JPH0834742B2

JPH0834742B2 - 百日せき内毒素の除去法，百日せきトキソイドおよびその製造法

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Publication number: JPH0834742B2
Application number: JP63124066A
Authority: JP
Inventors: 勲藤田; 秀夫渡辺; 正敏宮本
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-20
Publication date: 1996-03-29
Anticipated expiration: 2011-03-29
Also published as: KR880013573A; UA12647A1; NO178423C; CN88103075A; DK273588A; HUT47602A; GR3007238T3; KR970002614B1; US5101019A; ATE84971T1; DE3877818D1; EP0291968A1; CN1019979C; HU200194B; NO882208L; RU2089216C1; EP0291968B1; DE3877818T2; NO882208D0; JPS6452726A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、百日せき内毒素の除去法，百日せきトキソ
イドおよびその製造法に関する。

従来の技術百日せきは、ボルデテラ・パターシス（Bordetella p
ertussis）菌の感染によって起こる伝染性疾患で、特に
乳児あるいは小児では重症経過をとる。

本症予防のためには従来からワクチンが用いられてき
た。百日せき菌の全菌体を材料としたワクチンで接種後
の発熱などの副作用が強く、これを改善するために百日
せき菌からフィラメンタス血球凝集素（FHA），百日せ
き毒素（PT），フィンブリエ（Fimbriae）などの感染防
御有効成分（以下、有効成分と略称することがある）を
取り出し、発熱などの副作用の主因である内毒素（ET）
をかなり除去した改良百日せきワクチン（Acellular pe
rtussis vaccine）（ACPワクチン）が開発され、実用化
されるに至っている。

ACPワクチンの製造では、感染防御有効成分から内毒
素（ET）を除去する工程が最も重要であり、一般的には
ショ糖密度勾配遠心法が用いられている（特開昭57−50
925号公報）。

また、発熱性物質を除去する方法としてリン酸カルシ
ウムゲルを用いる方法が知られており（特公昭34−2149
号公報）、さらに、リン酸カルシウムゲルを安定化した
ヒドロキシアパタイトゲルがフィラメンタス血球凝集素
（FHA）と百日せき毒素（PT）との分離に有効であり、
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトで分離後、アフィ
ニティークロマト，ショ糖密度勾配遠心で精製すること
により内毒素の存在しない（内毒素がかなり除去され
た）フィラメンタス血球凝集素と百日せき毒素とを分離
・精製できることも知られている（日本細菌学雑誌38
（１）423頁1983年）。

発明が解決しようとする課題ショ糖密度勾配遠心法単独で約99.995％の内毒素（E
T）を除去できるが、粗有効成分含有液は大量の内毒素
（ET）を含有しているので有効成分と内毒素（ET）との
分離が完全に行ない難く、そのため有効成分の収率が低
くなり、また生産容量が小さく、費用や時間がかさむの
で工業的に満足できる方法であるとは言えなかった。

また、リン酸カルシウムゲル処理単独では百日せき菌
の内毒素の除去率は約90〜99.9％とかなり低く、実用に
供しがたいものである。

一方、ヒドロキシアパタイトカラムクロマト，アフィ
ニティークロマト，ショ糖密度勾配遠心法を組み合わせ
ることにより、内毒素がかなり除去されたフィラメンタ
ス血球凝集素（FHA）と百日せき毒素（PT）とを実験室
レベルで分離・精製することは可能であるが、工業的に
大量に製造できるものではない。また、有効成分および
内毒素（ET）の含有液から内毒素（ET）を除去しようと
する本発明の目的とは異なるものである。

課題を解決するための手段本発明者らは、かかる技術的背景のもとに効率的な内
毒素（ET）の除去法について検討した結果、ショ糖密度
勾配遠心処理に先立ち、リン酸カルシウムゲル処理を行
なうことによって、有効成分と内毒素（ET）との分離が
極めて明瞭になり、しかもショ糖密度勾配遠心法単独の
場合と比較すると、生産容量，内毒素（ET）の除去率が
ともに向上することを見い出し、これらの知見に基づい
てさらに研究を進めた結果本発明を完成した。

