KR102106040B1

KR102106040B1 - 자가혈당측정기를 활용한 표적핵산 검출방법

Info

Publication number: KR102106040B1
Application number: KR1020180155255A
Authority: KR
Inventors: 박현규; 김효용; 안준기
Original assignee: 한국과학기술원; 재단법인 바이오나노헬스가드연구단
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2020-05-04
Anticipated expiration: 2038-12-05
Also published as: WO2020116812A1

Abstract

본 발명은 표적핵산을 자가혈당측정기를 이용하여 간편하게 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 저렴하며 누구나 쉽고 간편하게 사용할 수 있는 자가혈당측정기를 이용하여, 핵산증폭산물의 표적핵산을 빠르고 간편하게 검출 및 정량할 수 있다.

Description

자가혈당측정기를 활용한 표적핵산 검출방법 {Method for Detecting Target Nucleic Acid using Personal Glucose Meter}

본 발명은 자가혈당측정기를 이용하여 표적핵산을 간편하게 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표적핵산의 증폭반응용액에 글루코오스와 dNTP 재생에 관여하는 효소를 함유하는 용액에 첨가하여, 증폭반응용액에 남아있는 dNTP에 의하여 글루코오스를 글루코오스-6-인산으로 전환한 후, 혈당측정기를 이용하여 글루코오스 농도를 측정하고, 표적핵산을 검출 또는 정량하는 것을 특징으로 하는 혈당측정기를 이용한 시료 내 표적핵산의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.

표적핵산 검출기술은 유전학(genetics), 임상 화학(clinical chemistry), 법의학(forensic) 및 진단학(diagnostics) 등의 다양한 기술 분야에서 그 중요성이 대두되고 있다. 이러한 기술분야에서 가장 대표적으로 사용되고 있는 표적핵산 검출방법은 PCR을 이용하여 표적핵산의 특정 염기서열 (sequence)을 증폭한 후, 전기영동을 통해 생성된 증폭 산물을 확인하는 것이다. 하지만, 이러한 전기영동 기반 PCR 분석 기술의 경우, 검출을 위해 많은 시간이 요구될 뿐만아니라, 전체 과정이 노동 집약적이라는 단점이 있다. 이러한 단점을 해결하기 위한 기술로서, PCR 반응을 실시간으로 검출하는 real-time PCR (이하 RT-PCR) 기술이 개발되어 왔다. RT-PCR 기술은 표적핵산 증폭반응의 실시간 검출뿐만 아니라, 표적핵산의 정량 검출을 가능하게 함으로써, 분자진단 (molecular diagnostics) 시장의 대표 기술로서 널리 활용되고 있다. 하지만, 이러한 장점에도 불구하고, 값비싼 시약 및 검출 장비가 필수적으로 요구되며, 검출 장비의 휴대성이 결여되기 때문에, 대형 병원 또는 전문 연구소 등의 환경에서만 제한적으로 사용 가능하다는 한계를 가지고 있다.

한편, 자가혈당측정기 (personal glucose meter, PGM)는 전 세계적으로 가장 널리 보급되어 있는 현장형 체외진단 기기이며, 자가혈당측정기를 이용하여 포도당 이외의 표적물질을 검출하는 기술이 최근 보고된 바 있다 (미국특허 제8,945,943호). 상기 기술의 경우, 표적물질과 압타머(aptamer)의 결합에 의한 가닥변위(strand displacement) 반응 및 인버타아제(invertase) 활성을 이용한 포도당 생성 반응을 이용하여, 여러 표적 물질 (cocaine, adenosine, interferon-γ, 및 UO₂ ²⁺ 등)을 자가혈당측정기를 이용하여 간편하게 검출하였다. 하지만, 상기 기술의 구현을 위해서는 압타머 프로브 및 효소의 수식이 필요할 뿐만 아니라, 자성 입자 (magnetic bead)를 이용한 시료의 분리 과정이 요구되는 등, 전체 검출 과정이 복잡해진다는 단점이 있다.

상기 언급된 기존 기술의 단점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 자가혈당측정기를 활용한 adenosine 5'-triphosphate (이하 ATP) 검출기술을 개발한 바 있다 (한국특허공개: 10-2018-0107875). 구체적으로, 상기 기술의 경우, 용액 내에 ATP가 존재할 때 발생하는 인산화효소 연쇄반응에 의해 유도되는 포도당 농도 변화를, 상용화된 자가혈당측정기로 측정함으로써 ATP를 검출하는 기술에 관한 것이다.

