JPH0363356B2 - - Google Patents
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- JPH0363356B2 JPH0363356B2 JP58116149A JP11614983A JPH0363356B2 JP H0363356 B2 JPH0363356 B2 JP H0363356B2 JP 58116149 A JP58116149 A JP 58116149A JP 11614983 A JP11614983 A JP 11614983A JP H0363356 B2 JPH0363356 B2 JP H0363356B2
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- Japan
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- plasmid
- pta5001
- restriction enzyme
- added
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- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酢酸菌ベクターとしてきわめて有用
なプラスミドpTA5001(A)に関するものである。
なプラスミドpTA5001(A)に関するものである。
更に詳細には、本発明は、制限酵素Xho Ｉに
よる認識部位をただ１ケ所有し、かつ酢酸菌への
移入が容易なプラスミドpTA5001(A)に関するも
のである。
よる認識部位をただ１ケ所有し、かつ酢酸菌への
移入が容易なプラスミドpTA5001(A)に関するも
のである。
従来、酢酸菌由来のプラスミドに関しては、ア
セトバクター、アセチNo.1023が分子量17×106ダ
ルトンのプラスミドpTA5001（Agric.Biol.
Chem.46(2)、381〜389、1982）を持つことを及び
グルコノバクター属細菌（醗酵工学雑誌、61(1)、
15−18、1983）の持つプラスミドなどの報告があ
つた。
セトバクター、アセチNo.1023が分子量17×106ダ
ルトンのプラスミドpTA5001（Agric.Biol.
Chem.46(2)、381〜389、1982）を持つことを及び
グルコノバクター属細菌（醗酵工学雑誌、61(1)、
15−18、1983）の持つプラスミドなどの報告があ
つた。
本発明者らは、このプラスミドpTA5001を詳
細に研究したところ、実際は２ケのプラミスドの
混在物であることを知り、更に２ケのプラスミド
の制限酵素開裂地図の作成を完成させ、その用途
を詳細に検討したところ、いずれのプラスミドも
制限酵素Xho Ｉによるう認識部位をただ１ケ所
有し、かつ酢素菌への移入の容易なすぐれたベク
ターであることを認識し、本発明を完成するに至
つた。
細に研究したところ、実際は２ケのプラミスドの
混在物であることを知り、更に２ケのプラスミド
の制限酵素開裂地図の作成を完成させ、その用途
を詳細に検討したところ、いずれのプラスミドも
制限酵素Xho Ｉによるう認識部位をただ１ケ所
有し、かつ酢素菌への移入の容易なすぐれたベク
ターであることを認識し、本発明を完成するに至
つた。
本発明は23.5Kbの分子量で、第１図の制限酵
素開裂地図で示されるプラスミドpTA5001(A)に
関する。
素開裂地図で示されるプラスミドpTA5001(A)に
関する。
本発明のプラスミドpTA5001(A)とプラスミド
pTA5001(B)は同時にアセトバクター・アセチNo.
1023に存在し、該菌よりまず両者の混在物として
分離することができる。
pTA5001(B)は同時にアセトバクター・アセチNo.
1023に存在し、該菌よりまず両者の混在物として
分離することができる。
アセトバクター・アセチNo.1023は酢酸醗酵醪か
ら単位・同定されたものであり（Agric.Biol.
Chem.、44（12）、1901〜2906、1980）、プラスミ
ドpTA5001(A)及びプラスミドpTA5001(B)を含ん
だまま微工研にFERM Ｐ−7122として寄託され
ている。
ら単位・同定されたものであり（Agric.Biol.
