JPH085915B2 - 精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法 - Google Patents
精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法Info
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- JPH085915B2 JPH085915B2 JP32585090A JP32585090A JPH085915B2 JP H085915 B2 JPH085915 B2 JP H085915B2 JP 32585090 A JP32585090 A JP 32585090A JP 32585090 A JP32585090 A JP 32585090A JP H085915 B2 JPH085915 B2 JP H085915B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、自己免疫病，自己免疫現象の予知，診断，
経過観察の一環として行われる自己抗体検査の抗原試薬
として有効に利用されるRNA結合蛋白質の製造法に関す
る。
経過観察の一環として行われる自己抗体検査の抗原試薬
として有効に利用されるRNA結合蛋白質の製造法に関す
る。
低分子RNAに特異的に結合する蛋白質としては、細胞
核内の低分子RNAに結合し、RNAのスプライシングに寄与
する一群の蛋白質および細胞質内の低分子RNAに結合
し、RNA代謝調節を司る一群の蛋白質が知られている。
核内の低分子RNAに結合し、RNAのスプライシングに寄与
する一群の蛋白質および細胞質内の低分子RNAに結合
し、RNA代謝調節を司る一群の蛋白質が知られている。
全身性の自己免疫疾患では何らかの機構により該RNA
結合蛋白質に対する抗体を産生するようになり、それが
原因となって例えば炎症，潰瘍，皮疹，乾燥などの様々
な自己免疫現象に伴う病変が発現する。さらに、自己免
疫疾患患者血清中に出現する抗体に対し対応するRNA結
合蛋白質は、該疾患群間で多様であり、例えば全身性紅
斑性狼瘡（SLE），混合性結合組織病（MCTD）では核内R
NA結合蛋白質に対し、乾燥症候群（SjS）では細胞質内
のRNA結合蛋白質に対し高頻度で抗体を産生する。
結合蛋白質に対する抗体を産生するようになり、それが
原因となって例えば炎症，潰瘍，皮疹，乾燥などの様々
な自己免疫現象に伴う病変が発現する。さらに、自己免
疫疾患患者血清中に出現する抗体に対し対応するRNA結
合蛋白質は、該疾患群間で多様であり、例えば全身性紅
斑性狼瘡（SLE），混合性結合組織病（MCTD）では核内R
NA結合蛋白質に対し、乾燥症候群（SjS）では細胞質内
のRNA結合蛋白質に対し高頻度で抗体を産生する。
したがって、これら自己免疫疾患患者血清中に出現す
る各種の自己抗体を検出することの臨床上の本質的意義
は該疾患の診断，経過観察および自己免疫現象の予知に
ある。
る各種の自己抗体を検出することの臨床上の本質的意義
は該疾患の診断，経過観察および自己免疫現象の予知に
ある。
従来から該抗体群を検出するために使用される抗原と
しては、ヒトの培養細胞や哺乳動物細胞の抽出液あるい
は細胞そのものが粗抗原として用いられてきた。これ
は、該蛋白質の抗原性が種を越えて共通であるので自己
免疫疾患患者血清中に見いだされる自己成分に対する抗
体すなわち自己抗体を検出するための抗原としていかな
る哺乳動物由来のものも使用できるからである。また、
細胞核内RNA結合蛋白質に対する抗体群としては、抗リ
ボ核蛋白質抗体群と抗スミス抗体群が、細胞質内RNA結
合蛋白質に対する抗体群としては、抗SSA/Ro抗体群と抗
SSB/La抗体群が広く知られており、これら抗体群の検出
は、因習的に管理された基準血清と上述した粗抗原液と
の反応様式に対比させて、例えば２元免疫拡散法による
出現沈降線の融合現象あるいは蛍光抗体法による培養細
胞の染色像の判読により検出されているにすぎず、抗原
が精製されているものである必要がなかった。
しては、ヒトの培養細胞や哺乳動物細胞の抽出液あるい
は細胞そのものが粗抗原として用いられてきた。これ
は、該蛋白質の抗原性が種を越えて共通であるので自己
免疫疾患患者血清中に見いだされる自己成分に対する抗
