JPH0763371B2 - Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物 - Google Patents
Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物Info
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- JPH0763371B2 JPH0763371B2 JP61248503A JP24850386A JPH0763371B2 JP H0763371 B2 JPH0763371 B2 JP H0763371B2 JP 61248503 A JP61248503 A JP 61248503A JP 24850386 A JP24850386 A JP 24850386A JP H0763371 B2 JPH0763371 B2 JP H0763371B2
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- Japan
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- dna
- rna polymerase
- plasmid
- gene
- dna fragment
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ産生
遺伝情報を担うDNA及び該DNAを組込んだプラスミドを導
入させた新規な微生物、特に大腸菌並びにそれを用いる
SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼの製造方法に関
する。
遺伝情報を担うDNA及び該DNAを組込んだプラスミドを導
入させた新規な微生物、特に大腸菌並びにそれを用いる
SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼの製造方法に関
する。
SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼは、1982年に発
見され、生化学的研究が、なされてきた。近年の分子遺
伝学の進展に伴い、均一な大量RNA合成、ノザン（Nothe
rn）、あるいはサザン（Southern）ブロツテイングに用
いる高放射活性な一本鎖RNAプローブ調製等の必要性が
高まつている。これらの必要性を解決するために、サル
モネラ チフイムリウム（Salmonella typhimurium）に
感染するバクテリオフアージSP6により産生されるRNAポ
リメラーゼの有用性が確認されるに至り、その有利な製
造方法の開発が望まれていた。
見され、生化学的研究が、なされてきた。近年の分子遺
伝学の進展に伴い、均一な大量RNA合成、ノザン（Nothe
rn）、あるいはサザン（Southern）ブロツテイングに用
いる高放射活性な一本鎖RNAプローブ調製等の必要性が
高まつている。これらの必要性を解決するために、サル
モネラ チフイムリウム（Salmonella typhimurium）に
感染するバクテリオフアージSP6により産生されるRNAポ
リメラーゼの有用性が確認されるに至り、その有利な製
造方法の開発が望まれていた。
従来知られているSP6バクテリオフアージRNAポリメラー
ゼの製造方法としては、バトラーらの方法がある。バト
ラーらは、バクテリオフアージSP6をサルモネラ チフ
イムリウムに重感染させた後、その菌体より回収する製
造方法を確立している。本方法は、ジヤーナル オブ
バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）第257
巻，第5772頁（1982年）に記載されている。
ゼの製造方法としては、バトラーらの方法がある。バト
ラーらは、バクテリオフアージSP6をサルモネラ チフ
イムリウムに重感染させた後、その菌体より回収する製
造方法を確立している。本方法は、ジヤーナル オブ
バイオケミストリー（Journal of Biochemistry）第257
巻，第5772頁（1982年）に記載されている。
しかしながら、サルモネラ チフイムリウムにバクテリ
オフアージSP6を感染させて得られるRNAポリメラーゼの
含量は少なく、また、操作も煩雑であり、本酵素を大量
に得ることは困難であつた。一方、この遺伝子の単離及
び該遺伝子を種々ベクターに結合して、クローニングす
る方法については、いまだ明らかにされていない。
オフアージSP6を感染させて得られるRNAポリメラーゼの
含量は少なく、また、操作も煩雑であり、本酵素を大量
に得ることは困難であつた。一方、この遺伝子の単離及
び該遺伝子を種々ベクターに結合して、クローニングす
る方法については、いまだ明らかにされていない。
本発明の目的は、SP6バクテリオフアージRNAポリメラー
ゼの工業的製造に適したRNAポリメラーゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入した新規微生物、特に大腸菌の創製及
びそれを用いたSP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ
の製造方法を提供することにある。
ゼの工業的製造に適したRNAポリメラーゼ遺伝子を含む
プラスミドを導入した新規微生物、特に大腸菌の創製及
びそれを用いたSP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ
の製造方法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、DNA断片
に関する発明であつて、添付図面の第１図で表される制
限酵素地図を有し、その長さが2.75kbであり、かつSP6
バクテリオフアージRNAポリメラーゼをコードする遺伝
子を含むことを特徴とする。
に関する発明であつて、添付図面の第１図で表される制
限酵素地図を有し、その長さが2.75kbであり、かつSP6
バクテリオフアージRNAポリメラーゼをコードする遺伝