すなわち本発明は（１）百日せきＩ相菌の感染防御有
効成分および内毒素含有液からゾーナル遠心法により内
毒素を除去する方法において、ゾーナル遠心処理に先立
ち上記含有液に過剰のリン酸イオン共存下カルシウムイ
オンを供給し、生じる沈殿を除去することを特徴とする
百日せき内毒素の除去法、（２）上記除去法により得ら
れる感染防御有効成分含有液をトキソイド化（減毒化）
することを特徴とする百日せきトキソイドの製造法およ
び（３）上記製造法により製造される百日せきトキソイ
ドである。

本発明における百日せきＩ相菌の感染防御有効成分お
よび内毒素の含有液としては、例えば百日せきＩ相菌を
培養して得られる培養物の上清液，その濃縮液などが挙
げられるが、濃縮液を用いるのが好ましい。百日せきＩ
相菌の培養は常法により行なうことができ、例えば液体
培地（コーエンウィラー培地あるいはスティナーショル
ト培地など）を用い、約35〜37℃で約５〜７日間培養す
るのがよい。かくして得られる培養物の上清液を、例え
ばろ過もしくは遠心分離により集液する。得られた上清
液をそのまま、または濃縮して次の内毒素除去工程に付
すことができる。この濃縮は自体公知の塩析処理を適用
して行なうことができ、例えば培養上清液10に硫酸ア
ンモニウムを２〜5kg加え、混合し適当な方法、例えば
遠心分離またはろ過などによって沈殿を集める。この沈
殿に1M塩化ナトリウム加0.05Mリン酸塩緩衝液を適当量
加え溶解する。そして、遠心沈降などの方法によって上
清を集めるのがよい。

本発明における内毒除去工程は、百日せきＩ相菌の感
染防御有効成分および内毒素の含有液に過剰のリン酸イ
オン共存下カルシウムイオンを供給し、生じる沈殿を除
去した後ゾーナル遠心処理を行なうことからなる。

上記含有液にリン酸イオンが存在しない場合には、例
えば1M塩化ナトリウム加0.05Mリン酸塩緩衝液などの酸
緩衝液を添加することにより、リン酸イオンを共存させ
た後カルシウムイオンを供給する。

供給するカルシウムイオンとしては、酢酸カルシウ
ム，塩化カルシムウ，硝酸カルシウムなどの可溶性のカ
ルシウム塩あるいはリン酸カルシウムなどの不溶性のカ
ルシウム塩のカルシウムイオンなどが挙げられるが、な
かでも酢酸カルシウム，塩化カルシウムなどのカルシウ
ムイオンが好ましい。

リン酸イオンとカルシウムイオンとの当量比として
は、カルシウムイオン１当量に対してリン酸イオンが1.
25〜30当量なかでも1.5〜7.5当量となるのが好ましく、
0.01〜0.1ミリ当量/mlとりわけ0.02〜0.07ミリ当量/ml
のリン酸カルスイムゲルを生ぜしめるのがよい。

例えば、百日せきＩ相菌の培養物の上清から硫酸アン
モニウム塩析により得た沈殿を、1M塩化ナトリウム加0.
05Mリン酸塩緩衝液で溶解した場合には、pH6.5〜９にて
酢酸カルシウムを終末濃度が0.1〜1.0W/V％好ましくは
約0.2〜0.6W/V％となるように添加し、４℃〜室温でゆ
るやかに20分〜２時間反応させてリン酸カルシウムゲル
を生ぜしめる。反応終了後、生じた沈殿を自体公知の除
去法例えばろ過，遠心分離などにより除去すると、有効
成分をほとんど損失することなく、選択的に内毒素を90
〜99.9％除去することができる。

上記処理によって得られる粗精製物はさらにゾーナル
遠心処理に供されるが、硫酸アンモニウム塩析によりさ
らに濃縮し、透析後ゾーナル遠心処理を行なうのが好ま
しい。

本発明におけるゾーナル遠心法としては、ショ糖密度
勾配遠心法，酒石酸カリウム密度勾配遠心法，セシウム
クロライド密度勾配遠心法などが挙げられるが、なかで
もショ糖密度勾配遠心法が好ましく、ショ糖密度勾配遠
心条件は通常ショ糖濃度０−30W/W％のグレディエント,
Rmax60,000〜122,000Gで10〜24時間である。