体すなわち自己抗体を検出するための抗原としていかな
る哺乳動物由来のものも使用できるからである。また、
細胞核内RNA結合蛋白質に対する抗体群としては、抗リ
ボ核蛋白質抗体群と抗スミス抗体群が、細胞質内RNA結
合蛋白質に対する抗体群としては、抗SSA/Ro抗体群と抗
SSB/La抗体群が広く知られており、これら抗体群の検出
は、因習的に管理された基準血清と上述した粗抗原液と
の反応様式に対比させて、例えば２元免疫拡散法による
出現沈降線の融合現象あるいは蛍光抗体法による培養細
胞の染色像の判読により検出されているにすぎず、抗原
が精製されているものである必要がなかった。
近年、該抗体群に対する抗原の性質，機能が分子生物
学的あるいは蛋白化学的に明らかにされるに至り、精製
抗原を検出試薬として用いる鋭敏で定量的な臨床検査法
を確立する必要性が生じてきている。
学的あるいは蛋白化学的に明らかにされるに至り、精製
抗原を検出試薬として用いる鋭敏で定量的な臨床検査法
を確立する必要性が生じてきている。
RNA結合蛋白質の分離精製法については多くの科学文
献に記載されている（Clin.Exp.Immunol.,54,731-738,
（1983）、J.Biol.Chem.,258,2604-2613,（1983）な
ど）、大低の方法においては、動物組織あるいは培養細
胞から抽出した蛋白溶液を塩析した後、各クロマトグラ
フィに供する分離法が一般的である。
献に記載されている（Clin.Exp.Immunol.,54,731-738,
（1983）、J.Biol.Chem.,258,2604-2613,（1983）な
ど）、大低の方法においては、動物組織あるいは培養細
胞から抽出した蛋白溶液を塩析した後、各クロマトグラ
フィに供する分離法が一般的である。
塩析法は、塩濃度の増加に伴って蛋白質の溶解度が減
少する現象を利用した分画方法であるが、RNA結合蛋白
質の粗分画に塩析法を用いた場合、所定の塩濃度範囲で
効果的に該蛋白質を析出させることはできない。これは
RNA結合蛋白質の多種多様性に起因していると考えら
れ、なるべく多くのRNA結合蛋白質を析出させる目的で
は、選択すべき塩濃度範囲は極めて広範になり分離効果
は著しく悪くなる。さらに塩析法では、目的とするRNA
結合蛋白質以外にも多くの蛋白質が所定の塩濃度範色で
析出し、これらの蛋白質が相当量夾雑することは避ける
ことができない。そこで本発明者らは、RNAに結合可能
な蛋白質に特徴的なアミノ酸配列として亜鉛結合フィン
ガ配列に着目し、効率的なRNA結合蛋白質の分画法に関
し鋭意検討した結果、本発明を完成させた。
少する現象を利用した分画方法であるが、RNA結合蛋白
質の粗分画に塩析法を用いた場合、所定の塩濃度範囲で
効果的に該蛋白質を析出させることはできない。これは
RNA結合蛋白質の多種多様性に起因していると考えら
れ、なるべく多くのRNA結合蛋白質を析出させる目的で
は、選択すべき塩濃度範囲は極めて広範になり分離効果
は著しく悪くなる。さらに塩析法では、目的とするRNA
結合蛋白質以外にも多くの蛋白質が所定の塩濃度範色で
析出し、これらの蛋白質が相当量夾雑することは避ける
ことができない。そこで本発明者らは、RNAに結合可能
な蛋白質に特徴的なアミノ酸配列として亜鉛結合フィン
ガ配列に着目し、効率的なRNA結合蛋白質の分画法に関
し鋭意検討した結果、本発明を完成させた。
〔課題を解決するための手段〕 本発明は、動物組織，培養細胞またはそれらの加工品
からRNA結合蛋白質を抽出し、次いで得られる抽出物にZ
n++、Ni++、Cu++またはCo++を添加し、RNA結合蛋白質を
凝集析出させることにより他の可溶性蛋白質から分離
し、その後にキレート剤を添加してRNA結合蛋白質を再
溶解させる工程を含むことを特徴とする精製されたRNA
結合蛋白質の製造法に関する。
からRNA結合蛋白質を抽出し、次いで得られる抽出物にZ
n++、Ni++、Cu++またはCo++を添加し、RNA結合蛋白質を
凝集析出させることにより他の可溶性蛋白質から分離
し、その後にキレート剤を添加してRNA結合蛋白質を再
溶解させる工程を含むことを特徴とする精製されたRNA
結合蛋白質の製造法に関する。
動物組織、培養細胞またはそれらの加工品からRNA結
合蛋白質を含む希薄塩可溶性画分を抽出する過程におい