子を含むことを特徴とする。
また、本発明の第２の発明は新規微生物に関する発明で
あつて、上記第１の発明のDNA断片が組込まれたプラス
ミドを保有していることを特徴とする。
あつて、上記第１の発明のDNA断片が組込まれたプラス
ミドを保有していることを特徴とする。
本発明者らは、バクテリオフアージSP6DNAより、SP6バ
クテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子全領域を含む
2.75kb DNAをクローニングすることに成功し、更にこ
のDNA断片を含むプラスミドを導入した微生物、特に大
腸菌を培養することにより、菌体中に著量のSP6バクテ
リオフアージRNAポリメラーゼが蓄積することを見出
し、本発明を完成した。
クテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子全領域を含む
2.75kb DNAをクローニングすることに成功し、更にこ
のDNA断片を含むプラスミドを導入した微生物、特に大
腸菌を培養することにより、菌体中に著量のSP6バクテ
リオフアージRNAポリメラーゼが蓄積することを見出
し、本発明を完成した。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明に係る新規微生物、例えば大腸菌は次に例示する
工程により得ることができる。
工程により得ることができる。
１） DNA供与体であるバクテリオフアージSP6からフア
ージDNAを抽出し、制限酵素で切断し、DNA断片を回収す
る。
ージDNAを抽出し、制限酵素で切断し、DNA断片を回収す
る。
２） 回収したDNA断片を末端よりBal31エキソヌクレア
ーゼにより、消化し短くする。
ーゼにより、消化し短くする。
３） プラスミドベクターを制限酵素で開裂し、この開
裂部位に、２）で得たDNA断片を結合させる。
裂部位に、２）で得たDNA断片を結合させる。
４） フアージDNA断片を結合させたプラスミドを宿主
に導入し、目的のDNA断片を含む形質転換体を選択す
る。
に導入し、目的のDNA断片を含む形質転換体を選択す
る。
５） ４）で得た形質転換体からプラスミドを取出し、
目的のDNA断片を切出し、これを３）と同様の要領で発
現ベクタープラスミドに結合させる。
目的のDNA断片を切出し、これを３）と同様の要領で発
現ベクタープラスミドに結合させる。
６） ５）で得たSP6バクテリオフアージRNAポリメラー
ゼを含むDNA断片を結合させた発現ベクタープラスミド
を４）と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得る。
ゼを含むDNA断片を結合させた発現ベクタープラスミド
を４）と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得る。
上記DNA供与体であるバクテリオフアージSP6DNAは、サ
ルモネラ チフイムリウムLT2株にバクテリオフアーズS
P6を感染させた溶菌液よりフアージ粒子を回収し、それ
より抽出する。抽出、精製、制限酵素による切断等は、
公知の方法を用いることができ、当該法の詳細はモレキ
ユラー クローニング ア ラボラトリー マニユアル
（Molecular cloning a Laboratory Manual）第75〜178
頁、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（19
82年）に記載されている。
ルモネラ チフイムリウムLT2株にバクテリオフアーズS
P6を感染させた溶菌液よりフアージ粒子を回収し、それ
より抽出する。抽出、精製、制限酵素による切断等は、
公知の方法を用いることができ、当該法の詳細はモレキ
ユラー クローニング ア ラボラトリー マニユアル
（Molecular cloning a Laboratory Manual）第75〜178
頁、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（19
82年）に記載されている。
フアージDNAの制限酵素による切断は次のように行う。
フアージDNAに適当な制限酵素を加え、適当な反応条件
で反応を行うことにより種々のDNA断片に切断される。
この切断に使用しうる酵素は、フアージDNAを切断しう
るものであり、かつSP6バクテリオフアージRNAポリメラ
ーゼを産生する遺伝情報を担うDNA部分を切断しないも
のであることが必要である。また、ベクターとなるプラ
スミドを１か所切断できるものであることが望ましい。
フアージDNAに適当な制限酵素を加え、適当な反応条件
で反応を行うことにより種々のDNA断片に切断される。
この切断に使用しうる酵素は、フアージDNAを切断しう
るものであり、かつSP6バクテリオフアージRNAポリメラ
ーゼを産生する遺伝情報を担うDNA部分を切断しないも
のであることが必要である。また、ベクターとなるプラ
スミドを１か所切断できるものであることが望ましい。
一方プラスミドベクターの開裂も同様の方法で行うこと
ができる。
ができる。
プラスミドベクターとしては公知のものが使用できる
が、例えばpBR322、pUC18、pUC19などが挙げられる。次
にDNAリガーゼを用いてベクターDNAの開裂部位に上述の
DNA断片を組込ませるが、その手段自体は公知の方法に
よるものであり、ベクターDNAの種類及び制限酵素の種
類に応じて適当な反応条件が選択される。
が、例えばpBR322、pUC18、pUC19などが挙げられる。次
にDNAリガーゼを用いてベクターDNAの開裂部位に上述の
DNA断片を組込ませるが、その手段自体は公知の方法に
よるものであり、ベクターDNAの種類及び制限酵素の種
類に応じて適当な反応条件が選択される。
DNA断片の末端より消化し、短いDNA断片を得るために、
エキソヌクレアーゼが用いられるが、公知のものとして
は、Bal31エキソヌクレアーゼがあり、適当な反応条
件、種々の長さのDNA断片が得られる。
エキソヌクレアーゼが用いられるが、公知のものとして
