴリンパ球を破壊し、残ったＢリンパ球を遠心分離
する。（２）細胞分散液を、AET処理した羊赤血球と混
合し、Ficoll-Paque遠心法によりＢ細胞を分離する。こ
れらの方法を用いると、末処理のリンパ球を用いる場合
よりもハイブリドーマの生成率が上昇する。

かくして得られたヒトリンパ球とマウス・ミエローマ細
胞とを融合する。細胞融合やハイブリドーマ培養の一般
的な条件は既知であるが、本発明者らがハイブリドーマ
の生成率と増殖が至適となるような組合せを鋭意研究し
た結果、本発明においては、リンパ球10⁴個に１つの割
合でハイブリドーマが生成するようになった。

その条件は次に述べるとおりである。例えば、リンパ球
とミエローマ細胞を10:1〜1:100、好ましくは1:1〜1:10
の比率で混合し、適当な細胞融合溶液、例えば約35％ポ
リエチレングリコール（分子量1,000〜6,000程度）およ
び約7.5％ジメチルスルホキシドを含むRPMI 1640を加え
て、室温〜37℃で１〜数分間攪拌し、その後10％ウシ胎
児血清アルブミン（FCS）加RPMI 1640で徐々に希釈し、
洗浄の後、HAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チ
ミジン）選択培養液にて細胞濃度が１〜５×10⁵個/mlと
なるように調製する。これを0.2mlずつ、例えば96穴プ
レートに分注し、５％CO₂を含む空気中で35〜38℃で２
〜３週間培養する。96穴プレートにはフィーダー相とし
てマウス腹腔滲出細胞を入れて置き、融合したを入れる
直前にその培養液を除去する。HAT培養液中ではハイブ
リドーマのみが生存し、８−アザグアニン耐性のミエロ
ーマ細胞及びミエローマ同士の融合細胞は生存し得ない
（未融合の抗体産生細胞は数日で死滅する）。

培養後、培養液の抗体価を酵素抗体法（ELISA）によっ
てチェックし、目的とする抗体を産生しているハイブリ
ドーマのみを選び出す。そして、そのハイブリドーマを
取り出し、限界希釈法によってクローニングし、MCAを
安定に産生するサブクローンを樹立する。さらにそれら
のハイブリドーマの中から、ウエスタンブロット分析又
は免疫沈降法による抗原の解析、及び感染細胞表面への
結合能を検討し、gp120に結合するMCA又はp24に結合す
るMCA、そして感染細胞表面に結合するMCAを選び出す。

このようにして得られた本発明の抗HIV・ヒトMCAを産生
するマウス−ヒトハイブリドーマは、凍結して保存する
ことができる。かかるハイブリドーマのセルライン（細
胞株）及び／又はそれに由来する細胞株を適当な方法で
大量に培養すると、培養上清から本発明の目的とするヒ
トMCAを得ることができる。また、このハイブリドーマ
を動物に移植して腫瘍化し、その腹水や血清からヒトMC
Aを得ることもできる。

以上の如くして得られた抗HIV・ヒトMCAは、次のような
特性を有する。（１）HIV感染細胞より得られたウイル
ス抗原を固定したELISAでは、結合陽性であるが、ウイ
ルス抗原を得る場合と同様の方法で非感染細胞から得た
物質を固定したELISAでは、結合陰性である。（２）HIV
は多くの抗原物質から構成されているので、本発明のヒ
トMCAがどのような構成成分に結合するのか、ウエスタ
ンブロット分析及び免疫沈降法によって検討した。１つ
のヒトMCAは、分子量120キロダルトン（120K）と160Kに
結合した（160Kは120Kと41Kの前駆体である）。もう１
つのヒトMCAは、分子量41K,120K及び160Kに結合するこ
とが判った。さらにもう１つのヒトMCAは分子量24K,120
K及び160Kに結合することが判った。（３）HIV感染細胞
の表面に結合するか否かを検討した。未固定のHIV感染
細胞にヒトMCAを反応させた後、ヒトIgGに対するフルオ
レッセイン標識抗体を反応させたところ、感染細胞表面
に強い蛍光が観察された。従って、感染細胞の表面にヒ
トMCAは結合することが判った。（４）ヒトのIgGにはIg
G1,IgG2,IgG3とIgG4の４つのサブクラスがあり、それぞ
れ異る生物活性を持っている。それぞれのサブクラスに
特異的な動物抗血清を用いてチェックしたところ、本発
明のヒトMCAはIgG1であることが判明した。