Chem.、44（12）、1901〜2906、1980）、プラスミ
ドpTA5001(A)及びプラスミドpTA5001(B)を含ん
だまま微工研にFERM Ｐ−7122として寄託され
ている。
アセトバクター・アセチNo.1023は菌学的性質に
おいてバージイ第８版のアセトバクター・アセチ
の菌学的性質の記載とよく一致し、更に酢酸耐性
及びエタノール酸化能を有することで特徴的であ
り、Acetobacter aceti No.1023（Acer、Eth++）
と表示されることもある。
おいてバージイ第８版のアセトバクター・アセチ
の菌学的性質の記載とよく一致し、更に酢酸耐性
及びエタノール酸化能を有することで特徴的であ
り、Acetobacter aceti No.1023（Acer、Eth++）
と表示されることもある。
アセトバクター・アセチNo.1023は、例えば通常
的には下記のYPG培地で培養され、また形質転
換株の検出にはYPG培地に抗生物質等の薬剤を
適当な濃度となるように、例えばアンピシリンを
50μｇ／mlの濃度となるように、添加したものを
用いて培養される。
的には下記のYPG培地で培養され、また形質転
換株の検出にはYPG培地に抗生物質等の薬剤を
適当な濃度となるように、例えばアンピシリンを
50μｇ／mlの濃度となるように、添加したものを
用いて培養される。
（YPG培地）
イースト エキストラクト 0.5％
ポリペプトン 0.2％
グルコース 3.0％
寒天（固定培地の場合） 2.0％
PH＝6.5
アセトバクター・アセチNo.1023はYPG液体培
地で、30℃で24〜36時間振とう培養し、培養液を
遠心分離処理して集菌される。菌体は緩衝液で十
分洗浄し、緩衝液に懸濁され、これにリゾチーム
が添加され、溶菌される。溶菌液には界面活性剤
及び食塩が添加され、静置後遠心分離し、上清に
ポリエチレングリコールが添加され、静置後遠心
分離し沈澱物を得る。この沈澱物を緩衝液に溶解
し、エチジウムブロマイドを加え、更に塩化セシ
ウムを加え、密度を1.57に合わせ、密度勾配遠心
分離を行こなう。遠心分離後、遠心チユーブに紫
外線ランプで365nｍの紫外線照射により、染色
体バンドの下に出たバンドを分散する。
地で、30℃で24〜36時間振とう培養し、培養液を
遠心分離処理して集菌される。菌体は緩衝液で十
分洗浄し、緩衝液に懸濁され、これにリゾチーム
が添加され、溶菌される。溶菌液には界面活性剤
及び食塩が添加され、静置後遠心分離し、上清に
ポリエチレングリコールが添加され、静置後遠心
分離し沈澱物を得る。この沈澱物を緩衝液に溶解
し、エチジウムブロマイドを加え、更に塩化セシ
ウムを加え、密度を1.57に合わせ、密度勾配遠心
分離を行こなう。遠心分離後、遠心チユーブに紫
外線ランプで365nｍの紫外線照射により、染色
体バンドの下に出たバンドを分散する。
ここで得らえるバンドにはプラスミド
pTA5001(A)とプラスミドpTA5001(B)が混在して
いる。
pTA5001(A)とプラスミドpTA5001(B)が混在して
いる。
混在する２つのプラスミドは制限酵素による解
析の結果、はじめて２種類のほぼ同一分子量のプ
ラスミドの混在物であることが明らかとなつたも
のである。
析の結果、はじめて２種類のほぼ同一分子量のプ
ラスミドの混在物であることが明らかとなつたも
のである。
プラスミドpTA5001(A)の分子量は23.5Kbで、
制限酵素開裂地図は第１図に示される。
制限酵素開裂地図は第１図に示される。
第１図に示される略記号の意味は次の通りであ
る。
る。
Ｅ：coR Ｉ：Escherichia coli RY13
給源の制限酵素
Ｓ：Sal Ｉ：Streptomyces albus Ｇ
給源の制限酵素
Ｘ：Xho Ｉ：Xanthomonas holcicola
給源の制限酵素
本発明のプラスミドpTA5001(A)はXho Ｉによ
つてただ１ケ所のみ切断されることによつてきわ
めて特徴的であつて、この切断部位の他のプラス
ミド断片や染色体断片を導入するのがきわめて容
易である。
つてただ１ケ所のみ切断されることによつてきわ
めて特徴的であつて、この切断部位の他のプラス
ミド断片や染色体断片を導入するのがきわめて容
易である。
本発明のプラスミドpTA5001(A)は酢酸菌ベク