は、Bal31エキソヌクレアーゼがあり、適当な反応条
件、種々の長さのDNA断片が得られる。
次いで、フアージDNA断片を組込んだプラスミドを宿主
大腸菌に導入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換
能を有するものであれば、野生株、変異株のいずれも使
用できる。用いるベクタープラスミドにより、用いる宿
主大腸菌を適宜変えることも可能である。
大腸菌に導入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換
能を有するものであれば、野生株、変異株のいずれも使
用できる。用いるベクタープラスミドにより、用いる宿
主大腸菌を適宜変えることも可能である。
この様にして目的のDNA断片を宿主に導入させ、プラス
ミドベクターの特性、例えばpBR322のEcoRV部位にクロ
ーン化する場合には、アンピシリン耐性、テトラサイク
リン感受性コロニーを選択することにより、クローン化
することができる。
ミドベクターの特性、例えばpBR322のEcoRV部位にクロ
ーン化する場合には、アンピシリン耐性、テトラサイク
リン感受性コロニーを選択することにより、クローン化
することができる。
クローン化されたDNAの解析には、公知の方法を用いて
行う。すなわち、多数得られる形質転換株よりプラスミ
ドを調製し、適当な制限酵素で切断後、アガロース電気
泳動すればクローン化されたDNA断片の長さを知ること
ができる。この様にして解析したところ、2.75kbのクロ
ーン化DNAを有するプラスミド（pSP6−１）を得た。
行う。すなわち、多数得られる形質転換株よりプラスミ
ドを調製し、適当な制限酵素で切断後、アガロース電気
泳動すればクローン化されたDNA断片の長さを知ること
ができる。この様にして解析したところ、2.75kbのクロ
ーン化DNAを有するプラスミド（pSP6−１）を得た。
更に、この全2.75kbを詳細に解析し、この内部にSP6バ
クテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子が存在するこ
とを確認した。SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ
遺伝子を含む2.75kbDNAの制限酵素切断地図を第１図に
示す。
クテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子が存在するこ
とを確認した。SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ
遺伝子を含む2.75kbDNAの制限酵素切断地図を第１図に
示す。
SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子をpBR322
EcoRV部位に組込んだプラスミドpSP6−１を導入した大
腸菌のRNAポリメラーゼ生産量は、それほど多くないの
で、更に大量生産するために他の発現ベクタープラスミ
ドpUC18等に組込む必要がある。例えば、pUC18に組込む
には、プラスミドpSP6−1DNAよりBamH I、Hind III両制
限酵素で、SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝
子DNA断片を切出し、BamH I、Hind III両制限酵素で開
裂したpUC18に結合し、宿主大腸菌（例えばJM109株）に
形質転換する。この様にしてプラスミドpSP6−２を得
た。
EcoRV部位に組込んだプラスミドpSP6−１を導入した大
腸菌のRNAポリメラーゼ生産量は、それほど多くないの
で、更に大量生産するために他の発現ベクタープラスミ
ドpUC18等に組込む必要がある。例えば、pUC18に組込む
には、プラスミドpSP6−1DNAよりBamH I、Hind III両制
限酵素で、SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝
子DNA断片を切出し、BamH I、Hind III両制限酵素で開
裂したpUC18に結合し、宿主大腸菌（例えばJM109株）に
形質転換する。この様にしてプラスミドpSP6−２を得
た。
プラスミドに組込まれたSP6バクテリオフアージRNAポリ
メラーゼ遺伝子を導入した大腸菌がRNAポリメラーゼ蛋
白を生産しているか否かを調べる手段としては公知の方
法が用いられる。例えば文献ジヤーナル オブ バイオ
ケミストリー（Journal of Biochemistry）第257巻、第
5772頁（1982年）が用いられるが、著量生産している場
合には菌体を溶菌して得た抽出物を直接SDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で検出することができる。
メラーゼ遺伝子を導入した大腸菌がRNAポリメラーゼ蛋
白を生産しているか否かを調べる手段としては公知の方
法が用いられる。例えば文献ジヤーナル オブ バイオ
ケミストリー（Journal of Biochemistry）第257巻、第
5772頁（1982年）が用いられるが、著量生産している場
合には菌体を溶菌して得た抽出物を直接SDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で検出することができる。
以上のようにして、SP6バクテリオフアージRNAポリメラ
ーゼ遺伝子を組込んだプラスミド及びそれを導入した大
腸菌を調製することができる。
ーゼ遺伝子を組込んだプラスミド及びそれを導入した大
腸菌を調製することができる。
以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例に限定されるものではない。
例に限定されるものではない。
実施例１ （１） バクテリオフアージSP6 DNAの調製 サルモネラ チフイムリウムLT2株をモテイフアイドＬ
培地（バクトトリプトン10g/、酵母エキス5g/、NaC
l5g/、リン酸２ナトリウム6g/、リン酸１カリウム3
