JPH0822875B2 - 精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法 - Google Patents
精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法Info
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- JPH0822875B2 JPH0822875B2 JP32584990A JP32584990A JPH0822875B2 JP H0822875 B2 JPH0822875 B2 JP H0822875B2 JP 32584990 A JP32584990 A JP 32584990A JP 32584990 A JP32584990 A JP 32584990A JP H0822875 B2 JPH0822875 B2 JP H0822875B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、自己免疫病，自己免疫現象の予知，診断，
経過観察の一環として行われる自己抗体検査の抗原試薬
として有効に利用されるRNA結合蛋白質の製造法に関す
る。
経過観察の一環として行われる自己抗体検査の抗原試薬
として有効に利用されるRNA結合蛋白質の製造法に関す
る。
〔従来の技術〕 低分子RNAに特異的に結合する蛋白質としては、細胞
核内の低分子RNAに結合し、RNAのスプライシングに寄与
する一群の蛋白質および細胞質内の低分子RNAに結合
し、RNA代謝調節を司る一群の蛋白質が知られている。
核内の低分子RNAに結合し、RNAのスプライシングに寄与
する一群の蛋白質および細胞質内の低分子RNAに結合
し、RNA代謝調節を司る一群の蛋白質が知られている。
全身性の自己免疫疾患では何らかの機構により該RNA
結合蛋白質に対する抗体を産生するようになり、それが
原因となって例えば炎症，潰瘍，皮疹，乾燥などの様々
な自己免疫現象に伴う病変が発現する。さらに、自己免
疫疾患患者血清中に出現する抗体に対し対応するRNA結
合蛋白質は、該疾患群間で多様であり、例えば全身性紅
斑性狼瘡（SLE），混合性結合組織病（MCTD）では核内R
NA結合蛋白質に対し、乾燥症候群（SjS）では細胞質内
のRNA結合蛋白質に対し高頻度で抗体を産生する。
結合蛋白質に対する抗体を産生するようになり、それが
原因となって例えば炎症，潰瘍，皮疹，乾燥などの様々
な自己免疫現象に伴う病変が発現する。さらに、自己免
疫疾患患者血清中に出現する抗体に対し対応するRNA結
合蛋白質は、該疾患群間で多様であり、例えば全身性紅
斑性狼瘡（SLE），混合性結合組織病（MCTD）では核内R
NA結合蛋白質に対し、乾燥症候群（SjS）では細胞質内
のRNA結合蛋白質に対し高頻度で抗体を産生する。
したがって、これら自己免疫疾患患者血清中に出現す
る各種の自己抗体を検出することの臨床上の本質的意義
は該疾患の診断，経過観察および自己免疫現象の予知に
ある。
る各種の自己抗体を検出することの臨床上の本質的意義
は該疾患の診断，経過観察および自己免疫現象の予知に
ある。
従来から該抗体群を検出するために使用される抗原と
しては、ヒトの培養細胞や哺乳動物細胞の抽出液あるい
は細胞そのものが粗抗原として用いられてきた。これ
は、該蛋白質の抗原性が種を越えて共通であるので自己
免疫疾患患者血清中に見いだされる自己成分に対する抗
体すなわち自己抗体を検出するための抗原としていかな
る哺乳動物由来のものも使用できるからである。また、
細胞核内RNA結合蛋白質に対する抗体群としては、抗リ
ボ核蛋白質抗体群と抗スミス抗体群が、細胞質内RNA結
合蛋白質に対する抗体群としては、抗SSA/Ro抗体群と抗
SSB/La抗体群が広く知られており、これら抗体群の検出
は、因習的に管理された基準血清と上述した粗抗原液と
の反応様式に対比させて、例えば２元免疫拡散法による
出現沈降線の融合現象あるいは蛍光抗体法による培養細
胞の染色像の判読により検出されているにすぎず、抗原
が精製されているものである必要がなかった。
しては、ヒトの培養細胞や哺乳動物細胞の抽出液あるい
は細胞そのものが粗抗原として用いられてきた。これ
は、該蛋白質の抗原性が種を越えて共通であるので自己
免疫疾患患者血清中に見いだされる自己成分に対する抗
体すなわち自己抗体を検出するための抗原としていかな
る哺乳動物由来のものも使用できるからである。また、
細胞核内RNA結合蛋白質に対する抗体群としては、抗リ
ボ核蛋白質抗体群と抗スミス抗体群が、細胞質内RNA結