ターとして使用するのに好適である。
ターとして使用するのに好適である。
即ち、プラスミドpTA5001(A)にプラスミド断
片又は染色体断片を導入したものは、酢酸菌（ア
セトバクター属菌、グルコノバクター属菌）に容
易に移入することができ、酢酸菌の形質転換及
び／又は物質生産に新たな画期的手法を提供する
ものである。
片又は染色体断片を導入したものは、酢酸菌（ア
セトバクター属菌、グルコノバクター属菌）に容
易に移入することができ、酢酸菌の形質転換及
び／又は物質生産に新たな画期的手法を提供する
ものである。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 １
DNA受容菌体の調製
アセトバクター・アセチ No.1023、FERM Ｐ
−7122より100μｇ／ml濃度のニトロソグアニジ
ン（NTG）変異処理によつて得られたプロリン
要求性（Pro-）の親株であるアセトバクター・
アセチ10−８（Acer、Eth++、Pro-）から自然変
異によつて得た酢酸耐性およびエタノール酸化能
が低下、欠失（Acess、Eth-）し、かつ、ストレ
プトマイシン耐性（Strrの菌株であるアセトバク
ター・アセチ10−80S1（Acess、Eth-、Pro-、
Strr）を500ml板口フラスコに入れた100mlYPG
液体培地に接種し、30℃で20時間振とう培養し
た。
−7122より100μｇ／ml濃度のニトロソグアニジ
ン（NTG）変異処理によつて得られたプロリン
要求性（Pro-）の親株であるアセトバクター・
アセチ10−８（Acer、Eth++、Pro-）から自然変
異によつて得た酢酸耐性およびエタノール酸化能
が低下、欠失（Acess、Eth-）し、かつ、ストレ
プトマイシン耐性（Strrの菌株であるアセトバク
ター・アセチ10−80S1（Acess、Eth-、Pro-、
Strr）を500ml板口フラスコに入れた100mlYPG
液体培地に接種し、30℃で20時間振とう培養し
た。
培養液は０℃で、6000×ｇで、10分間遠心分離
し、集菌する。菌体は100mM NaCl及び5mM
MgCl2を含有する5mMトリス塩酸緩衝液（PH
7.6）の0.5倍容量で２回洗滌する。再び０℃6000
×ｇで、で５分間遠心分離し、集菌する。
し、集菌する。菌体は100mM NaCl及び5mM
MgCl2を含有する5mMトリス塩酸緩衝液（PH
7.6）の0.5倍容量で２回洗滌する。再び０℃6000
×ｇで、で５分間遠心分離し、集菌する。
この菌体には0.4倍容量のCaCl2溶液（100mM
CaCl2、250mM KCl、5mM MgCl2、5mM
Tris−HCl、PH7.6）が加えられ、０℃で30分間
静置した後０℃で、6000×ｇで、５分間遠心分離
し、集菌する。
CaCl2、250mM KCl、5mM MgCl2、5mM
Tris−HCl、PH7.6）が加えられ、０℃で30分間
静置した後０℃で、6000×ｇで、５分間遠心分離
し、集菌する。
菌体には0.004倍容量の上記CaCl2溶液を添加し
DNA受容菌体懸濁液とした。
DNA受容菌体懸濁液とした。
実施例 ２
プラスミドpTA5001(A)のプラスミドpTA5001
(B)の混在物の単離 アセトバクター・アセチNo.1023、FERM Ｐ−
7122を40mlのYPG培地に植菌し、30℃で一晩振
とう培養した。
(B)の混在物の単離 アセトバクター・アセチNo.1023、FERM Ｐ−
7122を40mlのYPG培地に植菌し、30℃で一晩振
とう培養した。
その後新らしいYPG培地４に１％て植え継
ぎさらに30℃時間振とう培養した。
ぎさらに30℃時間振とう培養した。
集菌後、TE緩衝液（20mM EDTA、50mM
トリス塩酸、PH8.0）で２回菌体を洗浄した。
トリス塩酸、PH8.0）で２回菌体を洗浄した。
得られた湿菌体２ｇあたり２mlのTES緩衝液
（50mM トリス塩酸、20mM EDTA、25％シヨ
糖、PH8.0）を加え、菌体を懸濁し、４mlのリゾ
チーム液（0.25M トリス塩酸、リゾチーム２
％、PH8.0）をさらに加え、０℃で５分静置した。
次に0.25M EDTA液（PH8.0）を４ml加え、０℃
で５分間静置した後、37℃で20分間反応させた。
反応後、３mlの10％ラウリル硫酸ナトリウムを加