g/）１で40℃培養する。菌数が1.6×109cells/mlに
達した時点で、バクテリオフアージSP6を菌１個当り0.0
5個加え、更に40℃培養し溶菌させる。
培地（バクトトリプトン10g/、酵母エキス5g/、NaC
l5g/、リン酸２ナトリウム6g/、リン酸１カリウム3
g/）１で40℃培養する。菌数が1.6×109cells/mlに
達した時点で、バクテリオフアージSP6を菌１個当り0.0
5個加え、更に40℃培養し溶菌させる。
溶菌後8mlのクロロホルムを加え、15分培養する。更にD
NaseI、RNaseAを各々1mg加え室温で30分間培養する。次
いで29gの食塩を加え４℃１時間放置後遠心分離し、上
清を回収する。回収した上清１に60gのポリエチレン
グリコール＃6000を加え溶解後４℃１晩放置する。１晩
放置後、遠心分離によりSP6バクテリオフアージを沈殿
区分として回収する。回収した沈殿区分を6mlのＢ−Ａ
−バツフアー〔0.5％ノニデツトP40（シエル石油社
製）、3.6mM CaCl2、5mM MgCl2、30mMトリス（Tris）−
HCl（pH7.5）、120mM KCl、0.5mM EDTA、30mM ２−メ
ルカプトエタノール〕に溶解する。溶解した液を3mlの4
0％グリセロールバツフアー〔40％グリセロール、0.5％
ノニデツトP40、30mMトリス−HCl（pH7.5）、120mM KC
l、30mM ２−メルカプトエタノール〕を含む遠心管上
に重層し、35000rpm4℃１時間超遠心し、SP6バクテリオ
フアージを沈殿として回収する。沈殿を5mlのリシス（L
ysis）バツフアー〔40mMトリス−HCl（pH8.0）、10mM E
DTA、２％SDS、100μg/mlプロテイネース（proteinas
e）Ｋ〕に溶解し、55℃１時間反応させた。
NaseI、RNaseAを各々1mg加え室温で30分間培養する。次
いで29gの食塩を加え４℃１時間放置後遠心分離し、上
清を回収する。回収した上清１に60gのポリエチレン
グリコール＃6000を加え溶解後４℃１晩放置する。１晩
放置後、遠心分離によりSP6バクテリオフアージを沈殿
区分として回収する。回収した沈殿区分を6mlのＢ−Ａ
−バツフアー〔0.5％ノニデツトP40（シエル石油社
製）、3.6mM CaCl2、5mM MgCl2、30mMトリス（Tris）−
HCl（pH7.5）、120mM KCl、0.5mM EDTA、30mM ２−メ
ルカプトエタノール〕に溶解する。溶解した液を3mlの4
0％グリセロールバツフアー〔40％グリセロール、0.5％
ノニデツトP40、30mMトリス−HCl（pH7.5）、120mM KC
l、30mM ２−メルカプトエタノール〕を含む遠心管上
に重層し、35000rpm4℃１時間超遠心し、SP6バクテリオ
フアージを沈殿として回収する。沈殿を5mlのリシス（L
ysis）バツフアー〔40mMトリス−HCl（pH8.0）、10mM E
DTA、２％SDS、100μg/mlプロテイネース（proteinas
e）Ｋ〕に溶解し、55℃１時間反応させた。
等量のフエノール溶液〔10mMトリス−HCl（pH8.0）、1m
M−EDTAで飽和したフエノール〕を加え、ゆるやかに混
合した後、遠心分離して水層を採取した（以下この操作
をフエノール処理という）。これに２倍量のエタノール
を加え、−70℃30分間保持した後遠心分離を行い、43.5
kbの鎖長を有するSP6バクテリオフアージDNAの沈殿を得
た（以下この操作をエタノール沈殿という）。エタノー
ルを除去した後3mlのTE溶液〔10mM トリス−HCl（pH8.
0）、1mM EDTA〕に溶解し、次の工程に用いた。
M−EDTAで飽和したフエノール〕を加え、ゆるやかに混
合した後、遠心分離して水層を採取した（以下この操作
をフエノール処理という）。これに２倍量のエタノール
を加え、−70℃30分間保持した後遠心分離を行い、43.5
kbの鎖長を有するSP6バクテリオフアージDNAの沈殿を得
た（以下この操作をエタノール沈殿という）。エタノー
ルを除去した後3mlのTE溶液〔10mM トリス−HCl（pH8.
0）、1mM EDTA〕に溶解し、次の工程に用いた。
（２） SP6バクテリオフアージDNAの制限酵素切断地図
の作製 上記（１）で得たバクテリオフアージSP6DNA2μｇをHin
d III、5Uで最適条件〔10mM トリス−HCl（pH7.5）、7
mM MgCl2、60mM NaCl〕で37℃１時間反応させ、１％ア
ガロースゲル電気泳動により解析した。制限酵素切断地
図を第２図に示す。第２図中、Ａ〜Ｎは、Hind III切断
DNA断片を示す。
の作製 上記（１）で得たバクテリオフアージSP6DNA2μｇをHin
d III、5Uで最適条件〔10mM トリス−HCl（pH7.5）、7
mM MgCl2、60mM NaCl〕で37℃１時間反応させ、１％ア
ガロースゲル電気泳動により解析した。制限酵素切断地
図を第２図に示す。第２図中、Ａ〜Ｎは、Hind III切断
DNA断片を示す。
（３） Ｔ−7RNAポリメラーゼと類似性を有する領域の
解析 第２図に示す制限酵素地図及びカサベツテイスらの報告
〔ジヤーナル オブ バイオケミストリー第257巻、第5
779頁（1982年）〕、スタールらの報告〔ジヤーナル
オブ モレキユラー バイオロジー（Journal of Molec
ular Biology）第148巻、第481頁（1981年）〕より、Hi
nd III−Ｃ断片（6.2kb）上に、RNAポリメラーゼ遺伝子
情報がコードされている可能性が示唆されたので、一部
分DNAシークエンスを明らかにし、アミノ酸シークエン
スに変換後T7RNAポリメラーゼとの類似性を比較した。
解析 第２図に示す制限酵素地図及びカサベツテイスらの報告
〔ジヤーナル オブ バイオケミストリー第257巻、第5
779頁（1982年）〕、スタールらの報告〔ジヤーナル
オブ モレキユラー バイオロジー（Journal of Molec
ular Biology）第148巻、第481頁（1981年）〕より、Hi
nd III−Ｃ断片（6.2kb）上に、RNAポリメラーゼ遺伝子