合蛋白質に対する抗体群としては、抗SSA/Ro抗体群と抗
SSB/La抗体群が広く知られており、これら抗体群の検出
は、因習的に管理された基準血清と上述した粗抗原液と
の反応様式に対比させて、例えば２元免疫拡散法による
出現沈降線の融合現象あるいは蛍光抗体法による培養細
胞の染色像の判読により検出されているにすぎず、抗原
が精製されているものである必要がなかった。
近年、該抗体群に対する抗原の性質，機能が分子生物
学的あるいは蛋白化学的に明らかにされるに至り、精製
抗原を検出試薬として用いる鋭敏で定量的な臨床検査法
を確率する必要性が生じてきている。
学的あるいは蛋白化学的に明らかにされるに至り、精製
抗原を検出試薬として用いる鋭敏で定量的な臨床検査法
を確率する必要性が生じてきている。
RNA結合蛋白質の分離精製法に関しては多くの科学文
献に記載されている（Clin Exp.Immunol.,54,731-738,
（1983）、J.Biol.Chem.,258,2604-2613（1983）な
ど）。大抵の方法においては、イオン交換クロマトグラ
フィ，分子ふるいクロマトグラフィなどの精製対象であ
る蛋白質の物理化学的性質に基づく生化学的分離手段に
より精製が行われる。また、方法によっては、色素等の
吸着体を担体とした吸着クロマトグラフィに精製が行わ
れる（Scand.J.Immunol.,15,1−7,（1982））。
献に記載されている（Clin Exp.Immunol.,54,731-738,
（1983）、J.Biol.Chem.,258,2604-2613（1983）な
ど）。大抵の方法においては、イオン交換クロマトグラ
フィ，分子ふるいクロマトグラフィなどの精製対象であ
る蛋白質の物理化学的性質に基づく生化学的分離手段に
より精製が行われる。また、方法によっては、色素等の
吸着体を担体とした吸着クロマトグラフィに精製が行わ
れる（Scand.J.Immunol.,15,1−7,（1982））。
前述のごとく、単離対象であるRNA結合蛋白質を、蛋
白質の分子量の差、荷電状態の差あるいは或物質への吸
着性の差に基づいて分離する旧来の方法では、他蛋白の
相当量の夾雑は避けがたく、精製倍率の飛躍的増加は見
込めない。これは、生体材料中には同じ物理化学的挙動
を示す蛋白質が存在するからである。したがって、一般
的に上述した方法により特定の蛋白質を分離する場合
は、複数の分離手段を組み合わせることで精製倍率を増
加させる必要があり、精製日数が長期に及ぶことにな
る。
白質の分子量の差、荷電状態の差あるいは或物質への吸
着性の差に基づいて分離する旧来の方法では、他蛋白の
相当量の夾雑は避けがたく、精製倍率の飛躍的増加は見
込めない。これは、生体材料中には同じ物理化学的挙動
を示す蛋白質が存在するからである。したがって、一般
的に上述した方法により特定の蛋白質を分離する場合
は、複数の分離手段を組み合わせることで精製倍率を増
加させる必要があり、精製日数が長期に及ぶことにな
る。
一方、一段階の操作で精製倍率を大幅に増加させる方
法として、生物学的な親和性を利用する方法があり、例
えば単離対象に対し生物学的親和性を有する物質を、リ
ガンドとして固定化した担体を用いるアフィニティクロ
マトグラフィ法等がある。
法として、生物学的な親和性を利用する方法があり、例
えば単離対象に対し生物学的親和性を有する物質を、リ
ガンドとして固定化した担体を用いるアフィニティクロ
マトグラフィ法等がある。
そこで本発明者らは、このような一段階で精製倍率を
大幅に増加させる方法に関し、鋭意検討した結果、本発
明を完成させた。
大幅に増加させる方法に関し、鋭意検討した結果、本発
明を完成させた。
すなわち、本発明は、動物組織，培養細胞、またはそ
れらの加工品からRNA結合蛋白質を抽出し、次いで得ら
れる抽出物を塩またはカオトロピックイオンを含有する
溶液環境下に、ウリジル酸ポリマーをリガンドとする担
体を含むアフィニティゲルに接触させ、その後に該アフ
ィニティゲルに吸着したRNA結合蛋白質を、溶液中の塩
濃度またはカオトロピックイオン濃度を増加させること
により溶離させる工程を含むことを特徴とする精製され
たRNA結合蛋白質の製造法に関する。
れらの加工品からRNA結合蛋白質を抽出し、次いで得ら
れる抽出物を塩またはカオトロピックイオンを含有する
溶液環境下に、ウリジル酸ポリマーをリガンドとする担
体を含むアフィニティゲルに接触させ、その後に該アフ
ィニティゲルに吸着したRNA結合蛋白質を、溶液中の塩
濃度またはカオトロピックイオン濃度を増加させること
により溶離させる工程を含むことを特徴とする精製され
たRNA結合蛋白質の製造法に関する。
