JPH0787782B2 - 改良型ｒｎア−ゼｔ１ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規な改良型RNアーゼT1、さらに詳しくは、天
然型RNアーゼT1のアミノ末端から45番目のチロシンをト
リプトファンに置換してその活性を向上させた改良型RN
アーゼT1、該改良型RNアーゼT1をコードしているDNA配
列、該DNA配列を含有する組み換えDNA発現ベクター、該
ベクターで形質転換した宿主細胞、ならびに該改良型RN
アーゼT1の製造方法に関する。

技術的背景および先行技術 リボヌクレアーゼT1（EC3.1.27.3、以下RNアーゼT1とい
う）はコウジカビ、アスペルギルス・オリザエ（Asperg
illus oryzae）が産生する菌体外リボ核酸分解酵素であ
り、極めて厳密な基質特異性を有し、１本鎖のリボ核酸
およびリボヌクレオチド中のグアノシン３′−リン酸部
分のホスホジエステル結合のみを選択的に切断する。こ
の極めて厳密なグアニン特異性の故に、RNアーゼT1はRN
Aの構造解析において極めて重要な役割を果たしてい
る。

このRNアーゼT1の１次構造は既に決定されており、この
酵素がアミノ酸残基104個からなり、分子内に２個のジ
スルフィド結合を有する、第１図に示したようなポリペ
プチドであることが知られている（文献１および２）。
またＸ線結晶構造解析により、このRNアーゼT1の塩基認
識部位が、アミノ末端から42〜45番目の位置に存在する
Tyr⁴²−Asn⁴³−Asn⁴⁴−Tyr⁴⁵配列であることも知られて
いる（文献３、４および５）。

発明の目的 本発明者等は、RNAの構造解析に有用なこのRNアーゼT1
を修飾して、さらに有用な酵素を得るべく種々検討を行
なった結果、天然型RNアーゼT1のアミノ末端から45番目
のチロシンをトリプトファンに置換することにより、そ
の活性を向上させうることを見い出し本発明を完成する
に至った。すなわち本発明は、天然型RNアーゼT1のアミ
ノ末端から45番目のチロシンをトリプトファンに置換し
た改良型RNアーゼT1を提供するものである。更に本発明
は、該改良型RNアーゼT1をコードしているDNA配列、該D
NA配列を含有する組み換えDNA発現ベクター、該ベクタ
ーで形質転換した宿主細胞、ならびに該改良型RNアーゼ
T1の製造方法を提供するものである。

発明の構成および効果 本発明の改良型RNアーゼT1は以下のようにして製造する
ことができる。

始めに、改良型RNアーゼT1をコードしているDNA配列を
含有し、かつ５′側にBglII部位および３′側にSalＩ部
位を有するBglII-SalＩフラグメントを調製する。この
フラグメントの５′側には、BglII部位を作製するため
Ｔで始まるコドンたとえば今回の場合Pheに対応するTTC
と、後に融合蛋白からの切断に必要なMetに対応するコ
ドンATGを、RNアーゼT1をコードしているDNA配列の前に
入れた。また３′側には、ペプチド鎖の合成を停止させ
るために２種類の停止コドンTAA、TAGを、RNアーゼT1を
コードしているDNA配列の後に入れた。このフラグメン
トの全DNA配列および該DNA配列がコードしているアミノ
酸配列を以下の配列式１に示す。尚、天然型RNアーゼT1
を所望の場合には、45番目のアミノ酸残基に対応するコ
ドンTGGおよびその相補的な配列CCAをそれぞれTATおよ
びATAに置換すればよい（これにより45番目のアミノ酸T
rpがTyrに換わる）。

このDNAフラグメントの調製は、たとえば以下のように
して行なうことができる。すなわち、全DNA配列をいく
つかのオリゴヌクレオチド単位に分割し、各オリゴヌク
レオチドをリン酸トリエステル法あるいはホスファイト
法等の既知の方法（文献６および７）によって合成す
る。次いで、得られたオリゴヌクレオチドを第２図に示
したようにしてライゲートし（文献６および10）、３′
側にSalＩ部位、５′側にBglII部位を有する目的のDNA
フラグメントを得ることができる。