情報がコードされている可能性が示唆されたので、一部
分DNAシークエンスを明らかにし、アミノ酸シークエン
スに変換後T7RNAポリメラーゼとの類似性を比較した。
SP6DNA100μｇをHind III 300Uで切断後１％アガロース
ゲル電気泳動した。泳動後6.2kbのHind III−Ｃ断片を
含むアガロースゲルを切出し、透析チユーブ中電気泳動
し緩衝液中に溶出し、エタノール沈殿により回収した。
ゲル電気泳動した。泳動後6.2kbのHind III−Ｃ断片を
含むアガロースゲルを切出し、透析チユーブ中電気泳動
し緩衝液中に溶出し、エタノール沈殿により回収した。
このDNA断片をKpn I、Sau3A制限酵素で切断し、メツシ
ングらのM13ジデオキシ シークエンス（dideoxy seque
nce）法〔メソツド イン エンザイモロジー（Method
in Enzymology）第101巻、第20頁（1983年）〕に従いシ
ークエンスを行つた。すなわち、Kpn I、Sau 3A DNA断
片をM13mp 18ベクターのBam H I、Kpn I部位に結合
し、大腸菌JM109に形質感染する。得られたフアージプ
ラークを、1.5mlの2YT培地（バクトトリプトン16g/、
酵母エキス8g/、食塩5g/、pH7.2）で培養し、１本
鎖DNAを回収しシークエンスを行つた。約100bpをシーク
エンスし、アミノ酸シークエンスに変換しT7 RNAポリ
メラーゼアミノ酸シークエンスと比較したところ、高い
類似性が認められ、Kpn I制限酵素部位を含む約2.75kb
上にSP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子情報
がコードされることが示唆された。
ングらのM13ジデオキシ シークエンス（dideoxy seque
nce）法〔メソツド イン エンザイモロジー（Method
in Enzymology）第101巻、第20頁（1983年）〕に従いシ
ークエンスを行つた。すなわち、Kpn I、Sau 3A DNA断
片をM13mp 18ベクターのBam H I、Kpn I部位に結合
し、大腸菌JM109に形質感染する。得られたフアージプ
ラークを、1.5mlの2YT培地（バクトトリプトン16g/、
酵母エキス8g/、食塩5g/、pH7.2）で培養し、１本
鎖DNAを回収しシークエンスを行つた。約100bpをシーク
エンスし、アミノ酸シークエンスに変換しT7 RNAポリ
メラーゼアミノ酸シークエンスと比較したところ、高い
類似性が認められ、Kpn I制限酵素部位を含む約2.75kb
上にSP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子情報
がコードされることが示唆された。
（４） SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子
を含む2.75kb DNA断片のクローニング 上記（３）で得たHind III−C DNA断片30μｇを、制限
酵素Dra I 100U、Bbi II 100Uを用い、制限酵素緩衝液
〔トリス−HCl（pH−7.4）、5mM HgCl2、7mM ２−メル
カプトエタノール、0.01％BSA〕中30℃２時間反応させ
切断した。このDNA断片を１％アガロースゲル電気泳動
で分離し、（３）で示す方法により3.4kb DNA断片10μ
ｇを回収した（Ｄ−Ｂ DNA断片）。
を含む2.75kb DNA断片のクローニング 上記（３）で得たHind III−C DNA断片30μｇを、制限
酵素Dra I 100U、Bbi II 100Uを用い、制限酵素緩衝液
〔トリス−HCl（pH−7.4）、5mM HgCl2、7mM ２−メル
カプトエタノール、0.01％BSA〕中30℃２時間反応させ
切断した。このDNA断片を１％アガロースゲル電気泳動
で分離し、（３）で示す方法により3.4kb DNA断片10μ
ｇを回収した（Ｄ−Ｂ DNA断片）。
更に、3.4kbのＤ−Ｂ DNA断片５μｇを、エキソヌクレ
アーゼBal 31 5Uを用い、Bal緩衝液〔20mM トリス−HC
l（pH8.0）、12mM CaCl2、12mM MgCl2、1mM EDTA、600m
M NaCl〕中20℃５分反応させ、0.5M EDTA 10μを加
え反応を停止後、フエノール処理、エタノール沈殿によ
りDNAを回収した（Bal・DNA断片）。
アーゼBal 31 5Uを用い、Bal緩衝液〔20mM トリス−HC
l（pH8.0）、12mM CaCl2、12mM MgCl2、1mM EDTA、600m
M NaCl〕中20℃５分反応させ、0.5M EDTA 10μを加
え反応を停止後、フエノール処理、エタノール沈殿によ
りDNAを回収した（Bal・DNA断片）。
ベクターとしては、pBR322を用いた。pBR322の２μｇ
を、制限酵素Eco RV 5Uで緩衝液〔10mM トリス−HCl
（pH7.5）、7mM MgCl2、150mM NaCl、7mM ２−メルカ
プトエタノール、0.01％BSA〕中37℃１時間反応させ
た。65℃10分間加熱して制限酵素を失活させた後、エタ
ノール沈殿し、DNAを回収した。このDNAをBAP緩衝液〔1
00mM トリス−HCl（pH8.0）〕に溶解し、1Uのアルカリ
ホスフアターゼを加え、55℃30分間反応させ、フエノー
ル処理、エタノール沈殿を行い、ベクターDNAを回収し
た。
を、制限酵素Eco RV 5Uで緩衝液〔10mM トリス−HCl
（pH7.5）、7mM MgCl2、150mM NaCl、7mM ２−メルカ
プトエタノール、0.01％BSA〕中37℃１時間反応させ
た。65℃10分間加熱して制限酵素を失活させた後、エタ
ノール沈殿し、DNAを回収した。このDNAをBAP緩衝液〔1
00mM トリス−HCl（pH8.0）〕に溶解し、1Uのアルカリ
ホスフアターゼを加え、55℃30分間反応させ、フエノー
ル処理、エタノール沈殿を行い、ベクターDNAを回収し
た。
Bal・DNA断片0.1μｇと、Eco RV切断したpBR 322 DNA0.