本発明においては、上記のようにして得られる百日せ
きの感染防御有効成分含有液に、ホルマリン，グルター
ルアルデヒド，ピルビンアルデヒドなどを作用させてト
キソイド化（減毒化）した後、過剰のホルマリン，グル
タールアルデヒド，ピルビンアルデヒドを透析，遠心分
離，限外ろ過などの自体公知の除去法により除去して百
日せきトキソイドを製造する。トキソイド化する際に
は、例えば特開昭57−50925号公報の記載に従って、塩
基性アミノ酸（例えばＬ−リジン，グリシンなど）が実
質的に存在しない（すなわち10ミリモル濃度未満）条件
下で、百日せきの有効成分含有液にホルマリンを0.1〜
0.6V/V％になるように混合し、32〜42℃で３〜14日間イ
ンキュベートして凝集塊化させ、得られる凝集塊化トキ
ソイドを適宜の手段（例、約10〜50キロサイクルの超音
波処理）により破砕した後、適宜の水性媒体（例、M/10
0〜M/250リン酸塩緩衝生理食塩液など）に懸濁してトキ
ソイド液を得るのがよい。

本発明の方法によれば、リムラス試験法により測定し
た場合、蛋白窒素含量10μｇ当りの内毒素含量が0.5ng
以下好ましくは0.1ng以下の百日せきトキソイドを製造
することができ、内毒素の除去率を99.9994％以上好ま
しくは99.9998％以上に向上させることができる。

本発明の百日せきトキソイドは、常法により沈降精製
百日せきワクチンまたは沈公精製百日せき，ジフテリ
ア，破傷風混合ワクチンに調整して人体に接種すること
ができる。

作用本発明の百日せき内毒素の除去法によれば、感染防御
有効成分と内毒素との分離が極めて明瞭になるので、有
効成分の採取が容易にでき、感染防御有効成分の収率を
向上させることができる。さらに、大量の材料をゾーナ
ル遠心処理に供することが可能なため、百日せきトキソ
イドの製造能力を従来の２倍以上に向上させることがで
き、効率的に内毒素を除去できるので、工業的価値は極
めて高いものである。

また本発明の百日せきトキソイドは、内毒素含量が従
来の1/10以下に削除されているので、本発明の百日せき
トキソイドを用いれば従来のワクチンと同等の免疫力価
を保有し、しかもより低毒性のワクチンを製造すること
ができる。

実施例以下に本発明を参考例，実施例によりさらに具体的に
説明するが、これらは本発明を制限するものではない。

なお、下記実施例，参考例で使用されている百日せき
Ｉ相菌東浜株の性状は、インフェクション・アンド・イ
ミュニティ（Infection and Immunity），６,899（197
2）などに記載されており、当該株は国立予防衛生研究
所において保管され、昭和55年８月13日より財団法人発
酵研究所に受託番号IFO14073として寄託されている。

参考例１百日せきＩ相菌東浜株（Bordetella pertussis Toham
a phaseI Strain:IFO14073）をジャガイモ，ペプトン，
食塩，寒天，牛血液で調製したボルデ・ジャング培地に
植付けた。35℃,5日間培養後に、半透明円型集落を釣菌
してＫ凝集粗抗体を反応する集落を再度ボルデ・ジャン
グ培地に展開して種菌とした。次いで、種菌をコーエン
ウィラー液体培地に植付け、35℃,1日培養して得た菌浮
遊液をスティナーショルト液体培地に、終末菌濃度が約
10億個/mlになるように加え、ルー瓶にて35℃,5日間培
養した。培養液を集液し、得られた上清に約20W/V％の
硫酸アンモニウムを加え、充分撹拌した後４℃にて静置
した。約14日後遠心分離を行ない、上清を捨て沈殿を集
めた。得られた沈殿に集液時溶液の1/10量の1M塩化ナト
リウム加0.05Mリン酸塩緩衝液（pH8.0）を加え、充分撹
拌した。４℃にて４日間放置後、再び遠心分離を行な
い、上清（抽出液Ｉ）を採取した。この抽出液Ｉはフィ
ラメンタス血球凝集素（FHA），百日せき毒素（PT）な
どの感染防御有効成分および内毒素（ET）を豊富に含
み、菌体を含んでいなかった。