動物組織，培養細胞またはそれらの加工品からRNA結
合蛋白質を含む希薄塩可溶性画分を抽出する過程におい
て、同時に可溶化される考えられうるすべての蛋白分解
酵素による侵襲から保護するため蛋白分解酵素に対する
阻害剤を添加した抽出用緩衝液で抽出されるのが好まし
い。さらにこの抽出操作に関し、なるべく多くのRNA結
合蛋白質を得るために被抽出対象物からの抽出は２回行
い、２回の抽出物を合体するのが好ましい。本抽出操作
に用いる抽出用緩衝液の塩濃度は、グロブリン分画の蛋
白質が溶解し易く、かつ核内ヒストンが溶解しない濃度
であれば特に制限はないが、生理的塩濃度で行うのが好
ましい。また、抽出液中のRNA結合蛋白質の検出は操作
が簡易であることから、目的とするRNA結合蛋白質を特
異的に認識する抗血清を用いた２元免疫拡散法により行
うのが好ましい。
合蛋白質を含む希薄塩可溶性画分を抽出する過程におい
て、同時に可溶化される考えられうるすべての蛋白分解
酵素による侵襲から保護するため蛋白分解酵素に対する
阻害剤を添加した抽出用緩衝液で抽出されるのが好まし
い。さらにこの抽出操作に関し、なるべく多くのRNA結
合蛋白質を得るために被抽出対象物からの抽出は２回行
い、２回の抽出物を合体するのが好ましい。本抽出操作
に用いる抽出用緩衝液の塩濃度は、グロブリン分画の蛋
白質が溶解し易く、かつ核内ヒストンが溶解しない濃度
であれば特に制限はないが、生理的塩濃度で行うのが好
ましい。また、抽出液中のRNA結合蛋白質の検出は操作
が簡易であることから、目的とするRNA結合蛋白質を特
異的に認識する抗血清を用いた２元免疫拡散法により行
うのが好ましい。
次いで、上述した方法により抽出した抽出物（未精製
画分）を、所定濃度の塩またはカオトロピックイオンを
含有する弱アルカリの緩衝液に対し十分に透析する。前
記カオトロピックイオンとは、イオン半径の大きい陰イ
オンであり、該イオンは疎水性分子の水溶液を増し、担
体と分離対象物の間の疎水結合を弱める作用をする。カ
オトロピックイオンとしてはSCN-，I-，ClO4 -，NO3 -，B
r-，Cl-，CH3CO2 -，F-，SO4 2-などが挙げられ、その作
用の大きさ（カオトロピシティー）の順は前記の順と同
様である。
画分）を、所定濃度の塩またはカオトロピックイオンを
含有する弱アルカリの緩衝液に対し十分に透析する。前
記カオトロピックイオンとは、イオン半径の大きい陰イ
オンであり、該イオンは疎水性分子の水溶液を増し、担
体と分離対象物の間の疎水結合を弱める作用をする。カ
オトロピックイオンとしてはSCN-，I-，ClO4 -，NO3 -，B
r-，Cl-，CH3CO2 -，F-，SO4 2-などが挙げられ、その作
用の大きさ（カオトロピシティー）の順は前記の順と同
様である。
塩またはカオトロピックイオンを含む化合物として
は、具体的には、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化
マグネシウムなどの溶解度の高い１価または２価の金属
塩化物，チオシアン酸ナトリウム，チオシアン酸カリウ
ムなどのチオシアン酸金属化合物などが挙げられるが、
中でも特に塩化マグネシウムが好ましい。その濃度は塩
の種類により相異し、例えば塩化マグネシウムの場合約
0.1M程度が好ましい。そして、予め該緩衝液で平衡化し
たウリジル酸ポリマーをリガンドとする担体に接触させ
未精製画分中のRNA結合蛋白質を該担体に結合せしめ
る。該担体としては、ポリウリジル酸アガロース（市販
される），ポリウリジル酸をリガンドとしてセファロー
スゲルにカップリングさせたアフィニティゲル等が使用
される。接触させる担体の量は、全蛋白濃度が10mg/ml
の抽出液1mlに対し5ml以上であることが好ましい。さら
にその後、上述したウリジル酸ポリマーをリガンドとす
る担体の平衡化に用いた弱アルカリの緩衝液で該担体を
洗浄する。引き続き担体が懸濁される溶液の塩またはカ
オトロピックイオンの濃度を、抽出液と該担体の接触時
より増加させることによりRNA結合蛋白質を溶離させ
る。溶離回収する方法は、いかなる方法であっても特に
制限はなく、例えばクロマトグラフィ法，バッチ法等が
使用できる。さらに、RNA結合蛋白質の結合したウリジ
ル酸ポリマーをリガンドとする担体が懸濁される溶液の
塩あるいはカオトロピックイオン濃度を増加させる方法
に関しても特に制限はなく、グラジェント法またはステ
ップワイズ法等が採用できる。
は、具体的には、塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化
マグネシウムなどの溶解度の高い１価または２価の金属