て、同時に可溶化される考えられうるすべての蛋白分解
酵素による侵襲から保護するため蛋白分解酵素に対する
阻害剤を添加した抽出用緩衝液で抽出されるのが好まし
い。さらにこの抽出操作に関し、なるべく多くのRNA結
合蛋白質を得るために被抽出対象物からの抽出は２回行
い、２回の抽出物を合体するのが好ましい。本抽出操作
に用いる抽出用緩衝液の塩濃度は、グロブリン分画の蛋
白質が溶解し易く、かつ核内ヒストンが溶解しない濃度
であれば特に制限はないが、生理的塩濃度で行うのが好
ましい。また、抽出液中のRNA結合蛋白質の検出は操作
が簡易であることから、目的とするRNA結合蛋白質を特
異的に認識する抗血清を用いた２元免疫拡散法により行
うのが好ましい。
合蛋白質を含む希薄塩可溶性画分を抽出する過程におい
て、同時に可溶化される考えられうるすべての蛋白分解
酵素による侵襲から保護するため蛋白分解酵素に対する
阻害剤を添加した抽出用緩衝液で抽出されるのが好まし
い。さらにこの抽出操作に関し、なるべく多くのRNA結
合蛋白質を得るために被抽出対象物からの抽出は２回行
い、２回の抽出物を合体するのが好ましい。本抽出操作
に用いる抽出用緩衝液の塩濃度は、グロブリン分画の蛋
白質が溶解し易く、かつ核内ヒストンが溶解しない濃度
であれば特に制限はないが、生理的塩濃度で行うのが好
ましい。また、抽出液中のRNA結合蛋白質の検出は操作
が簡易であることから、目的とするRNA結合蛋白質を特
異的に認識する抗血清を用いた２元免疫拡散法により行
うのが好ましい。
次いで、２価の金属イオンの添加により凝集析出させ
るが、これを容易にするために、得られた抽出液を低イ
オン強度の弱アルカリ緩衝液に対し十分に透析するのが
好ましい。
るが、これを容易にするために、得られた抽出液を低イ
オン強度の弱アルカリ緩衝液に対し十分に透析するのが
好ましい。
２価の金属イオンの添加方法としては、２価の金属イ
オンの懸濁液を上記抽出液と同容量加え、30分以上氷上
に静置するのが好ましい。この際に添加する２価の金属
イオンの溶液は、その飽和濃度以下の溶液であってもRN
A 結合蛋白質の凝集析出は生じるが、凝集析出を容易なら
しめるために、飽和濃度を超える懸濁液として使用し懸
濁粒子を凝集析出のキャリアとして用いるのが好まし
い。凝集析出したRNA結合蛋白質は遠沈，濾過などの分
離手段によって回収する。なお、回収した沈澱は飽和濃
度の２価の金属イオンの溶液で洗浄するのが好ましい。
オンの懸濁液を上記抽出液と同容量加え、30分以上氷上
に静置するのが好ましい。この際に添加する２価の金属
イオンの溶液は、その飽和濃度以下の溶液であってもRN
A 結合蛋白質の凝集析出は生じるが、凝集析出を容易なら
しめるために、飽和濃度を超える懸濁液として使用し懸
濁粒子を凝集析出のキャリアとして用いるのが好まし
い。凝集析出したRNA結合蛋白質は遠沈，濾過などの分
離手段によって回収する。なお、回収した沈澱は飽和濃
度の２価の金属イオンの溶液で洗浄するのが好ましい。
ここで、２価の金属イオンとしては、イオン半径が0.
71〜0.75ÅのZn++,Ni++,Cu++およびCo++が効果が高く好
ましく、中でもZn++が最も好ましい。
71〜0.75ÅのZn++,Ni++,Cu++およびCo++が効果が高く好
ましく、中でもZn++が最も好ましい。
具体的には添加される２価の金属イオンを含む塩とし
ては、塩化亜鉛，塩化ニッケル，塩化第２銅，塩化コバ
ルト等の塩化物が好ましいが、これに制限されるもので
はない。
ては、塩化亜鉛，塩化ニッケル，塩化第２銅，塩化コバ
ルト等の塩化物が好ましいが、これに制限されるもので
はない。
その後引き続き、分離した該沈澱にキレート剤を添加
して沈殿を再溶解させる。このとき、キレート剤は緩衝
液に溶解し、キレート剤溶液として用いるのが好まし
い。該溶液は沈澱回収前と同体積添加し、再溶解せしめ
るのが好ましい。この場合、添加するキレート剤溶液の
濃度を段階的に増加させることにより、再溶解するRNA
結合蛋白質の種類を限定することができる。例えば、終
濃度30mM以下のエチレンジアミン４酢酸塩（EDTA）溶液
でSSB/La蛋白質を、終濃度30mM以上のエチレンジアミン
４酢酸塩（EDTA）溶液でSSA/Ro蛋白質を効率よく再溶解
することができる。
して沈殿を再溶解させる。このとき、キレート剤は緩衝