次に、上記BglII-SalＩフラグメントを組み込んだ組み
換えDNA発現ベクターを第３図のようにして構築する。
すなわち、プラスミドpGH-L9をBglIIおよびSalＩ制限酵
素で消化し、得られたフラグメントと、上記のBglII-Sa
lＩフラグメントをライゲートしてプラスミドpT45Wを得
る。ここで用いるプラスミドpGH-L9は大腸菌（Escheric
hia coli、以下E.コリと称する）trpプロモーター、ヒ
ト成長ホルモン（以下hGHと称する）およびアンピシリ
ン耐性遺伝子（Ap^r）を含有し、このhGH遺伝子の５′側
から2/3の位置にBglII部位およびhGH遺伝子の３′側にS
alＩ部位を有している（このhGH遺伝子のBglII部位より
上流側がコードしているアミノ酸配列をhGHのAB部分、
下流側がコードしているアミノ酸配列をhGHのＣ部分と
称する）。従って、得られるプラスミドpT45Wは、メチ
オニンを介してhGHのAB部分と改良型RNアーゼT1とが結
合した融合タンパク質を発現する。RNアーゼT1分子はメ
チオニンを含有していないので、この融合タンパク質
を、後に、メチオニンのＣ末端部で特異的に切断させる
臭化シアンを作用させることにより、融合タンパク質か
ら分離することができる。尚、上記プラスミドpT45Wの
構築にプラスミドpGH-L9を用いたのは、E.コリtrpプロ
モーターによるRNアーゼT1遺伝子の直接発現がうまくい
かず、一方hGHの合成遺伝子がE.コリtrpプロモーターの
制御下で安定かつ効率的に発現されるという知見に基づ
いている。プラスミドpGH-L9は、大腸菌HB-101に導入さ
れて工業技術院微生物工業研究所に寄託されており（寄
託日：昭和61年11月22日、FERMp-9058）、プラスミドpG
H-L9の供給源として利用することができる。

次いで、常法によりプラスミドpT45Wをアンピシリン感
受性の大腸菌、たとえばE.コリHB101（F^-,hsdS20〔r
B^-，mB^-〕,recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20
（Sm^r）,xyl-5,mtl-1,supE44,λ^-）に導入し、アンピシ
リン含有培地で形質転換体を選択する。この形質転換体
をアンピシリンを含有する適当な増殖培地で増殖させ、
プラスミドpT45Wを取り出し、このプラスミドが正しい
塩基配列を有していることをジデオキシ法（文献14）に
より確認する。この様にして確認されたプラスミドpT45
Wを含有する形質転換体、即ち大腸菌HB-101/pT45Wは工
業技術院微生物工業研究所に寄託されている（寄託日：
昭和61年11月22日、FERMp-9057）。

上記形質転換体を増殖させ、適当なOD₆₆₀値となった時
に３−インドールアクリル酸を加えることにより、融合
タンパク質を発現させる。融合タンパク質発現量の測定
は、hGHのAB部分とRNアーゼT1との融合タンパク質が、
完全なhGHの５％の効率で抗体によって認識されるとい
知見に基づいて行なった。すなわち、菌体を集め、常法
によりこれを溶菌し、DNアーゼＩ処理した後、ファデバ
ス（Phadebas）hGH PRISTキットによるhGHのラジオイム
ノアッセイによって、融合タンパク質の定量を行なう
（文献11）。

融合タンパク質からのRNアーゼT1の切り出しは、既述し
たように、メチオニンに特異的な臭化シアンを用いて行
なう。臭化シアンによる切断反応終了後の溶液をNH₄HCO
₃に対して透析した後酵素活性を測定する。すなわち、
この溶液に、５′水酸基を［γ³²−Ｐ］ATPおよびポリ
ヌクレオチドキナーゼでラベルした基質³²pGpCを加えて
反応させ、ホモクロマトグラフィー法（文献12）によっ
て³²pGpの初期生成量を測定し、これを時間に対してプ
ロットし、その傾きから初速度を求めることによって酵
素活性測定を行なう。

測定結果を後記第１表に示すが、本発明の改良型RNアー
ゼT1は天然型RNアーゼT1に比べてその活性が42％高いこ
とがわかった。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例で使用したポリヌクレオチドキナーゼ、DNAリガ
ーゼ、BglIIおよびSalＩ制限酵素は（株）宝酒造より入
手した。DNアーゼＩはベーリンガー・マンハイム社より
入手した。リゾチームはシグマ社より入手した。基質pG
pCは、オーツカ等の方法（文献８）に従ってジヌクレオ
チドGpCを合成した後、その５′水酸基をポリヌクレオ
チドキナーゼでリン酸化して調製した（文献９）。