実施例１（１）細胞融合（ａ）リンパ球の調製 ARC患者から手術によって摘出されたリンパ腺をハサミ
とメスによって細かくほぐし、培地Ａ（RPMI 1640-10％
ウシ胎児血清（FCS）−2mMグルタミン、1mMピルビン酸
ナトリウム−20μg/mlL−セリン−0.05u/ヒトインシュ
リン−80μg/mlゲンタマイシン硫酸塩）に細胞を懸濁し
た。このcell細胞懸濁液をFicoll-Paque液に重層し、15
00rpmで20分間遠心した。Ficoll-Paqueの上に集積した
細胞を取り出し、リン酸緩衝液（PBS）で１回、RPMI 16
40で２回遠心洗浄し、最終的にRPMI 1640中に１×10⁷ce
lls/mlに懸濁させた。

（ｂ）リンパ球の処理Ｔリンパ球との細胞融合を減少させるために、次のいず
れかの方法によってＴリンパ球の除去を行なった。即
ち、（１）上記細胞懸濁液にOKT3〔オルソ・ダイアグノ
スチック社（Ortho Diagnostic社）〕を最終的に200倍
希釈になるように加えて、４℃で60分間反応させた後、
細胞を遠心沈澱（1500rpm、５分間）させた。この細胞
ペレットに、体ラビット補体の３倍希釈液（RPMI 1640
で希釈した）を加えて、37℃で60min反応させた。そし
て、この細胞懸濁液を２回遠心洗浄した。（２）上記細
胞懸濁液に１×10⁸のAET処理羊赤血球を加え、室温で５
分間反応させた後、細胞を遠心沈澱（1000rpm、５分
間）させた。この細胞ペレットを室温で20分間反応させ
た後、Ficoll-Paque液に重層し、1500rpmで20分間遠心
し、Ficoll-Paqueの上に集積した細胞（Ｂリンパ球）を
取り出してRPMI 1640で洗浄した。

（ｃ）細胞融合 OKT3処理リンパ球あるいは無処理リンパ球それぞれ３×
10⁷細胞と、マウス・ミエローマP3U1 cells（３×10⁷細
胞）とをRPMI 1640培地で混合し、細胞を遠心沈澱（160
0rpm、５分間）させた。上清を除去し、その細胞ペレッ
トをタッピングによってほぐし、1mlのポリエチレング
リコール溶液（35％V/Vポリエチレングリコール♯1000-
7.5％V/Vジメチルスルホキシド−RPMI 1640中）をゆっ
くり加え、室温で１分間放置した。次に、これを2mlのR
PMI 1640を加えて、１分間放置し、さらに2mlのRPMI 16
40を加えて２分間放置し、次に4mlのHAT培地（培地Ａ中
95μＭヒポキサンチン−0.4μＭアミノプテリン−16μ
Ｍチミジン）を加えて２分間放置し、次いで8mlのHAT培
地を加えて２分間放置し、そして24mlのHAT培地を加え
て、37℃で30分間放置した。最終的にHAT培地で75ない
し150mlとした。これを約200mlずつ96−ウエルの平らな
培養プレートに接種した。なお。この培養プレートに
は、前もってICRマウス（雄性）の腹腔滲出細胞を２×1
0⁴細胞ウエルずつ接種し、融合した細胞を接種する直前
に培養液を除去し、融合蛋白質を入れた。この培養プレ
ートを37℃でCO₂−インキュベーター中で培養した。培
地は１週間毎に、半量ずつHT培地（HATからアミノプテ
リンを省いたもの）で置換して、ハイブリドーマ・クロ
ーンが出現するまで培養を続けた。

（ｄ）クローニングハイブリドーマコロニーが出現した時点において、HIV
に対する抗体活性を培地毎に測定し、HIV−特異的産生
コロニーのハイブリドーマをクローニングした。まず、
96−ウエル平プレートに、マウス腹腔滲出細胞２×10⁴
／ウエルだけを接種しておいた。そして、１時間〜１日
後に培地を除去し、ハイブリドーマに、10細胞／ウエル
で96ウエルに接種した。第一クローニングにはHT培地を
用い、第二クローニングには培地Ａを用いた。培養２〜
３週間後に抗体活性を測定し、陽性クローンを拾った。