液に溶解し、キレート剤溶液として用いるのが好まし
い。該溶液は沈澱回収前と同体積添加し、再溶解せしめ
るのが好ましい。この場合、添加するキレート剤溶液の
濃度を段階的に増加させることにより、再溶解するRNA
結合蛋白質の種類を限定することができる。例えば、終
濃度30mM以下のエチレンジアミン４酢酸塩（EDTA）溶液
でSSB/La蛋白質を、終濃度30mM以上のエチレンジアミン
４酢酸塩（EDTA）溶液でSSA/Ro蛋白質を効率よく再溶解
することができる。
ここでキレート剤としては、エチレンジアミン４酢酸
塩（EDTA），エチレングリコール−OO′−ビス（２アミ
ノメチル）−NNN′Ｎ′−４酢酸塩（EGTA）,o−フェナ
ンスロリン,8−オキシキノリンなどが使用できるが、ED
TAの使用が最も好ましい。
塩（EDTA），エチレングリコール−OO′−ビス（２アミ
ノメチル）−NNN′Ｎ′−４酢酸塩（EGTA）,o−フェナ
ンスロリン,8−オキシキノリンなどが使用できるが、ED
TAの使用が最も好ましい。
以上のような工程により、全蛋白量に対する分離精製
の対象であるRNA結合蛋白質の比を飛躍的に増大させる
ことができる。すなわち、他の夾雑蛋白の大部分を除去
することができる。
の対象であるRNA結合蛋白質の比を飛躍的に増大させる
ことができる。すなわち、他の夾雑蛋白の大部分を除去
することができる。
ここで、この方法により精製倍率を飛躍的に増大でき
る具体的なRNA結合蛋白質としては、YRNA複合体蛋白質
を構成するSSB/La蛋白質,SSA/Ro蛋白質が挙げられる。
る具体的なRNA結合蛋白質としては、YRNA複合体蛋白質
を構成するSSB/La蛋白質,SSA/Ro蛋白質が挙げられる。
以上の工程により得られるRNA結合蛋白質は、例えば
オクタロニ法などの一部の免疫測定法に使用する抗原と
してそのまま用いることができる。さらに分子ふるいフ
ロマトグラフィ，イオン交換クロマトグラフィ，吸着ク
ロマトグラフィ、ある種の群特異的クロマトグラフィな
どの操作を少なくとも一段階組み合わせることによりさ
らに高度に精製されたRNA結合蛋白質標品を得ることが
でき、該標品は免疫化学反応を測定原理とするいかなる
自己抗体測定用診断剤に使用する抗原としても用いるこ
とができる。
オクタロニ法などの一部の免疫測定法に使用する抗原と
してそのまま用いることができる。さらに分子ふるいフ
ロマトグラフィ，イオン交換クロマトグラフィ，吸着ク
ロマトグラフィ、ある種の群特異的クロマトグラフィな
どの操作を少なくとも一段階組み合わせることによりさ
らに高度に精製されたRNA結合蛋白質標品を得ることが
でき、該標品は免疫化学反応を測定原理とするいかなる
自己抗体測定用診断剤に使用する抗原としても用いるこ
とができる。
次に得られるRNA結合蛋白質を抗原として使用し、被
験対象物中に存在する抗体を検出又は定量する抗RNA結
合蛋白質抗体の測定方法について説明する。
験対象物中に存在する抗体を検出又は定量する抗RNA結
合蛋白質抗体の測定方法について説明する。
本発明の測定法は、前記抗原を使用しさえすれば、ど
のような測定方法であってもよい。例えば、酵素免疫測
定法，放射免疫測定法，免疫比濁法，免疫比ろう法，ラ
テックス凝集法，血球凝集法，蛍光免疫測定法，免疫化
学発光法，色素免疫測定法などを行なうことができる。
好ましい一例として、標識２次抗体を用いる免疫測定法
について説明する。
のような測定方法であってもよい。例えば、酵素免疫測
定法，放射免疫測定法，免疫比濁法，免疫比ろう法，ラ
テックス凝集法，血球凝集法，蛍光免疫測定法，免疫化
学発光法，色素免疫測定法などを行なうことができる。
好ましい一例として、標識２次抗体を用いる免疫測定法
について説明する。
固体表面、例えばポリスチレン孔を前記ポリペプチド
鎖で覆う。通常、この被覆操作はアルカリ域に緩衝作用
を有する。例えば炭酸ナトリウム緩衝液にポリペプチド
鎖を溶解し0.01ないし100μg/ml溶液として用い、低温
下にて１夜中行う。その後に、固体表面に物理吸着され
なかったポリペプチド鎖を緩衝液と共に吸引除去し、つ
づいて該ポリペプチド鎖と免疫化学的交叉性のない親水
性球状蛋白質、例えばミルクカゼインなどの0.01ないし
１％（重量／容積）溶液で、室温下約１時間ブロッキン