実施例１ オリゴデオキシヌクレオチドの合成 A.MU10およびML10以外のオリゴデオキシヌクレオチドの
固相法による合成 A-1.ヌクレオシド樹脂の合成 以下のフローチャート１に示すようにしてヌクレオシド
樹脂10を合成した。

１）３′−〔５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−（デオキ
シリボヌクレオシド）〕モノサクシネート（7）の合成 ３′−（５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジニル）モ
ノサクシネートの合成例を示す。

ジメトキシトリチルチミジン2.72g（5mモル）をピリジ
ンと共沸した後、塩化メチレン20mlに溶解し、無水コハ
ク酸750mg（7.5mモル）および４−ジメチルアミノピリ
ジン（DMAP）916mg（7.5mモル）を加えて２時間撹拌し
た。TLC（CHCL₃:MeOH＝20:1）で原料の消失を確認し、
0.5M KH₂PO₄（pH5）（20ml×２回）で洗浄した後、水洗
（20ml×２回）し溶媒を留去した。精製はC18シラン化
シリカゲルカラムにより行なった。収量3.14g（4.88mモ
ル）、収率97.5％。

２）ペンタクロロフェニル３′−〔５′−Ｏ−ジメトキ
シトリチル−（デオキシリボヌクレオシド）〕サクシネ
ートの合成 ペンタクロロフェニル３′−（５′−Ｏ−ジメトキシト
リチルチミジニル）サクシネートの合成例を示す。

ジメトキシトリチルチミジニルモノサクシネート3.14g
（4.9mモル）をN,N−ジメチルホルムアミド34.1mlに溶
解し、ペンタクロロフェノール1.43g（5.4mモル）とN,
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド1.51g（7.3mモ
ル）を加えて室温で一晩撹拌した。TLC（CHCl₃:MeOH＝1
0:1）で反応の完結を確認した後、沈澱を濾別し溶媒を
留去した。残査にベンゼン15mlを加えて析出する不溶物
を濾別した後、ベンゼンを留去した。この残査をクロロ
ホルム15mlに溶解し、ｎ−ペンタン中に滴下して粉末化
した。収量3.89g（4.35mモル）、収率89.2％。

３）ヌクレオシド樹脂（10）の合成 チミジン−ポリスチレン樹脂（Ｎ・Ｔ）の合成例を示
す。

アミノメチル化ポリスチレン（9、１％ ジビニルベン
ゼン、NH₂:0.20mモル/g）2.5g（0.5mモル）をN,N−ジメ
チルホルムアミド15mlに懸濁し、ペンタクロロフェニル
３′−（５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジニル）サ
クシネート1.34g（1.5mモル）とトリエチルアミン0.23m
l（1.15mモル）を加えて一晩振盪した。反応液を濾過
し、樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド（20ml×２回）
およびピリジン（20ml×２回）で洗浄した後、0.1M4−
ジメチルアミノピリジンのピリジン溶液4.5mlと無水酢
酸0.5mlを加えて10分間振盪した。反応液を濾過し、樹
脂をピリジン（20ml×３回）、ジクロロメタン（20ml×
３回）およびエーテル（20ml×３回）で順次洗浄後乾燥
させた。

ヌクレオシドの定量は、チミジン−ポリスチレン樹脂10
mgに２％ベンゼンスルホン酸の塩化メチレン−メタノー
ル（7:3v/v）溶液2mlを加えて１分間振盪し、反応液の1
/100をとって溶媒を留去した後、残査にHClO₄‐EtOH
（3:2v/v）3mlを加え、λ＝500nmにおける吸光度を測定
することにより行なった。以上、塩基がチミンであるヌ
クレオシドについて記載したが、他の塩基を持つヌクレ
オシド樹脂の場合も同様の方法で調製した。