（２）酵素抗体法（Enzyme-linked immunosorbent as
say;ELISA）（ａ）ウイルス抗原（ｉ） HTLV-IIIb（ヒトＴリンパ球指向性ウィルスタ
イプIIIb）抗原バイオティックスラボラトリー・プロダ
クト社（Bionetics Laboratory Products社）（ii） CR10/N1T抗原 CR10/NITは、CEM細胞にHIVのN1T様の持続感染させた細
胞である。このCR10からウイルス抗原を部分精製した。
即ち、CR10/N1T細胞をPBSで３回洗浄し、−70℃で凍結
しておいた。使用時にこれを融解し、10⁸細胞を9mlの蒸
留水に懸濁し、この細胞懸濁液をボルテックスブレンダ
ーで１分間激しく振った。これを2800rpmで10分間遠心
し、その懸濁液を取った。これに10倍濃度のPBSを1ml加
えて、1500×ｇで30分間遠心し、ペレットを取った。こ
のペレットを5mlのPBSで中に再懸濁し、氷冷下15秒間、
４回超音波処理し、さらに氷冷下30分間放置し、その上
清を取った。これに100,000×ｇで１時間遠心分離し、
その上清をウイルス抗原として用いた。陰性対照とし
て、CEM細胞（HIV非感染）を同様に処理した抗原を作製
した。

（ｂ）抗原でコートしたプレート HTLV-III抗原（１μg/ml）、CR10/NIT抗原（20〜50μg/
ml）、CEM抗原（20〜50μg/ml）、を、それぞれマイク
ロタイタープレート（Coster、♯3912）の各ウエルに50
μｌずつ入れ、37℃で60分間放置した。これをHBSS・BS
A（0.1％NaN₃及び0.5％ウシ血清アルブミンを含むHank
の平衡塩溶液）で２回洗浄し、３％BSAを含むPBS（C
a,Mg）を125μl/well入れ、37℃で60分間、さらに
４℃で一夜放置し、ブロックを行なった。

（ｃ） ELISA 抗原によりコートされたプレートをHBSS・BSAで２回洗
浄し、これに50μｌの加熱された（56℃、60分間）ハイ
ブリドーマ培養液を加えた。室温で60分間反応させたの
ち、これをHBSS・BSAで２回洗浄した。その後50μｌの
ヒトIgGに対するヤギ抗体にアルカリホスファターゼが
抗合したもの（1000×希釈、Taco Inc.）を加え、再び
室温で60分間反応させたのち、HBSS・BSAで４回洗浄し
た。0.05M炭酸塩緩衝液−1mM MgCl₂（pH9.5）中1mg/ml
のｐ−ニトロフェニルホスフェート10μｌを加え、室温
で60分間ないし一夜反応させたのち、495mmにおける吸
光度をELISAリーダー（Titertech Inc.）によって測定
した。

（３）実験結果（ａ）患者Ａのリンパ腺細胞をOKT3処理、無処理で比
較した。

（ｂ）上記のように、ARCを有する患者からのOKT3処
理リンパ球とマウス・ミエローマ細胞との融合からハイ
ブリドーマを得、それらのクローニングによって、MCA
を安定に産生するハイブリドーマNo.86とNo.1を樹立す
ることに成功した。一方、ARC患者の脾臓より得たリン
パ球をAETロゼット処理したリンパ球とマウスミエロー
マ細胞との融合からハイブリドーマを得、それらのクロ
ーニングによってMCAを安定産生するハイブリドーマS1
−１を樹立することに成功した。No.86、No.1、及びS1
−１の産生するMCAは、ELISAでHTLV-III抗原及びCR10/N
IT抗原に反応し、CEM抗原には反応しなかった。MCAの産
生量は、No.86では10μg/10⁶細胞／日、No.1では20μg/
10⁶細胞／日、そしてS1−１では５μg/10⁶細胞／日であ
った。