塩化物，チオシアン酸ナトリウム，チオシアン酸カリウ
ムなどのチオシアン酸金属化合物などが挙げられるが、
中でも特に塩化マグネシウムが好ましい。その濃度は塩
の種類により相異し、例えば塩化マグネシウムの場合約
0.1M程度が好ましい。そして、予め該緩衝液で平衡化し
たウリジル酸ポリマーをリガンドとする担体に接触させ
未精製画分中のRNA結合蛋白質を該担体に結合せしめ
る。該担体としては、ポリウリジル酸アガロース（市販
される），ポリウリジル酸をリガンドとしてセファロー
スゲルにカップリングさせたアフィニティゲル等が使用
される。接触させる担体の量は、全蛋白濃度が10mg/ml
の抽出液1mlに対し5ml以上であることが好ましい。さら
にその後、上述したウリジル酸ポリマーをリガンドとす
る担体の平衡化に用いた弱アルカリの緩衝液で該担体を
洗浄する。引き続き担体が懸濁される溶液の塩またはカ
オトロピックイオンの濃度を、抽出液と該担体の接触時
より増加させることによりRNA結合蛋白質を溶離させ
る。溶離回収する方法は、いかなる方法であっても特に
制限はなく、例えばクロマトグラフィ法，バッチ法等が
使用できる。さらに、RNA結合蛋白質の結合したウリジ
ル酸ポリマーをリガンドとする担体が懸濁される溶液の
塩あるいはカオトロピックイオン濃度を増加させる方法
に関しても特に制限はなく、グラジェント法またはステ
ップワイズ法等が採用できる。
以上のような工程により、全蛋白量に対する分離精製
の対象であるRNA結合蛋白質の比を飛躍的に増大させる
ことができる。すなわち、他の夾雑蛋白の大部分を除去
することができる。
の対象であるRNA結合蛋白質の比を飛躍的に増大させる
ことができる。すなわち、他の夾雑蛋白の大部分を除去
することができる。
ここで、この方法により精製倍率を飛躍的に増大でき
る具体的なRNA結合蛋白質としては、YRNA複合体蛋白質
を構成するSSB/La蛋白質,SSA/Ro蛋白質，UsnRNA結合蛋
白質を構成する各分子量の蛋白質が挙げられる。
る具体的なRNA結合蛋白質としては、YRNA複合体蛋白質
を構成するSSB/La蛋白質,SSA/Ro蛋白質，UsnRNA結合蛋
白質を構成する各分子量の蛋白質が挙げられる。
以上の工程により得られるRNA結合蛋白質は、例えば
オクタロニ法などの一部の免疫測定法に使用する抗原と
してそのまま用いることができる。さらに分子ふるいク
ロマトグラフィ，イオン交換クロマトグラフィ，吸着ク
ロマトグラフィ、ある種の群特異的クロマトグラフィな
どの操作を少なくとも一段階組み合わせることによりさ
らに高度に精製されたRNA結合蛋白質標品を得ることが
でき、該標品は免疫化学反応を測定原理とするいかなる
自己抗体測定用診断剤に使用する抗原としても用いるこ
とができる。
オクタロニ法などの一部の免疫測定法に使用する抗原と
してそのまま用いることができる。さらに分子ふるいク
ロマトグラフィ，イオン交換クロマトグラフィ，吸着ク
ロマトグラフィ、ある種の群特異的クロマトグラフィな
どの操作を少なくとも一段階組み合わせることによりさ
らに高度に精製されたRNA結合蛋白質標品を得ることが
でき、該標品は免疫化学反応を測定原理とするいかなる
自己抗体測定用診断剤に使用する抗原としても用いるこ
とができる。
次に得られるRNA結合蛋白質を抗原として使用し、被
験対象物中に存在する抗体を検出又は定量する抗RNA結
合蛋白質抗体の測定法について説明する。
験対象物中に存在する抗体を検出又は定量する抗RNA結
合蛋白質抗体の測定法について説明する。
本発明の測定法は、前記抗原を使用しさえすれば、ど
のような測定方法であってもよい。例えば、酵素免疫測
定法，放射免疫測定法，免疫比濁法，免疫比ろう法，ラ
テックス凝集法，血球凝集法，蛍光免疫測定法，免疫化
学発光法，色素免疫測定法などを行なうことができる。
好ましい一例として、標識２次抗体を用いる免疫測定法
について説明する。
のような測定方法であってもよい。例えば、酵素免疫測
定法，放射免疫測定法，免疫比濁法，免疫比ろう法，ラ
テックス凝集法，血球凝集法，蛍光免疫測定法，免疫化
学発光法，色素免疫測定法などを行なうことができる。
好ましい一例として、標識２次抗体を用いる免疫測定法
について説明する。
固体表面、例えばポリスチレン孔を前記ポリペプチド
鎖で覆う。通常、この被覆操作はアルカリ域に緩衝作用
を有する。例えば炭酸ナトリウム緩衝液にポリペプチド
鎖を溶解し0.01ないし100μg/ml溶液として用い、低温
下にて１夜中行う。その後に、固体表面に物理吸着され
なかったポリペプチド鎖を緩衝液と共に吸引除去し、つ