A-2.オリゴデオキシヌクレオチドの合成 A-1で得たヌクレオシド樹脂20〜30mg（３〜５μモル）
に対し下記の第１表の操作を繰り返すことにより行なっ
た。工程１〜５で、塩化メチレン−メタノール（7:3v/
v）中の２％ベンゼンスルホン酸により５′水酸基の保
護基であるジメトキシトリチル基を除去し、次に工程６
〜９で、常法により合成したダイマーブロックまたはモ
ノマーを樹脂に対して３〜４当量用いて縮合した。縮合
剤メシチレンスルホニルニトロトリアゾリドは樹脂に対
して15〜20当量用い、縮合反応は、40℃で20分間、30℃
で30分間、室温（20〜25℃）で40分間行なった。縮合さ
せた後、前記フローチャートの工程10〜12で未反応の
５′−水酸基を、４−ジメチルアミノピリジン触媒下、
無水酢酸でキャッピングを行なった。この一連の操作を
目的鎖長に達するまで行なった。（フローチャート１の
化合物番号11〜13参照）。

A-3.オリゴデオキシヌクレオチドの樹脂からの切り出
し、脱保護、精製および同定 目的鎖長に達したヌクレオチド樹脂をジオキサンで洗浄
した後、0.5M 1,1,3,3−テトラメチルグアニジウム−sy
n−ピリジン−２−アルドキシメートのジオキサン−水
（9:1）溶液1mlを加え、30℃で一晩振盪した。溶液を濾
過した後、樹脂を50％ピリジン水で洗浄した。濾液と洗
液を留去し、残査にピリジン0.5mlとアンモニア水（28
％ NH₄OH）10mlを加えて封管し、55℃で５時間加熱し
た後、溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーにより精製した。

目的物を含むフラクションにについて溶媒を留去した
後、80％酢酸1mlを加えた。20分後溶媒を留去し、水で
共沸を行なった。残査を水3mlに溶解し、酢酸エチル（3
ml×３回）でトリタノールを抽出除去した後、水層を留
去した。得られた完全脱保護遺伝子断片をC18HPLCによ
り分析分取を行なった。更にこれをイオン交換HPLCによ
り分析し、不純物が認められる時は分取し、HPLCで単一
ピークとなるまで精製を行なった。精製した遺伝子断片
は二次元ホモクロマトグラフィー（Mobility Shift Ana
lysis）および５′−末端分析によりその塩基配列が正
しいことを確認した。

B.オリゴデオキシヌクレオチドMU10およびML10の合成 原料となる４種のホスホアミダイトはヌクレオシドの塩
基部のアミノ基を常法により保護した後、文献７の方法
に従ってアミデート体としたものを用いた。

オリギヌクレオチドの合成はアプライド・バイオシステ
ム社のDNAシンセサイザー（Model 380A）を用いて行な
った。

脱保護は５′水酸基の保護基であるジメトキシトリチル
基以外の保護基についてDNAシンセサイザー中で行い、
以後、上記A-3と同様にしてオリゴヌクレオチドの精
製、同定を行なった。

実施例２ 改良型RNアーゼT1をコードしているDNA配列
を含有するBglII-SalＩフラグメントの調製 A.5′リン酸化 U1、L21以外の各オリゴヌクレオトド0.1OD（≒750pモ
ル、５μｇ）を、50mMトリス・HCl（pH8.0）、10mM MgC
l₂、10mM β‐ME、1mM スペルミン緩衝液中、10μモル
のATPと6Uのポリヌクレオチドキナーゼを加えて10μｌ
とし、37℃で１時間反応させ、５′水酸基をリン酸化し
た（U1とL21の５′水酸基は制限酵素部位となっている
ので、先にリン酸化してから結合反応を行なうとダイマ
ーになるため、結合反応を行なってからリン酸化を行な
った）。反応後90℃で３分間加熱して酵素を失活させ
た。

B.セグメントの調製 U1、L21および５′リン酸化したオリゴヌクレオチド
を、第２図に示した各セグメント（Ｉ〜IV）の構成要素
ごとに１本のチューブに集めて混和し、66mM トリス・
HCl（pH7.6）、6.6mM MgCl₂、0.5mM ATP緩衝液150μｌ
となるようにして90℃で３分間熱処理を行ない、直ちに
氷につけて急冷した。10分後再び75℃に加熱してから室
温（20℃〜25℃）まで１〜２時間かけて放冷し、アニー
リングを行なった。この後15℃で10分間保った後、β‐
MEを10mMになるように加え、T4DNAリガーゼを30U加え、
15℃で12〜15時間反応させた（セグメントIIIについて
は反応の収率を上げるため２つにわけそれぞれをアニー
リングさせ、２〜３時間結合反応を行なわせた後、１つ
に混和した）。反応後、65℃で５分間加熱して酵素を失
活させ、続いてエタノール沈澱によりDNAを回収した。1
0％PAGE（ポリアクリルアミド電気泳動、サイズ（0.1×
20×20cm）、CV175V、３〜４時間）を行ない、目的の鎖
長のセグメントのバンド部から電気溶離によりDNAを回
収し、フェノール処理、エタノール沈澱を行ない、各セ
グメント15〜25μｇ（225〜375pモル）を得た。