実施例２（１） MCAの精製ハイブリドーマNo.86、No.1、及びS1−１の培養液（1.5
〜2l）を出発材料として用いた。この培養液に硫酸アン
モニウムを加えて50％飽和にし、そして生じた沈澱を1
0,000rpmでの20分間の遠心により集めた。その沈澱物を
適当量のPBSに溶かし、PBSで透析した。この溶液をプロ
ティンＡ−セファロースカラム（ベッドボリウム6ml、
ファルマシアAB）に適用した。食塩水で洗浄したのち、
食塩中HCl（pH2.5）で溶出した。こうして溶出されたIg
Gは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS-PAGE）で純粋なIgGであることが確認
された。

（２） IgGのサブクラス（ａ）Ｈ鎖精製されたMCAの溶液をヒトIgG,IgG2,IgG3,and IgG4に
対するヒツジ抗血清（Serotec Inc.）と反応させ、免疫
沈降リングができるか否かによって、そのサブクラスを
決定した。その結果、No.86、No.1、及びS1−１ともに
抗−IgG1にのみ反応し、他の抗血清には反応しなかっ
た。従って、いずれのMCAもIgG1であることが判った。

（ｂ）Ｌ鎖ヒトIgGに対するヤギ血清をマイクロタイタープレート
にコートした。この抗−ヒトIgG−コートプレートに、
精製MCAを反応させ、実施例１の（２）項に記したELISA
法により、ヒトλ鎖に対するヤギ抗体にアルカリホスフ
ァターゼが接合したもの及びヒトκ鎖に対するヤギ抗体
にアルカリホスファターゼが結合したもの（Tago In
c.）を用いて、そのタイプを決定した。その結果、No.8
6はκ鎖を有し、No.1はλ鎖を有し、そしてS1−１はλ
鎖を有することが判った。

（３） MCAにより認識されるウイルス抗原ウエスタンブロット法（Bio Radイムノブロットアッセ
イ、Bio Red Inc.）によってNo.86とNo.1 MCAが認識す
るウイルス抗原を同定した。方法の概略を述べる。HIV
のTHLV様をSDS-PAGEにかけて、分離されたウイルス抗原
をブロットしたニトロセルロース膜にMCAを反応させ、
次にヒトIgGに対する抗体をパーオキシダーゼが結合し
たものを反応させた。最後に酵素基質を反応させ、発色
させた。その結果を第１図に示した。第１図において、
ＡはAIDS患者血清、Ｂは健常人血清、ＣはNo.86のクロ
ーン、ＤはNo.86サブクローン１、ＥはNo.86サブクロー
ン２、ＦはNo.86サブクローン３、ＧはNo.86サブクロー
ン４、ＨはNo.1のクローン、そしてＩはS1−１のクロー
ンである。

No.86は、gp41に強く反応し、gp120には弱く反応した。
gp41とg120との両方に反応するのは、gp120に対するMCA
とgp41に対するMCAの混合物である可能がある。そこ
で、No.86のハイブリドーマを再びcloningして、そのサ
ブクローン1,2,3,4を得、それぞれのMCAについてウエス
タンブロット法を行なったが、第１図中のレーンD,E,F
及びＧに示す如く、やはり４サブクローンのMCAとも同
様に、gp41とgp120の両方に反応した。従って、このMCA
はgp120とgp41との両方に抗原エピトープをもつか、gp1
20とgp41の両断点に対するMCAと考えられる。gp160に反
応するのは、この抗原gp41とgp120から構成されたグリ
コプロテインであるからである。他方、No.1は、gp120
に反応した。勿論、その前駆体であるgp160にも反応し
ている。S1−１の認識する抗原はウエスタンブロット法
では検出できなかった。

（４）免疫沈降法（RIPA）モノクローナル抗体の認識するある種の抗原決定部位は
ウエスタンブロット法では検出できないことがある。こ
れは抗体と反応させる前に抗原を強力な界面活性剤と共
に熱処理及びメタノール処理を行なうため抗原の立体構
造を崩してしまい、モノクローナル抗体が結合できなく
なるためである。S1−１はウエスタンブロット法では認
識抗原を検出できなかったので免疫沈降電気泳動ラジオ
グラフィーによって認識抗原を決定した。