次いで、抽出液Ｉに酢酸カルシウムを終末濃度が0,0.
2,0.4,0.6,0.8,1.0W/V％になるように加え、約１時間室
温でゆっくり攪拌した後、生じた沈殿をろ紙ろ過して上
清を得た。各上清について、ニワトリ血球凝集素価（HA
価）,PT含量およびET含量を測定した。結果は表１に示
すとおりとなった。なお、PT含量はELISA法により、ET
含量は大腸菌内毒素（Difco 055−B5）を標準品とし、
リムラム試験法（マリンクロット社キット）により測定
した。

表１から過剰のリン酸イオン共存下酢酸カルシウムの
カルシウム塩を供給し、生じる沈殿を除去することによ
り、ETが選択的に除去されることが明らかである。ま
た、酢酸カルシウムを0.2〜0.6W/V％添加した場合、有
効成分（HA価,PT含有）を損失することなく、ETを約99
％除去することができる。

参考例２水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いてpHを5.0〜10.0
に調整し、酢酸カルシウムの添加量を0.5W/V％とした以
外は、参考例１と同様にして実施した。結果は表２に示
すとおりとなった。pH6.0からゲルが発生し、内毒素の
除去効果はpH上昇とともに向上した。表２から明らかな
ように、至適pHは７〜９である。

参考例３ 0.5W/V％の酢酸カルシウムの代わりに5W/V％のヒドロ
キシアパタイト（BDH社製）を用いて、参考例２と同様
に実施した。結果は表３に示すとおりとなった。

表３から明らかなように、酢酸カルシウムを添加して
溶液内でリン酸カルシウムゲルを発生させる場合に比
べ、ヒドロキシアパタイトを添加した場合、内毒素除去
率が悪くかつpH依存性が逆である。

実施例１参考例１に記載の方法で得られた抽出液Ｉ（対照群）
および抽出液Ｉに酢酸カルシウムを終末濃度が0.5W/V％
になるように添加して参考例１と同様にした材料（リン
酸カルシウムゲル処理群）に、飽和硫酸アンモニウムを
等量加えて４℃にて７日間静置した。この硫酸アンモニ
ウム塩析物を10,000rpmで20分間遠心して沈殿を集め、
これに集液時溶液の約1/300量の1M塩化ナトリウム加0.0
5Mリン酸塩緩衝液（pH8.0）を加えた。充分混合した
後、外液に1M食塩液（pH8.0）を用いてチューブ法で透
析した。透析後の濃縮液を、ショ糖密度勾配１〜30W/W
％,Rmax69.400Gで約18時間ショ糖密度勾配遠心処理し
た。なおこのとき、リン酸カルシウムゲル処理群の負荷
を対照群の２倍とした。遠心終了後、低速回転で34W/W
％ショ糖液をローター内に送入して画分採取を行なっ
た。採取した各画分について、FHA含量,PT含量をELISA
法により、ET含量を参照例１と同様な方法により測定し
た。結果は第１図及び第２図い示すとおりとなった。な
お、FHA含量,PT含量,ET含量はそれぞれ−○−，−△
−，−■−で示されている。

第１図および第２図から、リン酸カルシウムゲル処理
群は負荷を２倍にしたにもかかわらず、有効成分（FHA,
PT）と内毒素との分離が、対照群に比べ極めて明瞭であ
ることがわかる。

リン酸カルシウムゲル処理群および対照群について、
ET含量が少なく、FHA含量が多い画分を集めて、蛋白窒
素含量を約50μg/mlに調整した。ゼラチンを0.02W/V％,
Tween80を0.05V/V％，ホルマリンを0.4V/V％になるよう
に加え、39℃で７日間インキュベートした。得られたト
キソイド液を透析後、ET含量を測定した。結果は表４に
示すとおりとなつた。なおET含量は、大腸菌内毒素（Di
fco055−B5）を標準としてリムラス試験法（和光純薬キ
ット）により測定した。

表４から明らかなように、百日せきトキソイド原液の
ET含量についてワクチンレベル（蛋白窒素含量10μg/m
l）で比較してみると、リン酸カルシウムゲル処理群で
は対照群の1/40以下に改善されていることがわかる。

実施例２実施例１で得た百日せきトキソイド原液２バットにつ
いて、Levine（Reo Levine,Joseph L.Stone＆Louise Wy
man:Factors affectiong the efficiency of the alumi
num adjuvant in diphteria and tetanus toxoids.J.Im
munology75,301〜307,1955）の原法を用い、pH7.0M/250
リン酸塩緩衝生理食塩液で蛋白窒素約10μg/mlになるよ
うに希釈し、これに塩化アルミニウムを0.18W/V％にな
るように加えて、よく混合してpH7.0になるように塩酸
あるいは水酸化ナトリウムで調整して、約0.2mg/mlのア
ルミニウム沈降ワクチンにした。