C.BglII-SalＩフラグメントの調製 各セグメントを3.3μｇ（50pモル）用いて前述の緩衝液
中、T4DNAリガーゼを15U加えて結合反応を行なった。こ
の際アニーリングは行なわず、20℃で12〜15時間反応さ
せた。反応後65℃で５分間処理し、エタノール沈澱後、
５％PAGE（サイズ0.1×20×20cm）を行なった。RNアー
ゼT1遺伝子の鎖長に対応する部分のバンドを電気溶離に
より回収し、フェノール処理、エタノール沈澱を行なっ
た。さらに前述の条件下、6Uのポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてフラグメントの両５′末端部をリン酸化し
て、改良型RNアーゼT1をコードしているDNA配列を含有
するBglII-SalＩフラグメント約１μｇ（3.8pモル）を
得た。

実施例３ プラスミドpT45Wの構築 改良型RNアーゼT1をコードしているDNA配列を含有する
組み換えDNA発現ベクター、プラスミドpT45Wは、イケハ
ラ等の方法（文献６および10）に従い、以下のようにし
て調製した（第３図参照）。

緩衝液〔20mM トリス・HCl（pH7.6）、7mM MgCl₂、10m
M β‐ME、175mM NaCl〕100μｌ中のプラスミドpGH-L9
（10μｇ）を、37℃で３時間、BglIIおよびSalＩ制限酵
素それぞれ20単位で消化した。この溶液をフェノール抽
出し、次いでエーテル洗浄することによって制限酵素を
除去した。次いでBglII-SalＩ消化フラグメントをエタ
ノール沈殿させ、10mMトリス−HCl（pH7.5）および1mM
のEDTA溶液50μｌに溶解した。このBglII-SalＩフラグ
メント（0.67pモル）と実施例２で調製したBglII-SalＩ
フラグメント（２〜5pモル）を、20℃で一晩、T4 DNAリ
ガーゼ（1.2単位）を用いてライゲートした（合計容量2
0μｌ）。この溶液をフェノール抽出した後、DNAをエタ
ノール沈殿させ、得られた沈殿ペレットをE.コリの形質
転換に用いた。

実施例４ E.コリHB101の形質転換 モリソン等の方法（文献15）により予め調製したコンピ
テントな細胞100μｌおよび実施例３で調製したベクタ
ーDNA溶液10μｌを混合し、１時間放置した後、42℃で7
5秒間処理し、室温で５分間放置した。これにLB培地900
μｌを加え、37℃で１時間培養した。これを集菌し、LB
培地100μｌに懸濁し、寒天培地［1.5％（w/v）寒天、L
B、40μg/mlアンピシリン］にまいて37℃で一晩培養し
た。次いで、形質転換体を20μg/mlのアンピリンを含有
するM9−カザミノ酸培地で増殖させた。菌体を集めて溶
菌し、プラスミドを回収した。ジデオキシ法（文献14）
によってこのプラスミドの塩基配列を調べ、BglII-Sal
Ｉフラグメントを含有していることを確認し、このプラ
スミドをpT45Wと命名した。

実施例５ 融合タンパク質の発現および粗酵素の調製 A.融合タンパク質の発現 0.2％（重量／容量）カザミノ酸および40μg/mlアンピ
シリンを含有するM9培地［5.5g/lのNa₂HPO₄、3g/lのKH₂
PO₄、5g/lのNaCl、1g/lのNH₄Cl、0.4％（重量／容量）
のブドウ糖、1mMのMgSO₄、および0.1mMのCaCl₂］5ml
中、37℃で約15時間、実施例４で調製したE.コリHB101
の形質転換体、E.コリHB101/pT45Wを前培養した。次い
で、この前培養液1.5mlを、上記のカザミノ酸およびア
ンピシリン含有のM9培地50mlに加え、37℃で振盪培養し
た。１〜1.5時間後、OD₆₆₀＝0.01〜0.02となった時にIA
A（３−インドールアクリル酸）を終濃度が40μg/mlに
なるように加え、hGHのAB部分と改良型RNアーゼT1の融
合タンパク質の発現を誘導し、さらに７時間培養した。