づいて該ポリペプチド鎖と免疫化学的交叉性のない親水
性球状蛋白質、例えばミルクカゼインなどの0.01ないし
１％（重量／容積）溶液で、室温下約１時間ブロッキン
グを行う。これは、ポリペプチド鎖で被覆されなかった
固体表面あるいは固体表面に物理吸着したポリペプチド
鎖の分子表面上の易吸着性部位を覆うことにより、その
後に添加する被験対象物溶液または標識２次抗体溶液中
の蛋白成分が非特異的に吸着するのを防ぐためである。
鎖で覆う。通常、この被覆操作はアルカリ域に緩衝作用
を有する。例えば炭酸ナトリウム緩衝液にポリペプチド
鎖を溶解し0.01ないし100μg/ml溶液として用い、低温
下にて１夜中行う。その後に、固体表面に物理吸着され
なかったポリペプチド鎖を緩衝液と共に吸引除去し、つ
づいて該ポリペプチド鎖と免疫化学的交叉性のない親水
性球状蛋白質、例えばミルクカゼインなどの0.01ないし
１％（重量／容積）溶液で、室温下約１時間ブロッキン
グを行う。これは、ポリペプチド鎖で被覆されなかった
固体表面あるいは固体表面に物理吸着したポリペプチド
鎖の分子表面上の易吸着性部位を覆うことにより、その
後に添加する被験対象物溶液または標識２次抗体溶液中
の蛋白成分が非特異的に吸着するのを防ぐためである。
その後に、被覆あるいはブロッキングに使用されなか
ったポリペプチド鎖または蛋白成分を固体表面から除去
するため、非イオン系界面活性剤を含有する中性の洗浄
液で十分に洗浄する。以上のようにして抗原となるポリ
ペプチド鎖を担体に固定し、次いで抗体の検出又は定量
を行なう。
ったポリペプチド鎖または蛋白成分を固体表面から除去
するため、非イオン系界面活性剤を含有する中性の洗浄
液で十分に洗浄する。以上のようにして抗原となるポリ
ペプチド鎖を担体に固定し、次いで抗体の検出又は定量
を行なう。
非イオン系界面活性剤と免疫化学的交叉性のない親水
性球状蛋白質とを含有する生理的緩衝液で適宜に希釈し
た被験対象物、例えば患者血清を該ポリペプチド鎖で被
覆した固体表面と抗原抗体結合反応が完結するのに十分
な時間接触させる。
性球状蛋白質とを含有する生理的緩衝液で適宜に希釈し
た被験対象物、例えば患者血清を該ポリペプチド鎖で被
覆した固体表面と抗原抗体結合反応が完結するのに十分
な時間接触させる。
その後更に、非イオン系界面活性剤を含有する中性の
洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、過剰量の標識２次抗
体を含有する生理的溶液に該固体表面を抗原抗体結合反
応が完結するのに十分な時間接触させる。ここで標識物
質は、酵素，放射性同位元素，蛍光物質等、特に制限さ
れないが、酵素標識が特に好ましい。
洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、過剰量の標識２次抗
体を含有する生理的溶液に該固体表面を抗原抗体結合反
応が完結するのに十分な時間接触させる。ここで標識物
質は、酵素，放射性同位元素，蛍光物質等、特に制限さ
れないが、酵素標識が特に好ましい。
そしてひきつづき、非イオン系界面活性剤を含有する
中性の洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、該標識２次抗
体の存在または量を検出する。酵素標識の場合、酵素に
対する特異的基質溶液に該固体表面を酵素反応の生成物
が検出されるに十分な時間接触させる。この場合、酵素
反応により生成される産物の量は被験対象物中に含有さ
れる該ポリペプチド鎖上の抗原決定基に対する抗体量に
比例依存的であり、したがって間接的に被験対象物中の
該抗体を定量することができる。
中性の洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、該標識２次抗
体の存在または量を検出する。酵素標識の場合、酵素に
対する特異的基質溶液に該固体表面を酵素反応の生成物
が検出されるに十分な時間接触させる。この場合、酵素
反応により生成される産物の量は被験対象物中に含有さ
れる該ポリペプチド鎖上の抗原決定基に対する抗体量に
比例依存的であり、したがって間接的に被験対象物中の
該抗体を定量することができる。
以下に、RNA結合蛋白質のうち、SSB/La蛋白質の分離
精製法について、実施例により本発明を詳述する。
精製法について、実施例により本発明を詳述する。
例 緩衝液A:11中に、塩化ナトリウム8g,塩化カリウム0.2g,
燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g,燐酸１カリウム0.2gを
含有する燐酸系緩衝液。
燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g,燐酸１カリウム0.2gを
含有する燐酸系緩衝液。
緩衝液B:蛋白分解酵素阻害剤として、エチレングリコー
ル−OO′−ビス（２アミノメチル）−NNN′Ｎ′−４酢
酸塩（EDTA）10-3M、フッ化フェニルメチルスルフォニ
ル（PMSF）10-3M，ロイペプチン0.05％（重量／容
積）、アンチパイン0.05％（重量／容積）、キモスタチ
ン0.05％（重量／容積）、ペプスタンチンA0.05％（重
量／容積）をさらに含有する緩衝液Ａ。
ル−OO′−ビス（２アミノメチル）−NNN′Ｎ′−４酢
酸塩（EDTA）10-3M、フッ化フェニルメチルスルフォニ
ル（PMSF）10-3M，ロイペプチン0.05％（重量／容
積）、アンチパイン0.05％（重量／容積）、キモスタチ
ン0.05％（重量／容積）、ペプスタンチンA0.05％（重
量／容積）をさらに含有する緩衝液Ａ。
緩衝液C:トリス緩衝液10mM×HCl pH8.0。
緩衝液D:塩化マグネシウム0.1Mを含有する緩衝液Ｃ。
溶離液E1:塩化マグネシウム0.2Mを含有する緩衝液Ｃ。
溶離液E2:塩化マグネシウム0.3Mを含有する緩衝液Ｃ。
溶離液E3:塩化マグネシウム0.4Mを含有する緩衝液Ｃ。
溶離液E4:塩化マグネシウム0.5Mを含有する緩衝液Ｃ。
以下に示す操作は、すべて４℃で行った。
１）RNA結合蛋白質を含有する組織抽出液の取得 緩衝液B300mlを家兎胸腺アセトン粉末（ペルーフリー
ズ（Pel Freeze）社製）30gに添加し、該混合物を一昼
夜溶解させた。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30分間
遠心分離し、上澄液を抽出液Ａとした。この沈澱物から
２回目の抽出を行うため、沈殿物に緩衝液B50mlを添加
し４時間攪拌した。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30
分間遠心分離し、上澄液を抽出液Ｂとし、抽出液Ａと合
わせることにより抽出液Ｃとした。
ズ（Pel Freeze）社製）30gに添加し、該混合物を一昼
夜溶解させた。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30分間
遠心分離し、上澄液を抽出液Ａとした。この沈澱物から
２回目の抽出を行うため、沈殿物に緩衝液B50mlを添加
し４時間攪拌した。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30
分間遠心分離し、上澄液を抽出液Ｂとし、抽出液Ａと合
わせることにより抽出液Ｃとした。
２）ウリジル酸ポリマーをリガンドとする担体による分
画 １）で得られた抽出液Ｃを緩衝液Ｄに対して２昼夜透
析し、その後に該抽出液0.1容に対し、緩衝液D0.9容と
予め緩衝液Ｄで平衡化したウリジル酸ポリマーをリガン
ドとする担体（ポリウリジル酸アガロース，シグマ社
製）,1容を加え、15分間以上ゆっくりと転倒混和した。
引き続き遠沈により上清を除去、緩衝液D1容を加え該担
体を遠沈洗浄した。さらに引き続き、溶離液E11容を添
加して遠沈し上清に溶離してくるRNA結合蛋白質を回収
した。同様に溶離液E2,E3,E4を順に用いて同様の操作を
行い各溶離液でのRNA結合蛋白質を回収した。
画 １）で得られた抽出液Ｃを緩衝液Ｄに対して２昼夜透
析し、その後に該抽出液0.1容に対し、緩衝液D0.9容と
予め緩衝液Ｄで平衡化したウリジル酸ポリマーをリガン
ドとする担体（ポリウリジル酸アガロース，シグマ社
製）,1容を加え、15分間以上ゆっくりと転倒混和した。
引き続き遠沈により上清を除去、緩衝液D1容を加え該担
体を遠沈洗浄した。さらに引き続き、溶離液E11容を添
加して遠沈し上清に溶離してくるRNA結合蛋白質を回収
した。同様に溶離液E2,E3,E4を順に用いて同様の操作を
行い各溶離液でのRNA結合蛋白質を回収した。
３）各溶離液中のSSB/Laの蛋白質の酵素免疫測定法によ
る測定 96穴のELISA用マイクロプレートの孔に500分の１に希
釈したSSB/La蛋白溶液（各溶離液）200μｌを入れ、４
℃で１晩吸着させた。希釈には、0.1M炭酸ナトリウム緩
衝液、pH8.6を使用した。その翌日、0.2％ミルク溶液40
0μｌで室温下に１時間ブロックし、プレート上の未反
応部位および吸着蛋白表面の易吸着性部位を被覆した。
つづいて、１次抗体溶液（抗SSB/La血清を、0.1％ミル
クおよび0.1％トウィーン20を含むダルベッコリン酸緩
衝生理食塩液で1,000分の１に希釈）200μｌを添加し、