15μｇをT4 DNAリガーゼ100Uを用いリガーゼ緩衝液〔66
mM トリス−HCl（pH7.6）、6.6mM MgCl2、10mM DTT、
0.5mM ATP〕中16℃４時間反応させ、Bal・DNA断片とpB
R322を結合させた。
15μｇをT4 DNAリガーゼ100Uを用いリガーゼ緩衝液〔66
mM トリス−HCl（pH7.6）、6.6mM MgCl2、10mM DTT、
0.5mM ATP〕中16℃４時間反応させ、Bal・DNA断片とpB
R322を結合させた。
大腸菌HB101株を5mlのＬ培地（バクトトリプトン10g/
、酵素エキス5g/、食塩5g/、pH7.2）で37℃、16
時間培養した。この0.1mlを5mlの新らしいＬ培地に接種
して、600nmのOD（光学濃度）が0.6になるまで振とう培
養した。この2.5mlを氷冷し3000rpmで10分遠心し、上清
を完全に除去した。これに予め氷冷した0.1M CuCl2の
2.5mlを加え混合した後遠心分離により上清を除去し
た。更に、氷冷した0.1M CuCl2を1.25ml加え穏やかに
均一に混合し、氷水中30分保持した後、遠心分離で上清
を除去した。これに、Bal・DNA断片とpBR322を結合させ
たDNA溶液10μを加え氷水中に30分保持した。次に42
℃90秒加熱し、Ｌ培地2mlを加え、37℃30分保持した。
、酵素エキス5g/、食塩5g/、pH7.2）で37℃、16
時間培養した。この0.1mlを5mlの新らしいＬ培地に接種
して、600nmのOD（光学濃度）が0.6になるまで振とう培
養した。この2.5mlを氷冷し3000rpmで10分遠心し、上清
を完全に除去した。これに予め氷冷した0.1M CuCl2の
2.5mlを加え混合した後遠心分離により上清を除去し
た。更に、氷冷した0.1M CuCl2を1.25ml加え穏やかに
均一に混合し、氷水中30分保持した後、遠心分離で上清
を除去した。これに、Bal・DNA断片とpBR322を結合させ
たDNA溶液10μを加え氷水中に30分保持した。次に42
℃90秒加熱し、Ｌ培地2mlを加え、37℃30分保持した。
アンピシリン50μg/mlを含むＬ寒天培地に塗布した。37
℃で生育したコロニーを分離し、テトラサイクリン15μ
g/mlを含むＬ寒天培地で生育できないコロニーを分離し
た後、プラスミドの解析を行つた。
℃で生育したコロニーを分離し、テトラサイクリン15μ
g/mlを含むＬ寒天培地で生育できないコロニーを分離し
た後、プラスミドの解析を行つた。
アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性株を50μg/
mlのアンピシリンを含む5mlのＬ培地で37℃16時間培養
した後集菌した。これに、0.2mlの溶液Ｉ〔50mMグルコ
ース、10mM トリス−HCl（pH8.0）、5mM EDTA、2mg/ml
リソザイム（Lysozyme）〕を加え氷水中30分保持した
後、0.4mlの溶液II（0.2N NaOH、１％SDS）を加えた。
５分後0.3mlの溶液III〔3M 酢酸ナトリウム（pH4.
8）〕を加え、０℃30分保持した後、遠心分離し上清を
回収した。エタノール沈殿し、0.2mlの溶液IV〔25mM
トリス−HCl（pH8.5）、1mM EDTA、150mM NaCl、RNaSe
A 1mg/ml〕に溶解し、37℃30分反応させた。これに0.2
mlの溶液Ｖ（20％ポリエチレングリコール＃6000、2M
NaCl）を加え、混合後、−20℃30分保持した。
mlのアンピシリンを含む5mlのＬ培地で37℃16時間培養
した後集菌した。これに、0.2mlの溶液Ｉ〔50mMグルコ
ース、10mM トリス−HCl（pH8.0）、5mM EDTA、2mg/ml
リソザイム（Lysozyme）〕を加え氷水中30分保持した
後、0.4mlの溶液II（0.2N NaOH、１％SDS）を加えた。
５分後0.3mlの溶液III〔3M 酢酸ナトリウム（pH4.