え、37℃で20分間静置後、５mlの5M食塩水を加
え、０℃で一夜静置した。48200×ｇで60分間遠
心分離をかけ、上清を分取した。次にこの上清に
最終濃度で10％になるようにポリエチレングリコ
ール6000を加え、４℃で一夜静置した後、3000×
ｇで10分間遠心分離し、沈澱物を得た。この沈澱
物を７mlのUC緩衝液（50mM トリス塩酸、
5mM EDTA、50mM NaCl、PH7.8）に溶解さ
せた後、最終濃度で500μｇ／mlになるようにエ
チジウムブロマイドを加え、さらに塩化セシウム
を加えて密度を1.57に合わせた。この溶液を15
℃、100000×ｇで40時間密度勾配遠心分離をおこ
なつた。遠心分離後、遠心チユーブに紫外線ラン
プで365nｍの紫外線を照射することにより、染
色体バンドの下にあらわれるバンドをプラスミド
分画として分取した。次いで、分画液をイソプロ
パノールで処理し、エチジウムブロマイドを除去
した後、TE緩衝液（10mM トリス塩酸、1mM
EDTA、PH7.5）に対して透析した。これをプラ
スミド混在溶液とした。
（50mM トリス塩酸、20mM EDTA、25％シヨ
糖、PH8.0）を加え、菌体を懸濁し、４mlのリゾ
チーム液（0.25M トリス塩酸、リゾチーム２
％、PH8.0）をさらに加え、０℃で５分静置した。
次に0.25M EDTA液（PH8.0）を４ml加え、０℃
で５分間静置した後、37℃で20分間反応させた。
反応後、３mlの10％ラウリル硫酸ナトリウムを加
え、37℃で20分間静置後、５mlの5M食塩水を加
え、０℃で一夜静置した。48200×ｇで60分間遠
心分離をかけ、上清を分取した。次にこの上清に
最終濃度で10％になるようにポリエチレングリコ
ール6000を加え、４℃で一夜静置した後、3000×
ｇで10分間遠心分離し、沈澱物を得た。この沈澱
物を７mlのUC緩衝液（50mM トリス塩酸、
5mM EDTA、50mM NaCl、PH7.8）に溶解さ
せた後、最終濃度で500μｇ／mlになるようにエ
チジウムブロマイドを加え、さらに塩化セシウム
を加えて密度を1.57に合わせた。この溶液を15
℃、100000×ｇで40時間密度勾配遠心分離をおこ
なつた。遠心分離後、遠心チユーブに紫外線ラン
プで365nｍの紫外線を照射することにより、染
色体バンドの下にあらわれるバンドをプラスミド
分画として分取した。次いで、分画液をイソプロ
パノールで処理し、エチジウムブロマイドを除去
した後、TE緩衝液（10mM トリス塩酸、1mM
EDTA、PH7.5）に対して透析した。これをプラ
スミド混在溶液とした。
得られたプラスミド混在溶液中には２つの環状
プラスミドが混在しており、制限酵素による解析
の結果、第１図に示すプラスミドpTA5001(A)と
第２図に示すプラスミドpTA5001(B)であること
が明らかとなつた。
プラスミドが混在しており、制限酵素による解析
の結果、第１図に示すプラスミドpTA5001(A)と
第２図に示すプラスミドpTA5001(B)であること
が明らかとなつた。
すなわち前記で調製したプラスミド混在溶液に
対し、少なくとも５倍量過剰の制限酵素（EcoR
ＩおよびSal Ｉは宝酒造社製、Xho Ｉは、ベセ
スダ・リサーチ社製を使用した。）を常法に従が
つて各々の制限酵素の至適条件下で反応させた。
反応後、垂直型アガロースゲル電気泳動で分析し
た。即ち、１％のアガロースゲルを用い、トリス
酢酸緩衝液（40mM トリス、20mM 酢酸、
2mM EDTA、PH8.1）中で泳動させた。その後、
ゲルをエチジウムブロマイドの1μｇ／ml液に浸
して染色した。このゲルに紫外線を照射し、生成
断片を数を判断し、各断片の泳動距離から、各々
の分子量を算出した。分子量は、同一アガロース
上で同時に泳動したラムダフアージDNAのHind
切断で生成する分子量既知の各断片の泳動距離
から作成した標準線をもとに算出した。
対し、少なくとも５倍量過剰の制限酵素（EcoR
ＩおよびSal Ｉは宝酒造社製、Xho Ｉは、ベセ
スダ・リサーチ社製を使用した。）を常法に従が
つて各々の制限酵素の至適条件下で反応させた。
反応後、垂直型アガロースゲル電気泳動で分析し
た。即ち、１％のアガロースゲルを用い、トリス
酢酸緩衝液（40mM トリス、20mM 酢酸、