グを行う。これは、ポリペプチド鎖で被覆されなかった
固体表面あるいは固体表面に物理吸着したポリペプチド
鎖の分子表面上の易吸着性部位を覆うことにより、その
後に添加する被験対象物溶液または標識２次抗体溶液中
の蛋白成分が非特異的に吸着するのを防ぐためである。
鎖で覆う。通常、この被覆操作はアルカリ域に緩衝作用
を有する。例えば炭酸ナトリウム緩衝液にポリペプチド
鎖を溶解し0.01ないし100μg/ml溶液として用い、低温
下にて１夜中行う。その後に、固体表面に物理吸着され
なかったポリペプチド鎖を緩衝液と共に吸引除去し、つ
づいて該ポリペプチド鎖と免疫化学的交叉性のない親水
性球状蛋白質、例えばミルクカゼインなどの0.01ないし
１％（重量／容積）溶液で、室温下約１時間ブロッキン
グを行う。これは、ポリペプチド鎖で被覆されなかった
固体表面あるいは固体表面に物理吸着したポリペプチド
鎖の分子表面上の易吸着性部位を覆うことにより、その
後に添加する被験対象物溶液または標識２次抗体溶液中
の蛋白成分が非特異的に吸着するのを防ぐためである。
その後に、被覆あるいはブロッキングに使用されなか
ったポリペプチド鎖または蛋白成分を固体表面から除去
するため、非イオン系界面活性剤を含有する中性の洗浄
液で十分に洗浄する。以上のようにして抗原となるポリ
ペプチド鎖を担体に固定し、次いで抗体の検出又は定量
を行なう。
ったポリペプチド鎖または蛋白成分を固体表面から除去
するため、非イオン系界面活性剤を含有する中性の洗浄
液で十分に洗浄する。以上のようにして抗原となるポリ
ペプチド鎖を担体に固定し、次いで抗体の検出又は定量
を行なう。
非イオン系界面活性剤と免疫化学的交叉性のない親水
性球状蛋白質とを含有する生理的緩衝液で適宜に希釈し
た被験対象物、例えば患者血清を該ポリペプチド鎖で被
覆した固体表面と抗原抗体結合反応が完結するのに十分
な時間接触させる。
性球状蛋白質とを含有する生理的緩衝液で適宜に希釈し
た被験対象物、例えば患者血清を該ポリペプチド鎖で被
覆した固体表面と抗原抗体結合反応が完結するのに十分
な時間接触させる。
その後更に、非イオン系界面活性剤を含有する中性の
洗浄液で固定表面を十分に洗浄し、過剰量の標識２次抗
体を含有する生理的溶液に該固体表面を抗原抗体結合反
応が完結するのに十分な時間を接触させる。ここで標識
物質は、酵素，放射性同位元素，蛍光物質等、特に制限
されないが、酵素標識が特に好ましい。
洗浄液で固定表面を十分に洗浄し、過剰量の標識２次抗
体を含有する生理的溶液に該固体表面を抗原抗体結合反
応が完結するのに十分な時間を接触させる。ここで標識
物質は、酵素，放射性同位元素，蛍光物質等、特に制限
されないが、酵素標識が特に好ましい。
そしてひきつづき、非イオン系界面活性剤を含有する
中性の洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、該標識２次抗
体の存在または量を検出する。酵素標識の場合、酵素に
対する特異的基質溶液に該固体表面を酵素反応の生成物
が検出されるに十分な時間接触させる。この場合、酵素
反応により生成される産物の量は被験対象物中に含有さ
れる該ポリペプチド鎖上の抗原決定基に対する抗体量に
比例依存的であり、したがって間接的に被験対象物中の
該抗体を定量することができる。
中性の洗浄液で固体表面を十分に洗浄し、該標識２次抗
体の存在または量を検出する。酵素標識の場合、酵素に
対する特異的基質溶液に該固体表面を酵素反応の生成物
が検出されるに十分な時間接触させる。この場合、酵素
反応により生成される産物の量は被験対象物中に含有さ
れる該ポリペプチド鎖上の抗原決定基に対する抗体量に
比例依存的であり、したがって間接的に被験対象物中の
該抗体を定量することができる。
以下に、SSB/La蛋白質の分離精製法について、実施例
により本発明を詳述する。
により本発明を詳述する。
例 緩衝液A:11中に、塩化ナトリウム8g,塩化カリウム0.2g,
燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g,燐酸１カリウム0.2gを
含有する燐酸系緩衝液。
燐酸２ナトリウム・12水塩2.7g,燐酸１カリウム0.2gを
含有する燐酸系緩衝液。
緩衝液B:蛋白分解酵素阻害剤として、エチレングリコー