RIPAに用いる³⁵S標識抗原は次のように調製した。MOT細
胞あるいは、HTLVIIIb感染細胞（感染４日目、５×10⁶
のMOT細胞当り10³ TCID₅₀の感染価で感染させた）を³⁵
−システインと³⁵S−メチオニン（50μCi/ml）で標識し
た。標識に用いる培地は1/10容のメチオニンを含むRPMI
1640培地−10％透析牛胎児血清−他の必須アミノ酸−
³⁵S標識アミノ酸を用いた。非感染及び感染MOT細胞を標
識培地で14時間培養し、PBS（−）で洗浄した。洗浄し
た細胞をPRPA緩衝液（20mM Tris-HCl pH7.4、１％デオ
キシコレート（DOC）、１％ Triton×−100、0.1％ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）、1mM（ｐ−アミジオフェニ
ル）メタンスルホニルフルオリド（PAPMSF）で可溶化し
た。これを高速遠心（18,000rpm、60分）した上清を可
溶化画分として得た。可溶化画分を分割し、一方を20〜
100mMのジチオスレイトール（DTT）で37℃で、30ないし
は60分インキュベーションし、他方をDTT非存在下で37
℃、30ないしは60分インキュベーションした。以上のよ
うに調製した抗原をMCA S1-1あるいはHIV抗体陽性ヒト
血清と混合して免疫複合体を作り、これをRIPA緩衝液中
でプロテインＡ−セファロースビーズに結合させた。プ
ロテインＡ−セファロースビーズに結合させた標識抗原
−抗体複合体をRIPA緩衝液で８回、10mM Tris-HCl（pH
6.8）で２回洗浄し、サンプル緩衝液〔62.5mM Tris-HCl
（pH6.8）、１％SDS、20％グリセロール、0.2％ブロム
フェノールブルー〕に２％２−メルカプトエタノール存
在下あるいは非存在下で懸濁した。懸濁液を100℃、３
分間加熱した後、遊離した標識抗原を10％アクリルアミ
ドゲルにて泳動した。泳動後、ゲルを50％メタノール−
10％酢酸で固定し、1Mサリチル酸−３％グリセロール液
で処理した後、グルドライヤーを用いて乾燥させた。乾
燥したゲルを−80℃、３〜５日オートラジオグラフティ
ーにかけた。第２〜４図から次の結果を得た。

MCA S1−１はgp120（gp160）及びp24を認識した。

gp120（gp160）上の抗原決定部位は−SH基試薬によ
り容易に破壊される。一方p24上の抗原決定部位は−SH
基試薬によっては破壊されない。

（５） HIV感染細胞の表面への結合 MCA No.80、No.1、及びS1−１がHIV−感染細胞の表面に
反応するか否かを間接蛍光抗体法によって検討した。

MOT細胞（HTLV-II形質転換Ｔ細胞株）５×10⁶個を2.5×
10⁶ TCID₅₀のHTLV-IIIbと混ぜ、２時間、37℃で感染さ
せた。これを20％FCSを含むRPMI 1640培地中で３日間培
養後、0.1％NaN₃を含むPBSで、４℃、３回細胞を洗浄し
た。陰性対照として、HIVに感染していないＣ−３細胞
を用意した。

これらの未固定細胞を２×10⁶個／チューブだけコニカ
ルチューブに分注し、1500rpm,5min遠心した。上清を除
去し、その細胞ペレットに、HBSS−0.1％NaN₃で希釈し
た50μg/mlのモノクローナル抗体100μｌを加えて懸濁
した。４℃で60分間反応させたのち、0.1NaN₃-1mMEDTA-
PBSで細胞を３回洗浄した。この細胞ペレットに、さら
に、ヒトIgGに対する抗体にフルオレッセインイソチオ
シアネートが接合したもの（50×希釈、Tago Inc.）100
μｌを加えて、４℃で60分間反応させた。

以上のように処理された細胞をフローサイトメトリー
（FACScan,Becton Dickinson,Co.）によって解析した。
それぞれ、HTLV-IIIb-感染MOT細胞とAIDS患者からの血
清（×100希釈）、未感染MOT細胞とAIDS患者からの血清
（×100希釈）、HTLV-IIIb-感染MOT細胞とヒト正常成人
からの血清（×100希釈）、未感染MOT細胞と正常成人か
らの血清（×100希釈）、HTLV-IIIb-感染MOT細胞とMCA
No.86、未感染MOT細胞とMCA S1−１、HTLV-IIIb-感染MO
T細胞とMCA V1、未感染MOT細胞とMCA V1、の結合状態を
検討した。なお、V1は無関係の抗原（irrelevant antig
en）に対するIgG1のヒトMCAである。