8）〕を加え、０℃30分保持した後、遠心分離し上清を
回収した。エタノール沈殿し、0.2mlの溶液IV〔25mM
トリス−HCl（pH8.5）、1mM EDTA、150mM NaCl、RNaSe
A 1mg/ml〕に溶解し、37℃30分反応させた。これに0.2
mlの溶液Ｖ（20％ポリエチレングリコール＃6000、2M
NaCl）を加え、混合後、−20℃30分保持した。
遠心分離で沈澱を回収後、TE溶液に溶解し、フエノール
処理、エタノール沈殿によりプラスミドDNAを回収し、1
0μのTE溶液に溶解した。
処理、エタノール沈殿によりプラスミドDNAを回収し、1
0μのTE溶液に溶解した。
このDNA溶液をBam H I、Hind IIIで切断後、アガロース
ゲル電気泳動を行つて組込まれたDNA断片のサイズを調
べた結果、最長2.75kbのDNAを含む種々のサイズのプラ
スミドが得られた。この2.75kbのDNAを含むプラスミド
をpSP6−１と命名した。該プラスミドを保有する大腸菌
は、Escherichia coli HB101/pSP6−１と表示して、工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第1418号
（FERM BP−1418）として寄託されている。該プラスミ
ドは、SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子全
領域を含むプラスミドである。
ゲル電気泳動を行つて組込まれたDNA断片のサイズを調
べた結果、最長2.75kbのDNAを含む種々のサイズのプラ
スミドが得られた。この2.75kbのDNAを含むプラスミド
をpSP6−１と命名した。該プラスミドを保有する大腸菌
は、Escherichia coli HB101/pSP6−１と表示して、工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第1418号
（FERM BP−1418）として寄託されている。該プラスミ
ドは、SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子全
領域を含むプラスミドである。
（５） SP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子
を含むDNA断片と、pUC18との結合及び大腸菌への導入 （４）で得たプラスミドpSP6−1DNAをBam H I、Hind II
Iで切断し、アガロースゲル電気泳動により、前期2.75k
bのDNAを含む3.1kbp DNA断片を得た。また、pUC18DNA
も、Bam H I、Hind IIIで切断し、（４）で示す方法で
アルカリンホスフアターゼ処理を行いベクターDNAを得
た。
を含むDNA断片と、pUC18との結合及び大腸菌への導入 （４）で得たプラスミドpSP6−1DNAをBam H I、Hind II
Iで切断し、アガロースゲル電気泳動により、前期2.75k
bのDNAを含む3.1kbp DNA断片を得た。また、pUC18DNA
も、Bam H I、Hind IIIで切断し、（４）で示す方法で
アルカリンホスフアターゼ処理を行いベクターDNAを得
た。
両DNA断片を（４）に示す方法で結合後、大腸菌JM109株
に形質導入した。（４）と同様の方法でプラスミドを解
析した結果、3.1kbのDNA断片を含むことが明らかとな
り、このプラスミドをpSP6−２と命名した。
に形質導入した。（４）と同様の方法でプラスミドを解
析した結果、3.1kbのDNA断片を含むことが明らかとな
り、このプラスミドをpSP6−２と命名した。
（６） プラスミドpSP6−２を導入した大腸菌（エシエ
リア・コーリーJM109/pSP6−２）によるSP6バクテリオ
フアージRNAポリメラーゼの生産（参考例） 上記大腸菌をアンピシリン50μg/mlを含む10mlのＬ培地
に接種し、37℃16時間前培養した。これを500mlのＬ培
地を含む２容フラスコに移し、37℃５時間（120rpm）
した後、IPTG（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド）50mg/を加えたのち、更に３時間培
養した。集菌後緩衝液VI〔50mM トリス−HCl（pH8.
0）、10％砂糖、10mM ２−メルカプトエタノール〕15m
lに懸濁する。これに20μg/mlのPMSF（フエニルメタン
スルホニルフルオライド）、2mg/mlのリゾチームを加
え、氷水中30分保持する。
リア・コーリーJM109/pSP6−２）によるSP6バクテリオ
フアージRNAポリメラーゼの生産（参考例） 上記大腸菌をアンピシリン50μg/mlを含む10mlのＬ培地
に接種し、37℃16時間前培養した。これを500mlのＬ培
地を含む２容フラスコに移し、37℃５時間（120rpm）
した後、IPTG（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド）50mg/を加えたのち、更に３時間培
養した。集菌後緩衝液VI〔50mM トリス−HCl（pH8.