2mM EDTA、PH8.1）中で泳動させた。その後、
ゲルをエチジウムブロマイドの1μｇ／ml液に浸
して染色した。このゲルに紫外線を照射し、生成
断片を数を判断し、各断片の泳動距離から、各々
の分子量を算出した。分子量は、同一アガロース
上で同時に泳動したラムダフアージDNAのHind
切断で生成する分子量既知の各断片の泳動距離
から作成した標準線をもとに算出した。
各種制限酵素を単独で用いて得られた各断片及
び各制限酵素の２種以上を組合わせて用いた処理
によつて得られた各断片の断片数及び分子量など
からpTA5001(A)及びpTA5001(B)の第１図及び第
２図に示した制限酵素開裂地図が決定された。
び各制限酵素の２種以上を組合わせて用いた処理
によつて得られた各断片の断片数及び分子量など
からpTA5001(A)及びpTA5001(B)の第１図及び第
２図に示した制限酵素開裂地図が決定された。
実施例 ３
プラスミドpTA5001(A)とプラスミドpTA5001
(B)の混在物のベクターとしての利用 実施例２で得られたプラスミド混在溶液
（DNA量10μｇ）中に、大腸菌薬剤耐性ベクター
であるpACY177（カナマイシン耐性及びアンピシ
リン耐性；Journal of Bacteriology、134(3)、
1141−1156、1978）を持つ大腸菌（Escherichia
coli C600）から得たプラスミドpACYC177（第３
図に示す。DNA量2μｇ）を添加し、少なくとも
５倍量過剰の制限酵素Xho をＩ常法により至適
条件下で反応させ、反応終了後、等量のフエノー
ルを加え、激しく撹拌して制限酵素を失活させた
後、さらにエーテル抽出を充分行なつてフエノー
ルを除去し、さらに２倍量のエタノールを加えて
−80℃に１時間保持した後、15000rpmで５分間
遠心分離を行なつてDNAを沈降させ、さらに真
空乾燥してエタノールを除去した後、次に沈澱を
溶解後、常法によつてT4DNAリガーゼによる反
応を21℃で２時間行ない、さらに前記と同様にし
てエタノール沈澱、真空乾燥を行なつて得られた
沈澱をTE緩衝液0.1mlに溶解してキメラプラスミ
ド含有溶液を得た。
(B)の混在物のベクターとしての利用 実施例２で得られたプラスミド混在溶液
（DNA量10μｇ）中に、大腸菌薬剤耐性ベクター
であるpACY177（カナマイシン耐性及びアンピシ
リン耐性；Journal of Bacteriology、134(3)、
1141−1156、1978）を持つ大腸菌（Escherichia
coli C600）から得たプラスミドpACYC177（第３
図に示す。DNA量2μｇ）を添加し、少なくとも
５倍量過剰の制限酵素Xho をＩ常法により至適
条件下で反応させ、反応終了後、等量のフエノー
ルを加え、激しく撹拌して制限酵素を失活させた
後、さらにエーテル抽出を充分行なつてフエノー
ルを除去し、さらに２倍量のエタノールを加えて
−80℃に１時間保持した後、15000rpmで５分間
遠心分離を行なつてDNAを沈降させ、さらに真
空乾燥してエタノールを除去した後、次に沈澱を
溶解後、常法によつてT4DNAリガーゼによる反
応を21℃で２時間行ない、さらに前記と同様にし
てエタノール沈澱、真空乾燥を行なつて得られた
沈澱をTE緩衝液0.1mlに溶解してキメラプラスミ
ド含有溶液を得た。
それぞれのキメラプラスミドはいずれもプラス
ミドpACYC177を含有してある。しかし、プラ
スミドpACYC177のカナイマイシン耐性部位に
xho Ｉ切断点があつて、そこが切断されている
ためにカナマイシン耐性は発現せず、アンピシリ
ン耐性のみが発現することになる。
ミドpACYC177を含有してある。しかし、プラ
スミドpACYC177のカナイマイシン耐性部位に
xho Ｉ切断点があつて、そこが切断されている
ためにカナマイシン耐性は発現せず、アンピシリ
ン耐性のみが発現することになる。
次の実施例１で得られたDNA受容菌体懸濁液
0.2mlを用意し、これに上記そるぞれのキメラプ
ラスミド含有用液を加え、０℃で90分間ゆるやか
に撹しつつ、キメラプラスミドの直接導入を行な
つた。
0.2mlを用意し、これに上記そるぞれのキメラプ
ラスミド含有用液を加え、０℃で90分間ゆるやか
に撹しつつ、キメラプラスミドの直接導入を行な