その結果、次のことが判った。MCA No.86は、HIV感染細
胞の表面に反応し、非感染細胞には反応しない。MCA N
o.1及びS1−１でも同様の結果が得られた。HIVに特異的
でないMCA V1は、HIV感染細胞にも反応しない（第５
図）。感染細胞の表面に反応したMCAは、補体と共に、
あるいはリンパ球とマクロファージと共に感染細胞を破
壊し、ウイルスの産生をストップさせることによって、
感染の拡大を抑制することが考えられる。

（６）中和測定法 MCAの中和測定法は２つの方法：ニュートラルレッド色
素とり込み法とp24抗原捕捉法によった。

ニュートラルレッド色素取り込み法は次の原理に基いて
いる。HIVが感染許容細胞に感染すると、細胞はしばら
くして崩壊する。ニュートラルレッド色素は生きた細胞
の細胞質にとり込まれる。ニュートラルレッド色素とり
込み法において、MCAがHIVに結合しHIVの感染許容細胞
への進入を抑制すると、細胞は生き残ってニュートラル
レッド色素をとり込むことになる。従って、細胞にとり
込まれた色素量を測定することによって、MCAのHIV中和
価を定量化できる。

HTLV IIIB感染H9細胞の上清を中和測定法のウイルス源
とした。感染価（MOI）20〜25のウイルスを系列希釈し
た抗HIV抗体と混合し、37℃で１時間反応させた。この
場合、抗HIVと無関係なヒトMCAとHIVの混合液を陰性コ
ントロール、抗HIV抗体陽性血清とHIVの混合液を陽性コ
ントロールとして用いた。反応終了後、CD4陽性細胞（M
OT細胞）を３×10⁴コ／穴の割合で加えた。HIV、抗体、
MOT細胞を含むこれらのプレートを５日ないしは６日培
養した。５日ないし６日目に、96−穴マイクロタイター
プレート中の細胞をマイクロピペットで均一に混合し、
そのうち100μｌを100μｌの0.014％ニュートラルレッ
ド色素を含む培養液の入ったpoly−Ｌリジン処理プレー
トのそれぞれの穴に移した。このプレートを37℃、１時
間反応させた。この操作によって、生細胞、死細胞共に
poly−Ｌリジンに結合する。この間、生細胞あるいは傷
害をうけていない細胞のみが色素をとり込む。１時間
後、プレートを洗浄して余分な色素をとり除き、100μ
ｌの１％酢酸−70％エタノール液を加える。色素をとり
込んだ細胞は溶解され、上清中に色素が放出される。生
きのこった細胞から放出された色素量はTitertck ELISA
リーダーで540nmの吸収によって測定される。

100μg/mlのヒトMCA S1−１はニュートラルレッド取り
込み法（細胞生存測定法）によって90％以上の感染性HI
Vを中和することがわかった。（第６図）。健常人血清
はHIVの感染性を全く中和しなかった。

もう一つのHIV中和測定は抗原捕捉ELISAによるHIVのコ
アタンパクp24を検出する方法で行なわれた。HIVが感染
許容細胞に感染するとHIVはその細胞内で増殖し、HIV粒
子が培養上清中に放出される。もしMCAがHIVに結合し、
細胞への侵入を阻害するなら、HIVは増殖できず、HIV粒
子が培養上清中の放出されることはない。