室温下で２時間反応させ、抗SSB/La抗体を被覆抗原に結
合させた。１次抗体反応後プレートを洗浄し（洗浄用緩
衝液として、0.1％トウィーン20を含むダルベッコリン
酸緩衝生理食塩液を用い、３分間５回洗浄）、２次抗体
溶液（フォスファターゼ標識抗ヒトIgG＋Ａ＋Ｍ抗体血
清（KPL社製）を0.1％ミルクおよび0.1％トウィーン20
を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩液で1000分の１に
希釈）20μｌを添加し、さらに室温下で２時間反応させ
２次抗体をプレート上の１次抗体（抗SSB/La抗体）と結
合させた。２次抗体反応にひきつづいて、上記同様にプ
レートを洗浄し、基質溶液（1mg/mlp−ニトロフェニル
リン酸、1Mジエタノールアミン緩衝液）200μｌを添加
し、１次抗体に補捉された標識２次抗体の酵素活性を分
光光度計により405nmの波長で吸光度を測定することに
より求めた。この酵素活性は、プレート上のSSB/La抗原
の量と比例関係にあるので、酵素活性の大きさをもって
試料中の抗原量を測定することができる。
る測定 96穴のELISA用マイクロプレートの孔に500分の１に希
釈したSSB/La蛋白溶液（各溶離液）200μｌを入れ、４
℃で１晩吸着させた。希釈には、0.1M炭酸ナトリウム緩
衝液、pH8.6を使用した。その翌日、0.2％ミルク溶液40
0μｌで室温下に１時間ブロックし、プレート上の未反
応部位および吸着蛋白表面の易吸着性部位を被覆した。
つづいて、１次抗体溶液（抗SSB/La血清を、0.1％ミル
クおよび0.1％トウィーン20を含むダルベッコリン酸緩
衝生理食塩液で1,000分の１に希釈）200μｌを添加し、
室温下で２時間反応させ、抗SSB/La抗体を被覆抗原に結
合させた。１次抗体反応後プレートを洗浄し（洗浄用緩
衝液として、0.1％トウィーン20を含むダルベッコリン
酸緩衝生理食塩液を用い、３分間５回洗浄）、２次抗体
溶液（フォスファターゼ標識抗ヒトIgG＋Ａ＋Ｍ抗体血
清（KPL社製）を0.1％ミルクおよび0.1％トウィーン20
を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩液で1000分の１に
希釈）20μｌを添加し、さらに室温下で２時間反応させ
２次抗体をプレート上の１次抗体（抗SSB/La抗体）と結
合させた。２次抗体反応にひきつづいて、上記同様にプ
レートを洗浄し、基質溶液（1mg/mlp−ニトロフェニル
リン酸、1Mジエタノールアミン緩衝液）200μｌを添加
し、１次抗体に補捉された標識２次抗体の酵素活性を分
光光度計により405nmの波長で吸光度を測定することに
より求めた。この酵素活性は、プレート上のSSB/La抗原
の量と比例関係にあるので、酵素活性の大きさをもって
試料中の抗原量を測定することができる。
得られた結果を第１図に示す。なお、Lowry法により
各溶離液の蛋白量を求めたが、蛋白量あたりの各溶離液
（MgCl20.2M,0.3Mおよび0.4Mのもの）のSSB/Laの抗原の
活性は格段に増大していた。
各溶離液の蛋白量を求めたが、蛋白量あたりの各溶離液
（MgCl20.2M,0.3Mおよび0.4Mのもの）のSSB/Laの抗原の
活性は格段に増大していた。
４）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分析 Laemmliらの方法に準じ、12.5％アクリルアミドゲル
（架橋度0.8）中で各溶離液を泳動試料として展開し
た。泳動条件は、泳動開始時40mA,濃縮泳動時4V/cm、分
離泳動時8V/cmとした。また、泳動試料は予め還元剤を
含まない試料用緩衝液（312.4mMトリス−塩酸,pH6.8,0.
1％ブロムフェノールブルー、10％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、20％グリセリン）を25体積％加え30分間室温処理
した。泳動後のゲルは0.05％クマシーブリリアンブルー
で１晩染色し、翌日、0.7％酢酸で脱色した。なお、分
子量マーカーとして、92.5Kダルトン,66.2Kダルトン,4
5.0Kダルトン,31.0Kダルトン,21.5Kダルトン及び14.4K
ダルトンのマーカーを有するBIO-RAD社製分子量マーカ
ーを使用した。
（架橋度0.8）中で各溶離液を泳動試料として展開し
た。泳動条件は、泳動開始時40mA,濃縮泳動時4V/cm、分
離泳動時8V/cmとした。また、泳動試料は予め還元剤を
含まない試料用緩衝液（312.4mMトリス−塩酸,pH6.8,0.