つた。
ここに得られたキメラプラスミド導入菌体を含
む液を３mlのYPG培地に移し、30℃、６時間振
とう培養を行なつた後、アンピシリン50μｇ／ml
添加したYPG培地（固体）上で30℃で５日間培
養し、９株のコロニーを得た。これらを10−
80S1−A1〜−A9と命名した。ことうち、10−
80S1−A1をアンピシリンを30μｇ／ml添加した
YPG液体培地で30℃、24時間振とう培養し、実
施例２の方法に従つてプラスミドを分離して解析
したところ、プラスミドpTA5001(A)とプラスミ
ドpTA5001(B)の混在物以外にこれらよりやや分
子量の大きいプラスミドが得られた。このプラス
ミドは先に導入したキメラプラスミドのうち、
pTA5001(A)とpACYC177がXho Ｉ切断部位を介
して連結したキメラプラスミドと認めらた。ま
た、アセトバクター・アセチ10−80S1はアンピ
シリン耐性を有しないが、10−80S1−A1はアン
ピシリン耐性を持つていることなどからもキメラ
プラスミドが導入され、形質転換が行なわれたこ
とが確認された。
む液を３mlのYPG培地に移し、30℃、６時間振
とう培養を行なつた後、アンピシリン50μｇ／ml
添加したYPG培地（固体）上で30℃で５日間培
養し、９株のコロニーを得た。これらを10−
80S1−A1〜−A9と命名した。ことうち、10−
80S1−A1をアンピシリンを30μｇ／ml添加した
YPG液体培地で30℃、24時間振とう培養し、実
施例２の方法に従つてプラスミドを分離して解析
したところ、プラスミドpTA5001(A)とプラスミ
ドpTA5001(B)の混在物以外にこれらよりやや分
子量の大きいプラスミドが得られた。このプラス
ミドは先に導入したキメラプラスミドのうち、
pTA5001(A)とpACYC177がXho Ｉ切断部位を介
して連結したキメラプラスミドと認めらた。ま
た、アセトバクター・アセチ10−80S1はアンピ
シリン耐性を有しないが、10−80S1−A1はアン
ピシリン耐性を持つていることなどからもキメラ
プラスミドが導入され、形質転換が行なわれたこ
とが確認された。
同様にして、少なくとも10−80S1−A2〜−A6
はpTA5001(B)とpTACYC177が制限酵素Xho Ｉ
切断部位を介して連結したキメラプラスミドが導
入されていることが確認された。
はpTA5001(B)とpTACYC177が制限酵素Xho Ｉ
切断部位を介して連結したキメラプラスミドが導
入されていることが確認された。
また、10−80S1−A1〜−A6の持つキメラプラ
スミドを再度10−80S1に前記と同様の方法で導
入したところ10−80S1−A1〜−A6の各キメラプ
ラスミドにおいて、1μｇDNA量当りに換算して
105個前後のアンピシリン耐性を形質転換株が得
られた。
スミドを再度10−80S1に前記と同様の方法で導
入したところ10−80S1−A1〜−A6の各キメラプ
ラスミドにおいて、1μｇDNA量当りに換算して
105個前後のアンピシリン耐性を形質転換株が得
られた。
第１図はプラスミドpTA5001(A)の制限酵素開
裂地図を示し、第２図はプラスミドpTA5001(B)
の制限酵素開裂地図を示し、第３図はプラスミド
pTCYC177の制限酵素開裂地図を示す。 Ｅ……EcoR Ｉによる切断部位、Ｓ……Sal Ｉ
による切断部位、Ｘ……Xho Ｉによる切断部位、
Km……カナマイシン耐性遺伝子、Am……アン
ピシリン耐性遺伝子。
裂地図を示し、第２図はプラスミドpTA5001(B)
の制限酵素開裂地図を示し、第３図はプラスミド
pTCYC177の制限酵素開裂地図を示す。 Ｅ……EcoR Ｉによる切断部位、Ｓ……Sal Ｉ
による切断部位、Ｘ……Xho Ｉによる切断部位、
Km……カナマイシン耐性遺伝子、Am……アン
ピシリン耐性遺伝子。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 23.5kbの分子量で、下記の制限酵素地図で示
されるプラスミドpTA5001(A)。 ただし、ＥはEcoR Ｉを意味し、ＳはSal Ｉを
意味し、ＸはXho Ｉを意味する。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58116149A JPS609488A (ja) | 1983-06-29 | 1983-06-29 | 酢酸菌ベクタ− |