この沈降ワクチンの主な性状はpH7.0,ウサギ発熱性陰
性，マウス体重減少性10BWDU/mlと同等以下、マウス白
血球増加性0.5LPU/mlと同等以下、マウスヒスタミン増
感性0.8HSU/mlと同等以下、百日せきトキソイド力価8IU
/mlと同等以上であり、いずれのバッチも生物学的製剤
基準記載の基準値を満足していた。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれ実施例１で得たリン酸カ
ルシウムゲル処理群および対照群のショ糖密度勾配遠心
のプロフィールを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】百日せきＩ相菌の感染防御有効成分および
内毒素の含有液からゾーナル遠心法により内毒素を除去
する方法において、ゾーナル遠心処理に先立ち上記含有
液に過剰のリン酸イオン共存下カルシウムイオンを供給
し、生じる沈殿を除去することを特徴とする百日せき内
毒素の除去法。
【請求項２】リン酸イオンとカルシウムイオンとの当量
比が、カルシウムイオン１当量に対してリン酸イオン1.
25〜30当量である請求項１記載の除去法。
【請求項３】リン酸イオンとカルシウムイオンとの当量
比が、カルシウムイオン１当量に対してリン酸イオン1.
5〜7.5当量である請求項２記載の除去法。
【請求項４】供給するカルシウムイオンが酢酸カルシウ
ムまたは塩化カルシウムのカルシウムイオンである請求
項１記載の除去法。
【請求項５】生じる沈殿が0.01〜0.1ミリ当量/mlのリン
酸カルシウムゲルである請求項１記載の除去法。
【請求項６】生じる沈殿が0.02〜0.07ミリ当量/mlのリ
ン酸カルシウムゲルである請求項５記載の除去法。
【請求項７】生じる沈殿が、pH6.5〜9,4℃〜室温でゆる
やかに20分〜２時間反応させて生じる沈殿である請求項
１記載の除去法。
【請求項８】生じる沈殿が、百日せきＩ相菌の培養物の
上清から硫酸アンモニウム塩析により得た沈殿を1M塩化
ナトリウム加0.05Mリン酸塩緩衝液に溶解し、pH6.5〜９
にて酢酸カルシウムを終末濃度が0.1〜1.0W/V％となる
ように添加し、４℃〜室温でゆるやかに20分〜２時間反
応させて生じるリン酸カルシウムゲルである請求項１記
載の除去法。
【請求項９】添加する酢酸カルシウムの終末濃度が0.2
〜0.6W/V％である請求項８記載の除去法。
【請求項１０】ゾーナル遠心がショ糖密度勾配遠心であ
る請求項１記載の除去法。
【請求項１１】ショ糖密度勾配遠心条件が、ショ糖濃度
０〜30W/W％のグレディエント,Rmax60,000〜122,000G,1
0〜24時間である請求項10記載の除去法。
【請求項１２】請求項１記載の除去法により得られる感
染防御有効成分含有液をトキソイド化することを特徴と
する百日せきトキソイドの製造法。
【請求項１３】百日せきＩ相菌の培養物の上清から硫酸
アンモニウム塩析により得た沈殿を1M塩化ナトリウム加
0.05Mリン酸塩緩衝液に溶解し、pH6.5〜９にて酢酸カル
シウムを終末濃度が0.2〜0.6W/V％となるように添加
し、４℃〜室温でゆるやかに20分〜２時間反応させて生
じるリン酸カルシウムゲルを除去したのち、ショ糖濃度
０〜30W/W％のグレディエント,Rmax60,000〜122,000G,1
0〜24時間の条件で、ショ糖密度勾配遠心処理して得ら
れる感染防御有効成分含有液に、塩基性アミノ酸が実質
的に存在しない条件下で0.1〜0.6V/V％のホルマリンを
混合し、32〜42℃で３〜14日間インキュベートして得ら
れる凝集塊化トキソイドを破砕後水性媒体に懸濁するこ
とを特徴とする請求項12記載の製造法。
【請求項１４】請求項13記載の製造法により製造される
トキソイド。