0）、10％砂糖、10mM ２−メルカプトエタノール〕15m
lに懸濁する。これに20μg/mlのPMSF（フエニルメタン
スルホニルフルオライド）、2mg/mlのリゾチームを加
え、氷水中30分保持する。
30分後0.05％になる様デオキシコール酸と0.12gのスペ
ルミジンを加えかくはんする。５分後、10500×g1時間
超遠心し、上澄を回収する。この分画で活性を測定した
ところ、80万ＵのSP6バクテリオフアージRNAポリメラー
ゼが生産されており、サルモネラ チフイムリウムLT2
にSP6を感染させた場合に比べ約30倍生産性が増大し
た。
ルミジンを加えかくはんする。５分後、10500×g1時間
超遠心し、上澄を回収する。この分画で活性を測定した
ところ、80万ＵのSP6バクテリオフアージRNAポリメラー
ゼが生産されており、サルモネラ チフイムリウムLT2
にSP6を感染させた場合に比べ約30倍生産性が増大し
た。
以上詳細に説明した通り、本発明によりSP6バクテリオ
フアージRNAポリメラーゼ遺伝子を含むDNA断片が単離さ
れた。該DNA断片を含有するプラスミドで形質転換した
微生物により遺伝子工学において有用なSP6バクテリオ
フアージRNAポリメラーゼを効率よく製造することが可
能となつた。
フアージRNAポリメラーゼ遺伝子を含むDNA断片が単離さ
れた。該DNA断片を含有するプラスミドで形質転換した
微生物により遺伝子工学において有用なSP6バクテリオ
フアージRNAポリメラーゼを効率よく製造することが可
能となつた。
第１図はSP6バクテリオフアージRNAポリメラーゼ遺伝子
を含む2.75kb DNAの制限酵素切断地図、第２図はSP6バ
クテリオフアージDNAの制限酵素Hind III切断地図であ
る。
を含む2.75kb DNAの制限酵素切断地図、第２図はSP6バ
クテリオフアージDNAの制限酵素Hind III切断地図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】添付図面の第１図で表される制限酵素地図
を有し、その長さが2.75kbであり、かつSP6バクテリオ
フアージRNAポリメラーゼをコードする遺伝子を含むDNA
断片。 - 【請求項２】添付図面の第１図で表される制限酵素地図
を有し、その長さが2.75kbであり、かつSP6バクテリオ
フアージRNAポリメラーゼをコードする遺伝子を含むDNA
断片が組込まれたプラスミドを保有する新規微生物。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61248503A JPH0763371B2 (ja) | 1986-10-21 | 1986-10-21 | Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物 |
| GB8723719A GB2197651B (en) | 1986-10-21 | 1987-10-09 | Rna polymerase gene microorganism having said gene and the production of rna polymerase by the use of said microorganism |
| DE19873735379 DE3735379A1 (de) | 1986-10-21 | 1987-10-19 | Rna-polymerase-gen, verfahren zu seiner herstellung und mikroorganismus mit diesem gen |
| US07/109,615 US5026645A (en) | 1986-10-21 | 1987-10-19 | RNA polymerase gene, microorganism having said gene and the production of RNA polymerase by the use of said microorganism |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61248503A JPH0763371B2 (ja) | 1986-10-21 | 1986-10-21 | Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63105679A JPS63105679A (ja) | 1988-05-10 |
| JPH0763371B2 true JPH0763371B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=17179143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61248503A Expired - Fee Related JPH0763371B2 (ja) | 1986-10-21 | 1986-10-21 | Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5026645A (ja) |
| JP (1) | JPH0763371B2 (ja) |
| DE (1) | DE3735379A1 (ja) |
| GB (1) | GB2197651B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693489A (en) * | 1984-03-30 | 1997-12-02 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
| US6291164B1 (en) | 1996-11-22 | 2001-09-18 | Invitrogen Corporation | Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate |
| US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
| EP1572902B1 (en) | 2002-02-01 | 2014-06-11 | Life Technologies Corporation | HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES |
| ATE556714T1 (de) | 2002-02-01 | 2012-05-15 | Life Technologies Corp | Doppelsträngige oligonukleotide |
| US20040248094A1 (en) * | 2002-06-12 | 2004-12-09 | Ford Lance P. | Methods and compositions relating to labeled RNA molecules that reduce gene expression |
| GB2406169B (en) * | 2002-06-12 | 2006-11-01 | Ambion Inc | Methods and compositions relating to labeled rna molecules that reduce gene expression |
| US20100075423A1 (en) * | 2002-06-12 | 2010-03-25 | Life Technologies Corporation | Methods and compositions relating to polypeptides with rnase iii domains that mediate rna interference |
| US20060142228A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Ambion, Inc. | Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6595016B1 (en) * | 2002-06-06 | 2003-07-22 | Arzu Demirkiran | Portable refrigerator kit for perishable pet products |
-
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- 1986-10-21 JP JP61248503A patent/JPH0763371B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-10-09 GB GB8723719A patent/GB2197651B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-19 DE DE19873735379 patent/DE3735379A1/de not_active Withdrawn
- 1987-10-19 US US07/109,615 patent/US5026645A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７（１０）（１９８２）ｐ．５７７２−５７８８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3735379A1 (de) | 1988-05-19 |
| GB8723719D0 (en) | 1987-11-11 |
| JPS63105679A (ja) | 1988-05-10 |
| US5026645A (en) | 1991-06-25 |
| GB2197651B (en) | 1990-10-31 |
| GB2197651A (en) | 1988-05-25 |
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