1％ブロムフェノールブルー、10％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、20％グリセリン）を25体積％加え30分間室温処理
した。泳動後のゲルは0.05％クマシーブリリアンブルー
で１晩染色し、翌日、0.7％酢酸で脱色した。なお、分
子量マーカーとして、92.5Kダルトン,66.2Kダルトン,4
5.0Kダルトン,31.0Kダルトン,21.5Kダルトン及び14.4K
ダルトンのマーカーを有するBIO-RAD社製分子量マーカ
ーを使用した。
その結果、塩化マグネシウム濃度が0.2M,0.3M及び0.4
Mのものは、全染色蛋白バンドに対する分子量約50Kダル
トンのバンドの濃さの比が増大していた。
Mのものは、全染色蛋白バンドに対する分子量約50Kダル
トンのバンドの濃さの比が増大していた。
従来、RNA結合蛋白質に対する抗体測定時に使用する
抗原としては細胞の抽出液がそのまま用いられてきた。
抗原としては細胞の抽出液がそのまま用いられてきた。
しかし、近年自己抗原になりうる細胞構成成分として
RNA結合蛋白質の分子的性状が明らかにされつつあり、
これらの機能と自己免疫疾患罹患者の血清中に出現す
る、これらに対する抗体の機能および病因との関連、ま
たは疾患経過中に見られる自己免疫現象と血清中の抗体
価変動との関連もしくは病日との関連についても諸説が
議論され、病因物質としての抗RNA結合蛋白質抗体の寄
与ならびに臨床像との関連の把握が重要となってきてい
る。
RNA結合蛋白質の分子的性状が明らかにされつつあり、
これらの機能と自己免疫疾患罹患者の血清中に出現す
る、これらに対する抗体の機能および病因との関連、ま
たは疾患経過中に見られる自己免疫現象と血清中の抗体
価変動との関連もしくは病日との関連についても諸説が
議論され、病因物質としての抗RNA結合蛋白質抗体の寄
与ならびに臨床像との関連の把握が重要となってきてい
る。
したがって、本発明のごとく、特異的に効率よくRNA
結合蛋白質を他の蛋白質や成分から分離する方法の確立
は、自己免疫疾患の診断や経過観察あるいは自己免疫現
象の予知のために行われる臨床検査に用いられる試薬構
成要素を調製する方法として有効なものである。そして
得られたRNA結合蛋白質を用いた本発明の抗RNA結合蛋白
質抗体の測定法は臨床上非常に有効なものとなる。
結合蛋白質を他の蛋白質や成分から分離する方法の確立
は、自己免疫疾患の診断や経過観察あるいは自己免疫現
象の予知のために行われる臨床検査に用いられる試薬構
成要素を調製する方法として有効なものである。そして
得られたRNA結合蛋白質を用いた本発明の抗RNA結合蛋白
質抗体の測定法は臨床上非常に有効なものとなる。
【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明の実施例におけるRNA結合蛋白質（SSB
/La蛋白質）のポリウリジル酸アガロースからの溶出を
示す図であり、縦軸には、各上清中のSSB/Laの抗原量を
酵素免疫測定法で定量した時の波長405nmにおける吸光
度を、横軸には用いた塩化マグネシウムの濃度を表す。
/La蛋白質）のポリウリジル酸アガロースからの溶出を
示す図であり、縦軸には、各上清中のSSB/Laの抗原量を
酵素免疫測定法で定量した時の波長405nmにおける吸光
度を、横軸には用いた塩化マグネシウムの濃度を表す。
Claims (4)
- 【請求項１】動物組織、培養細胞またはそれらの加工品
からRNA結合蛋白質を抽出し、次いで得られる抽出物を
塩を含有する溶液環境下に、ポリウリジル酸ポリマーを
リガンドとする担体を含むアフィニティゲルに接触さ
せ、その後に該アフィニティゲルに吸着したRNA結合蛋
白質を、溶液中の塩濃度を増加させることにより溶離さ
せる工程を含むことを特徴とする精製されたRNA結合蛋
白質の製造法。 - 【請求項２】動物組織、培養細胞またはそれらの加工品
からRNA結合蛋白質を抽出し、次いで得られる抽出物を
カオトロピックイオンを含有する溶液環境下に、ポリウ
リジル酸ポリマーをリガンドとする担体を含むアフィニ
ティゲルに接触させ、その後に該アフィニティゲルに吸
着したRNA結合蛋白質を、溶液中のカオトロピックイオ
ン濃度を増加させることにより溶離させる工程を含むこ
とを特徴とする精製されたRNA結合蛋白質の製造法。 - 【請求項３】精製するRNA結合蛋白質がSSB/La蛋白質で
ある請求項１または２記載の精製されたRNA結合蛋白質
の製造法。 - 【請求項４】精製するRNA結合蛋白質がSSA/Ro蛋白質で
ある請求項１または２記載の精製されたRNA結合蛋白質
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32584990A JPH0822875B2 (ja) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | 精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32584990A JPH0822875B2 (ja) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | 精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7143103A Division JP2595921B2 (ja) | 1995-06-09 | 1995-06-09 | 抗ｒｎａ結合蛋白質抗体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04198199A JPH04198199A (ja) | 1992-07-17 |
| JPH0822875B2 true JPH0822875B2 (ja) | 1996-03-06 |
Family
ID=18181308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32584990A Expired - Lifetime JPH0822875B2 (ja) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | 精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0822875B2 (ja) |
-
1990
- 1990-11-28 JP JP32584990A patent/JPH0822875B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04198199A (ja) | 1992-07-17 |
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