ル−OO′−ビス（２アミノメチル）−NNN′Ｎ′−４酢
酸塩（EDTA）10-3M、フッ化フェニルメチルスルフォニ
ル（PMSF）10-3M，ロイペプチン0.05％（重量／容
積）、アンチパイン0.05％（重量／容積）、キモスタチ
ン0.05％（重量／容積）、ペプスタンチンA0.05％（重
量／容積）をさらに含有する緩衝液Ａ。
ル−OO′−ビス（２アミノメチル）−NNN′Ｎ′−４酢
酸塩（EDTA）10-3M、フッ化フェニルメチルスルフォニ
ル（PMSF）10-3M，ロイペプチン0.05％（重量／容
積）、アンチパイン0.05％（重量／容積）、キモスタチ
ン0.05％（重量／容積）、ペプスタンチンA0.05％（重
量／容積）をさらに含有する緩衝液Ａ。
緩衝液C:トリス緩衝液10mM×HCl pH8.0。
懸濁液D:塩化亜鉛0.2Mを懸濁させた緩衝液Ｃ。
キレート液E1:エチレンジアミン４酢酸塩（EDTA）10mM
を含有する緩衝液Ｃ。
を含有する緩衝液Ｃ。
キレート液E2:エチレンジアミン４酢酸塩（EDTA）20mM
を含有する緩衝液Ｃ。
を含有する緩衝液Ｃ。
キレート液E3:エチレンジアミン４酢酸塩（EDTA）30mM
を含有する緩衝液Ｃ。
を含有する緩衝液Ｃ。
キレート液E4:エチレンジアミン４酢酸塩（EDTA）40mM
を含有する緩衝液Ｃ。
を含有する緩衝液Ｃ。
キレート液E5:エチレンジアミン４酢酸塩（EDTA）50mM
を含有する緩衝液Ｃ。
を含有する緩衝液Ｃ。
キレート液E6:エチレンジアミン４酢酸塩（EDTA）100mM
を含有する緩衝液Ｃ。
を含有する緩衝液Ｃ。
以下に示す操作は、すべて４℃で行った。
１）使用されるRNA結合蛋白質を含有する組織抽出液の
取得 緩衝液B300mlを家兎胸腺アセトン粉末（ペルーフリー
ズ（Pel-Freeze）社製）30gに添加し、該混合物を一昼
夜溶解させた。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30分間
遠心分離し、上澄液を抽出液Ａとした。この沈澱物から
２回目の抽出を行うため、沈澱物に緩衝液B 50mlを添加
し４時間攪拌した。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30
分間遠心分離し、上澄液を抽出液Ｂとし、抽出液Ａと合
わせることにより抽出液Ｃとした。
取得 緩衝液B300mlを家兎胸腺アセトン粉末（ペルーフリー
ズ（Pel-Freeze）社製）30gに添加し、該混合物を一昼
夜溶解させた。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30分間
遠心分離し、上澄液を抽出液Ａとした。この沈澱物から
２回目の抽出を行うため、沈澱物に緩衝液B 50mlを添加
し４時間攪拌した。その後、該懸濁液を10,000×ｇで30
分間遠心分離し、上澄液を抽出液Ｂとし、抽出液Ａと合
わせることにより抽出液Ｃとした。
２）塩化亜鉛懸濁液によるRNA結合蛋白質の析出沈殿の
回収 抽出液Ｃを緩衝液Ｃに対し十分な時間透析した後、同
一体積の懸濁液Ｄを添加し30分以上放置した。その後、
凝集析出した蛋白質を10,000×ｇで20分間遠心分離し
た。
回収 抽出液Ｃを緩衝液Ｃに対し十分な時間透析した後、同
一体積の懸濁液Ｄを添加し30分以上放置した。その後、
凝集析出した蛋白質を10,000×ｇで20分間遠心分離し
た。
３）キレート剤溶液によるRNA結合蛋白質の再溶解 ２）で得られた沈澱からキレート液E1,E2,E3,E4,E5,E
6を順次150mlずつ添加し、各々の段階で再溶解する蛋白
質量を測定した。得られた蛋白質をRNA結合蛋白質分画
標品とした。
6を順次150mlずつ添加し、各々の段階で再溶解する蛋白
質量を測定した。得られた蛋白質をRNA結合蛋白質分画
標品とした。
４）各溶離液中のSSB/Laの蛋白質酵素免疫測定法による
測定 96穴のELISA用マイクロプレートの孔に1000分の１に
希釈したSSB/La蛋白溶液（各分画標品）200μｌを入
れ、４℃で１晩吸着させた。希釈には、0.1M炭酸ナトリ
ウム緩衝液、pH8.6を使用した。その翌日、0.2％ミルク
溶液400μｌで室温下に１時間ブロックし、プレート上
の未反応部位および吸着蛋白表面の易吸着性部位を被覆
した。つづいて、１次抗体溶液（抗体SSB/La血清を、0.