이에, 본 발명자들은 핵산 증폭산물에서 표적핵산을 보다 간편하게 검출 또는 정량하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명자들의 시료에 표적핵산이 존재하는 경우, PCR반응이 일어나 증폭산물의 dNTP 농도가 낮아지는 것에 착안하여, PCR 반응산물에 글루코오스, 헥소카이네이즈(hexokinase) 및 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase)를 첨가하여 반응시킨 후, 자가혈당측정기를 이용하여, 글루코오스 농도를 측정하는 경우, 시료의 표적핵산을 검출 또는 정량할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 핵산 증폭산물에서 표적핵산을 보다 간편하게 검출 또는 정량하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 검출용 핵산; dNTP; 표적핵산 증폭용 프라이머; 및 핵산중합효소를 함유하는 시료를 이용하여 표적핵산을 증폭시켜, 표적핵산 증폭반응 용액을 수득하는 단계; (b) 상기 표적핵산 증폭반응 용액에 글루코오스; 포스포에놀피루베이트(PEP); 헥소카이네이즈(hexokinase); 및 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase)를 포함하는 표적핵산 검출반응 용액을 첨가하고, 상기 글루코오스를 글루코오스-6-인산으로 전환하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 표적핵산 검출반응 용액의 글루코오스 농도를 측정하여 시료 내의 표적핵산을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는 시료 내 표적핵산의 검출 또는 정량 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 저렴하며 누구나 쉽고 간편하게 사용할 수 있는 자가혈당측정기를 이용하여, 핵산증폭산물의 표적핵산을 빠르고 간편하게 검출 및 정량할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 자가혈당측정기를 활용한 표적핵산 검출방법을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 dNTP 유무와 헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈 효소의 첨가 여부 조합에 따라 변하는 용액 내의 포도당 농도를 자가혈당측정기로 측정한 결과를 나타낸 것이다(a: 효소가 첨가되지 않은 용액; b:헥소카이네이즈 첨가 용액; c: 헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈 첨가용액; d: 헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈가 첨가되었으나 dNTP가 첨가되지 않은 용액).
도 3은 서로 다른 종류의 dNTP 첨가 시, 헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈 효소의 첨가 여부에 따라서 변하는 용액 내의 포도당 농도를 자가혈당측정기로 측정한 결과를 나타낸 것으로, (a), (b), (c), 및 (d)는 각각 dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP가 첨가된 용액이다.
도 4는 표적핵산 유무(회색막대:표적핵산 x, 분홍막대 표적핵산 o)와 헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈 효소의 첨가 여부 조합에 따라 변하는 용액 내의 포도당 농도를 자가혈당측정기로 측정한 결과를 나타낸 것이다(a: 효소가 첨가되지 않은 용액; b: 헥소카이네이즈만 첨가된 용액; c:헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈가 모두 첨가된 용액).
도 5는 PCR에 의해 생성되는 증폭 산물 농도에 따른 용액 내의 포도당 농도 변화를 자가혈당측정기로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 핵산의 종류에 따른 용액 내의 포도당 농도 변화를 자가혈당측정기로 측정한 결과를 나타낸 것이다(a: 핵산이 첨가되지 않은 용액; b:표적핵산 (Hepatitis B virus (이하 HBV) gDNA가 첨가된 용액이며, c:Escherichia coli gDNA가 첨가된 용액; d:Enterococcus faecium gDNA가 첨가된 용액).

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 세계적으로 가장 널리 보급되어 있는 현장형 체외진단 기기인 자가혈당측정기를 사용하여, 핵산 증폭산물에서 표적핵산을 보다 간편하게 검출 또는 정량하는 방법을 개발하고자 하였으며, dNTP가 존재할 경우, 인산화효소 연쇄반응에 의해, 용액 내의 포도당 농도가 줄어드는 원리를 이용하여, 표적핵산을 검출하는 방법을 개발하였다.