| JP25431490A JPH03151881A (ja) | 1983-06-29 | 1990-09-26 | プラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ） |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58116149A JPS609488A (ja) | 1983-06-29 | 1983-06-29 | 酢酸菌ベクタ− |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25431490A Division JPH03151881A (ja) | 1983-06-29 | 1990-09-26 | プラスミドｐＴＡ５００１（Ｂ） |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS609488A JPS609488A (ja) | 1985-01-18 |
| JPH0363356B2 true JPH0363356B2 (ja) | 1991-09-30 |
Family
ID=14679964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58116149A Granted JPS609488A (ja) | 1983-06-29 | 1983-06-29 | 酢酸菌ベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS609488A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61139388A (ja) * | 1984-12-11 | 1986-06-26 | Nakano Vinegar Co Ltd | 薬剤耐性遺伝子を用いるグルコノバクタ−属酢酸菌の形質転換方法 |
| US4826768A (en) * | 1987-04-27 | 1989-05-02 | Texaco Inc. | Polyoxyalkylene glycol conversion to monocarboxylic acid |
| JP2993700B2 (ja) * | 1990-02-26 | 1999-12-20 | 株式会社中埜酢店 | 細胞膜結合型アルコール脱水素酵素複合体の構造遺伝子，これを含むプラスミド及び形質転換した酢酸菌 |
| AU2003221332A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-29 | Mitsukan Group Corporation | Squalene-hopene cyclase gene of acetic acid bacterium, acetic acid bacterium bred with the use of the gene, and process for producing vinegar using the acetic acid bacterium |
| JP4429916B2 (ja) * | 2002-12-09 | 2010-03-10 | 株式会社ミツカングループ本社 | 酢酸菌の温度耐性向上遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 |
| US7354751B2 (en) | 2003-03-12 | 2008-04-08 | Mitsukan Group Corporation | Alcohol dehydrogenase gene of acetic acid bacterium |
-
1983
- 1983-06-29 JP JP58116149A patent/JPS609488A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS609488A (ja) | 1985-01-18 |
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