1％ミルクおよび0.1％トウィーン20を含むダルベッコリ
ン酸緩衝生理食塩液で1,000分の１に希釈）20μｌを添
加し、室温下で２時間反応させ、抗SSB/La抗体を被覆抗
原に結合させた。１次抗体反応後プレートを洗浄し（洗
浄用緩衝液として、0.1％、トウィーン20を含むダルベ
ッコリン酸緩衝生理食塩液を用い、３分間５回洗浄）、
２次抗体溶液（フォスファターゼ標識抗ヒトIgG＋Ａ＋
Ｍ抗体血清（KPL社製）を0.1％ミルクおよび0.1％トウ
ィーン20を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩液で1,00
0分の１に希釈）20μｌを添加し、さらに室温下で２時
間反応させ２次抗体をプレート上の１次抗体（抗SSB/La
抗体）と結合させた。２次抗体反応にひきつづいて、上
記同様にプレートを洗浄し、基質溶液（1mg/mlp−ニト
ロフェニルリン酸、1Mジエタノールアミン緩衝液）200
μｌを添加し、１次抗体に捕捉された標識２次抗体の酵
素活性を分光光度計により405nmの波長で吸光度を測定
することにより求めた。この酵素活性は、プレート上の
SSB/La抗原の量と比例関係にあるので、酵素活性の大き
さをもって試料中の抗原量を測定することができる。
測定 96穴のELISA用マイクロプレートの孔に1000分の１に
希釈したSSB/La蛋白溶液（各分画標品）200μｌを入
れ、４℃で１晩吸着させた。希釈には、0.1M炭酸ナトリ
ウム緩衝液、pH8.6を使用した。その翌日、0.2％ミルク
溶液400μｌで室温下に１時間ブロックし、プレート上
の未反応部位および吸着蛋白表面の易吸着性部位を被覆
した。つづいて、１次抗体溶液（抗体SSB/La血清を、0.
1％ミルクおよび0.1％トウィーン20を含むダルベッコリ
ン酸緩衝生理食塩液で1,000分の１に希釈）20μｌを添
加し、室温下で２時間反応させ、抗SSB/La抗体を被覆抗
原に結合させた。１次抗体反応後プレートを洗浄し（洗
浄用緩衝液として、0.1％、トウィーン20を含むダルベ
ッコリン酸緩衝生理食塩液を用い、３分間５回洗浄）、
２次抗体溶液（フォスファターゼ標識抗ヒトIgG＋Ａ＋
Ｍ抗体血清（KPL社製）を0.1％ミルクおよび0.1％トウ
ィーン20を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩液で1,00
0分の１に希釈）20μｌを添加し、さらに室温下で２時
間反応させ２次抗体をプレート上の１次抗体（抗SSB/La
抗体）と結合させた。２次抗体反応にひきつづいて、上
記同様にプレートを洗浄し、基質溶液（1mg/mlp−ニト
ロフェニルリン酸、1Mジエタノールアミン緩衝液）200
μｌを添加し、１次抗体に捕捉された標識２次抗体の酵
素活性を分光光度計により405nmの波長で吸光度を測定
することにより求めた。この酵素活性は、プレート上の
SSB/La抗原の量と比例関係にあるので、酵素活性の大き
さをもって試料中の抗原量を測定することができる。
得られた結果を第１図に示す。なお、Lowry法により
各分画標品の蛋白量を求めたが、EDTAが20mM,30mMのも
のは、蛋白量あたりのSSB/La抗原の活性が格段に増大し
ていた。
各分画標品の蛋白量を求めたが、EDTAが20mM,30mMのも
のは、蛋白量あたりのSSB/La抗原の活性が格段に増大し
ていた。
５）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分析 Laemmliらの方法に準じ、12.5％アクリルアミドゲル
（架橋度0.8）中で各分画標品を泳動試料として展開し
た。泳動条件は、泳動開始時40mA,濃縮泳動時4V/cm、分
離泳動時8V/cmとした。また、泳動試料は予め還元剤を
含まない試料用緩衝液（312.5mMトリス−塩酸,pH6.8、
0.1％ブロムフェノールブルー、10％ドデシル硫酸ナト
リウム、20％グリセリン）を25体積％加え30分間室温処
理した。泳動後のゲルは0.05％CBBで１晩染色し、翌
日、0.7％酢酸で脱色した。
（架橋度0.8）中で各分画標品を泳動試料として展開し
た。泳動条件は、泳動開始時40mA,濃縮泳動時4V/cm、分
離泳動時8V/cmとした。また、泳動試料は予め還元剤を
含まない試料用緩衝液（312.5mMトリス−塩酸,pH6.8、
0.1％ブロムフェノールブルー、10％ドデシル硫酸ナト
リウム、20％グリセリン）を25体積％加え30分間室温処
理した。泳動後のゲルは0.05％CBBで１晩染色し、翌
日、0.7％酢酸で脱色した。
なお、分子量マーカーとして、92.5Kダルトン,66.2K
ダルトン,45.0Kダルトン,31.0Kダルトン,21Kダルトン及
び14.4Kダルトンのマーカーを有するBIO-RAD社製分子量
マーカーを使用した。
ダルトン,45.0Kダルトン,31.0Kダルトン,21Kダルトン及
び14.4Kダルトンのマーカーを有するBIO-RAD社製分子量
マーカーを使用した。
その結果、EDTA濃度が20mM及び30mMのものは、全染色
蛋白バンドに対する分子量約50Kダルトンのバンドの濃
さの比が増大していた。
蛋白バンドに対する分子量約50Kダルトンのバンドの濃
さの比が増大していた。
従来、RNA結合蛋白質に対する抗体測定時に使用する
抗原としては細胞の抽出液がそのまま用いられてきた。
抗原としては細胞の抽出液がそのまま用いられてきた。