구체적으로, 본 발명은 dNTP와 표적핵산 증폭용 프라이머 및 핵산 중합효소를 함유하는 핵산 증폭반응용액에 표적핵산이 존재하는 경우, 표적핵산증폭반응에 의해 용액 내의 dNTP 농도가 줄어들게 되고, 이로 인해, 인산화효소 연쇄반응의 구동 효율이 감소함으로써, 최종적으로, 포도당 농도의 감소 정도가 줄어드는 원리를 기반으로 표적핵산을 검출하는 방법이다.

따라서, 본 발명은 (a) 검출용 핵산; dNTP; 표적핵산 증폭용 프라이머; 및 핵산중합효소를 함유하는 시료를 이용하여 표적핵산을 증폭시켜, 표적핵산 증폭반응 용액을 수득하는 단계; (b) 상기 표적핵산 증폭반응 용액에 글루코오스; 포스포에놀피루베이트(PEP); 헥소카이네이즈(hexokinase); 및 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase)를 포함하는 표적핵산 검출반응 용액을 첨가하고, 상기 글루코오스를 글루코오스-6-인산으로 전환하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 표적핵산 검출반응 용액의 글루코오스 농도를 측정하여 시료 내의 표적핵산을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는 시료 내 표적핵산의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법의 표적핵산 검출반응 용액에서는 (i) 헥소카이네이즈 활성에 의해서 dNTP가 dNDP로 전환되는 단계; (ii) 상기 (i)의 헥소카이네이즈 활성에 의해 포도당이 글루코오스-6-인산(G6P)으로 전환되는 단계; (iii) 피루베이트 카이네이즈 활성에 의해, 상기 (i)에서 생성된 dNDP가 dNTP로 전환되는 단계; (iv) 상기 (ii)의 피루베이트 카이네이즈 활성에 의해 PEP가 피루베이트로 전환되는 단계; 및 (v) 상기 인산화효소 연쇄반응을 통해 용액 내의 포도당 농도가 지속적으로 감소하는 단계로 구성되는 인산화효소 연쇄반응이 수행된다.

본 발명에서 시료에 표적핵산이 존재할 경우, PCR이 유도되어 용액 내의 dNTP가 소진되며, dNTP 농도 감소에 의해 인산화효소 연쇄반응의 구동 효율이 감소하고, 인산화효소 연쇄반응 구동 효율 감소에 의해 포도당 농도 감소 정도가 줄어들계되며, 줄어든 포도당 농도를 자가혈당측정기를 통해 측정하여, 표적핵산이 존재할 경우에는 dNTP 농도 감소에 의해, 포도당 농도가 적게 줄어들게되며, 표적핵산이 존재하지 않는 경우에는 용액 내 dNTP 감소가 없어, 인산화효소 연쇄반응이 증가하여 포도당 농도가 감소하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적핵산의 증폭은 핵산의 증폭방법이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 PCR 반응, RT-PCR,Gap-LCR 리가아제 연쇄 반응, Gap-LCR, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 및 핵산염기서열 기반 증폭으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 측정은 혈당측정기를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 표적핵산이 없는 대조군을 이용한 결과보다 글루코오스의 농도가 높게 나타나는 경우, 시료에 표적핵산이 존재하는 것으로 결정하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 표적핵산이 없는 대조군을 이용한 결과보다 글루코오스의 농도가 105~200%로 높게 나타나는 경우, 시료에 표적핵산이 존재하는 것으로 결정할 수 있다.

본 발명에서 제안하는 자가혈당측정기 기반 표적핵산 검출 기술에서는 헥소카이네이즈 활성에 의해 dNTP가 dNDP로 전환되면서, 포도당이 글루코오스-6-인산(G6P)로 전환된다. 이후, 피루베이트 카이네이즈의 활성에 의해 상기 생성된 dNDP가 dNTP로 전환되면서, 용액에 첨가된 PEP가 피루베이트로 전환되고, 상기 반응에서 생성된 dNTP는 다시 헥소카이네이즈 반응의 기질로서 사용된다. 상기 언급된 일련의 반응들에 의해 인산화효소 연쇄반응이 구성되며, 본 인산화효소 연쇄반응을 통해 자가혈당측정기를 활용한 표적핵산 검출 기술이 구현되는 것을 특징으로 할 수 있다.