MOI20-25に相当するHILV IIIb感染H9細胞から得られた
無細胞HTLV IIIbウイルスを段階希釈した抗−HIV抗体と
96穴マイクロタイタープレート中で混合し１時37℃で反
応させる。重要なことはこの抗原捕捉法でHIV接種源の
量が検出され得ないように注意することである。HIV感
染細胞から産性されるウイルス粒子のみが検出される。
抗HIVと無関係なヒトMCAとHIV陽性血清が対象コントロ
ールとして用いられた。ウイルス−抗体反応の後、CD₄
陽性細胞株（MOT）を３×10⁴細胞／穴で各穴へ加えた。
HIV、抗体、MOT細胞を入れたこれらのプレートを７日間
培養する。各穴の上清の試料を3,5,7日目に採取するこ
れらの試料は１時間56℃で熱不活化し、５μg/mlのHIV
陽性血清をコートした、96穴ELISAプレートへ加える。
室温で１時間反応後、ELISAプレートを0.05％ Tween-20
を含むリン酸緩しょう生理食塩水（PBS）で洗浄する。
次に２μg/mlのビオチン化抗p24ヒトモノクローナル抗
体を加え反応させる。次に１μg/mlのストレプトアヒジ
ン結合アルカリフォスファテースを加え１時間反応後未
結合の試薬を洗い流す。カーボネイト緩衝液pH9.5に溶
かした/mg/mlのパラニトトロフェニルのフォスフェイト
をプレートに加え、各穴の405nmの吸光度をTitertek Mu
ltiskan ELISAリーダーでよみとる。吸光度の増加分が
すなわち基の培養上清中に存在するp24の増加を示して
いる。

S1−１の25〜100μg/mlの濃度においては明らかに、p24
HIVコアタンパクの低下を示すことから、ヒトMCA S1−
１はHIVの感染を阻止した（第７図）。以上の結果をま
とめて２表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各MCAのウェスタンブロット法による認識抗
原の解析を示す。第２図〜第４図は、MCA S1−１の免疫沈降法による認識
抗原の解析を示す。第５図は、間接蛍光抗体法（FACS）によるMCA S1−１の
感染細胞膜への反応性を示す。第６図はニュートラルレッド色素とり込み法によるMCA
S1−１の中和曲線を示す。第７図は、p24抗原捕捉法によるMCA S1−１の中和曲線
を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者菅野徹東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社生物医学研究所内 (72)発明者松本洋一東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社生物医学研究所内 (72)発明者エバンエム．ハーシュアメリカ合衆国，アリゾナ 85718，タクソン，カミノラゾレッラ 2321 (72)発明者エスキルドエー．ピーターソンアメリカ合衆国，アリゾナ 85718，タクソン，ビアセレステ 3160 (72)発明者ダクラスレイクアメリカ合衆国，アリゾナ 85724，タクソン（番地なし）アリゾナヘルスサイエンスィズセンター，デパートメントオブインターナルメディシン (56)参考文献国際公開88／9181（ＷＯ，Ａ) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，25（５) （1987）Ｐ．845−848 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，83（1986）Ｐ．9709−9713

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】HIVのエンベロープの構造成分である分子
量120,000ダルトンの糖蛋白質（gp120）及びHIVのエン
ベロープの構造成分である分子量41,000ダルトンの糖蛋
白質（gp41）の両方と反応するヒト・モノクローナル抗
体。
【請求項２】ATCC HB 9669として国際寄託されているハ
イブリドーマにより生産されるIgG1型の請求項１に記載
のヒト・モノクローナル抗体。
【請求項３】請求項１に記載のヒト・モノクローナル抗
体を生産するハイブリドーマセルラインであって、HIV
血清陽性患者からのヒト・リンパ球とマウス・ミエロー
マ細胞とを融合させることによって形成されるハイブリ
ドーマセルライン。
【請求項４】ATCC HB 9669として国際寄託されている、
請求項３に記載のハイブリドーマセルライン。
【請求項５】請求項１に記載のヒト・モノクローナル抗
体の製造方法であって、請求項３に記載のハイブリドー
マセルラインを培養し、培養物から該モノクローナル抗
体又はその含有物を採取することを特徴とするヒト・モ
ノクローナル抗体の製造方法。
【請求項６】前記ハイブリドーマセルラインがATCC HB
9669である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】請求項１又は２に記載のヒト・モノクロー
ナル抗体を生産するハイブリドーマセルラインの製造方
法であって、HIV血清陽性患者からヒト・リンパ球を取
り、これをマウス・ミエローマ細胞と融合せしめ、そし
て該ヒト・モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを選択することを含んで成る方法。
【請求項８】ATCC HB 9669である請求項７に記載のハイ
ブリドーマセルラインの製造方法。