B.融合タンパク質発現量の測定 集菌後、菌体をTEN［10mMトリス−HCl（pH8.0）、1mMの
EDTAおよび0.1MのNaCl］洗浄し、次いで、50mMトリス−
HCl（pH8.0）、50mMのEDTA、15％（重量／容量）シュク
ロースおよび0.025％（重量／容量）SDSからなる溶液に
リゾチームを1mg/mlになるように加えた溶液中に入れ
て、０℃で30分間放置した。次いで、900μｌの150mMト
リス−HCl（pH7.5）、280mM MgCl₂、4mM CaCl₂および10
0μｌの1mg/mlDNアーゼＩを加えて、０℃で30分間放置
し、その後凍結乾燥した。これを用いて、ファデバスhG
H PRISTキットによるhGHのラジオイムノアッセイによ
り、融合タンパク質の発現量を測定した（文献11）。そ
の結果、融合タンパク質の発現量は、M9培地100mlあた
り18.9μｇ、全タンパク質あたり0.31％であることがわ
かった。

C.改良型RNアーゼT1の融合タンパク質からの切り出し 実施例5-Bで得た凍結乾燥物を用いて改良型RNアーゼT1
の切り出しを行なった。70％ギ酸および10mMの２−メル
カプトエタノールの溶液に臭化シアンを5mg/mlとなるよ
うに加えた。この溶液にタンパク質を3mg/mlになるよう
に加え、４℃で24時間反応させた。反応後、50〜10mMの
NH₄HCO₃に対して透析を行ない、ギ酸およびBrCNを除
き、液が中性であることを確認してこれを活性測定用の
粗酵素とした。

D.RNアーゼT1活性の測定 ５′水酸基［γ−³²P］ATPとポリヌクレオチドキナーゼ
でラベルした基質³²pGpCの濃度を150μＭ、改良型RNア
ーゼT1の濃度を0.5ng/μｌ（45.1nM）にし、トリス−HC
l（pH7.5）およびEDTAの濃度をそれぞれ50mMおよび1mM
にした全量20μｌの溶液を37℃で反応させた。反応開始
から０、２、５、10、15および30分後に３μｌづつDEAE
−セルロースプレートにスポットし、ホモミックスVIを
用いてホモクロマトグラフィー（文献12）を行なった。
Ｘ線フイルムを感光させ、それをもとにしてプレートの
各スポット部分を切り取ってバイアルに入れ、液体シン
チレーションカウンターによって放射能を測定した。³²
pGpの生成量を時間に対してプロットし、その傾きから
初速度を求めた。得られた結果を、天然型RNアーゼT1に
ついて同様に試験して得た結果と合わせ第２表に示す。

引用文献 1.タカハシ（K.Takahashi）、ジャーナル・オブ・バイ
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座６）、日本生化学会編、東京化学同人、201（1977） 14.サンガー等（F.Sanger et al.）、Proc.Natl.Acad.S
ci.、74、5463（1977） 15.モリソン等（P.A.Morrison et al.）、メソッズ・エ
ンザイモル（Methods Enzymol.）、68、326（1979）

【図面の簡単な説明】

第１図は天然型RNアーゼT1の１次構造を示す模式図であ
り、第２図は改良型RNアーゼT1をコードしているDNA配
列を含有するBglII-SalＩフラグメント調製の工程図で
あり、第３図は組み換えDNA発現ベクター、プラスミドp
T45W構築の工程図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】天然型RNアーゼT1のアミノ末端から45番目
   のチロシンをトリプトファンに置換した改良型RNアーゼ
   T1。
2. 【請求項２】天然型RNアーゼT1のアミノ末端から45番目
   のチロシンをトリプトファンに置換した改良型RNアーゼ
   T1の製造方法であって、 （ａ）該改良型RNアーゼT1をコードしているDNA配列を
   調製し、 （ｂ）該DNA配列を含有する組み換えDNA発現ベクターを
   調製し、 （ｃ）次いで、該組み換えDNA発現ベクターで宿主細胞
   を形質転換して改良型RNアーゼT1を融合タンパク質とし
   て発現させ、 （ｄ）該融合タンパク質を切断して改良型RNアーゼT1を
   得ることからなる方法。