しかし、近年自己抗原になりうる細胞構成成分として
RNA結合蛋白質の分子的性状が明らかにされつつあり、
これらの機能と自己免疫疾患罹患者の血清中に出現す
る、これらに対する抗体の機能および病因との関連、ま
たは該疾患経過中に見られる自己免疫現象と血清中の抗
体価変動との関連もしくは病日との関連についても諸説
が議論され、病因物質としての抗RNA結合蛋白質抗体の
寄与ならびに臨床像との関連の把握が重要となってきて
いる。
RNA結合蛋白質の分子的性状が明らかにされつつあり、
これらの機能と自己免疫疾患罹患者の血清中に出現す
る、これらに対する抗体の機能および病因との関連、ま
たは該疾患経過中に見られる自己免疫現象と血清中の抗
体価変動との関連もしくは病日との関連についても諸説
が議論され、病因物質としての抗RNA結合蛋白質抗体の
寄与ならびに臨床像との関連の把握が重要となってきて
いる。
したがって、本発明のごとく、特異的に効率よくRNA
結合蛋白質を他の蛋白質や成分から分画する方法の確立
は、自己免疫疾患の診断や経過観察、あるいは自己免疫
現象の予知のために行われる臨床検査に、用いられる試
薬構成要素として純度、特異性の高い抗原を調整するた
めの精製を提供するものとなる。そして、得られたRNA
結合蛋白質を用いた本発明の抗RNA結合蛋白質抗体の測
定法は、臨床上非常に有効なものとなる。
結合蛋白質を他の蛋白質や成分から分画する方法の確立
は、自己免疫疾患の診断や経過観察、あるいは自己免疫
現象の予知のために行われる臨床検査に、用いられる試
薬構成要素として純度、特異性の高い抗原を調整するた
めの精製を提供するものとなる。そして、得られたRNA
結合蛋白質を用いた本発明の抗RNA結合蛋白質抗体の測
定法は、臨床上非常に有効なものとなる。
第１図は、本発明の実施例におけるRNA結合蛋白質（SSB
/La蛋白質）の亜鉛沈澱からのキレート剤溶液による再
溶解量を示す図であり、縦軸には溶解上清中のSSB/Laの
抗原量を酵素免疫測定法で定量した時の波長405nmにお
ける吸光度を、横軸には用いたキレート剤溶液のEDTA濃
度を表す。
/La蛋白質）の亜鉛沈澱からのキレート剤溶液による再
溶解量を示す図であり、縦軸には溶解上清中のSSB/Laの
抗原量を酵素免疫測定法で定量した時の波長405nmにお
ける吸光度を、横軸には用いたキレート剤溶液のEDTA濃
度を表す。
Claims (3)
- 【請求項１】動物組織、培養細胞またはそれらの加工品
からRNA結合蛋白質を抽出し、次いで得られる抽出物にZ
n++、Ni++、Cu++またはCo++を添加し、RNA結合蛋白質を
凝集析出させることにより他の可溶性蛋白質から分離
し、その後にキレート剤を添加してRNA結合蛋白質を再
溶解させる工程を含むことを特徴とする精製されたRNA
結合蛋白質の製造法。 - 【請求項２】精製するRNA結合蛋白質がSSB/La蛋白質で
ある請求項１記載の精製されたRNA結合蛋白質の製造
法。 - 【請求項３】精製するRNA結合蛋白質がSSA/Ro蛋白質で
ある請求項１記載の精製されたRNA結合蛋白質の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32585090A JPH085915B2 (ja) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | 精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32585090A JPH085915B2 (ja) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | 精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7143104A Division JP2595922B2 (ja) | 1995-06-09 | 1995-06-09 | 抗ｒｎａ結合蛋白質抗体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04198200A JPH04198200A (ja) | 1992-07-17 |
| JPH085915B2 true JPH085915B2 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=18181318
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32585090A Expired - Lifetime JPH085915B2 (ja) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | 精製されたｒｎａ結合蛋白質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH085915B2 (ja) |
-
1990
- 1990-11-28 JP JP32585090A patent/JPH085915B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04198200A (ja) | 1992-07-17 |
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