보다 구체적으로, 용액 내에 표적핵산이 존재하지 않을 경우, PCR이 유도되지 않게 되며, 초기에 넣어준 dNTP의 양이 그대로 용액 내에 남아 있게 된다. 따라서, 초기의 높은 농도의 dNTP에 의해, 인산화효소 연쇄반응이 활발히 유도되며, 최종적으로, 많은 양의 포도당이 G6P로 전환되어, 용액 내의 포도당 농도가 크게 감소하게 된다. 반면, 용액 내에 표적핵산이 존재할 경우, PCR이 활발히 유도됨으로써, 초기에 용액 내에 넣어준 dNTP의 일정량이 소모된다. PCR 구동에 의해 dNTP가 소모됨으로써, 상기 인산화효소 연쇄반응의 구동 효율이 낮아지게 되며, 결과적으로, 용액 내의 포도당 농도가 감소되는 정도가 줄어들게 된다. 이와 같이, 표적핵산의 유무에 따라 결정되는 포도당 농도를 자가혈당측정기를 이용하여 측정함으로써, 용액 내의 표적핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다 (도 1).

또한, 본 발명의 일 양태에서는 PCR에 의해 생성되는 증폭 산물의 농도와 인산화효소 연쇄반응에 의해 결정되는 포도당 농도 사이의 상관관계를 확인하였으며, 증폭 산물 농도 (0 ~ 75 nM)가 변화함에 따라, 용액 내의 포도당 농도가 선형적으로 변하는 것을 확인하여(도 5 참조), 본 발명의 자가혈당측정기 기반 표적핵산 검출 기술을 이용하여 PCR 증폭 산물의 정량적 검출이 가능한 것을 확인하였다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 표적핵산의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+ 와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요청된다. 증폭반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에서 어닐링 또는 혼성화는 표적핵산 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 명세서에 기술된 용어 "증폭반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR (polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 표적핵산 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: PCR을 이용한 표적핵산 증폭반응 조건 확립

자가혈당측정기를 이용한 표적핵산 검출을 위하여는 먼저 PCR 반응이 선행되어야 한다. 이후 실시예에서 사용한 표적핵산 증폭을 위한 PCR 반응조건은 다음과 같다.

사용한 PCR 용액 (최종 50 μL)은 dNTP (1 mM each) 5 μL, 하기 서열의 포워드/리버스 프라이머(각 10 mM) 4 μL, 표적핵산으로 HBV(Hepatitis B virus) gDNA(한국생명공학연구원) (10⁷ 카피/μL) 1 μL, 및 Taq DNA 폴리머라아제(5 U/μL) 0.5μL를 PCR 완충 용액에 첨가하여 제작하였으며, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 및 2 mM MgCl₂를 포함하는 PCR 완충 용액을 사용하였다. 상기 PCR 용액을 95℃에서 5분 동안 예열한 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 및 72℃ 1분의 온도 조절 과정을 40회 반복하였으며, 이후, 72℃에서 5분 동안 처리함으로써, 표적핵산을 증폭하였다.

사용한 프라이머 서열은 다음과 같다.

Forward primer: 5'-CTC GCC AAC TTA CAA GGC-3'(서열번호 1)

Reverse primer: 5'-CAG AGG TGA AGC GAA GTG-3'(서열번호 2)

실시예 2: 자가혈당측정기를 활용한 표적핵산 검출 반응 조건 확립

자가혈당측정기를 활용한 표적핵산 검출반응 용액 (최종 50 μL)은 20 mM 포도당 5μL, 50 mM PEP(phosphoenolpyruvic acid) 2μL, 헥소카이네이즈(hexokinase) (2.5U/μL) 2μL, 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase) (1U/μL) 5μL, 및 실시예 1에서 반응을 수행한 PCR 용액 25μL를 인산화효소 연쇄반응 완충용액(100mM Tris-HCl (pH 7.4) 및 10 mM MgCl₂)에 첨가하여 제작하였다.

상기 표적핵산 검출반응 용액을 30℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 자가혈당측정기를 이용하여 용액 내의 포도당 농도를 측정하였다.

실시예 3: dNTP에 의한 인산화효소 연쇄반응 구동 검증

dNTP에 의한 인산화효소 연쇄반응의 구동을 검증하기 위한 실험을 진행하였다. 실험군은 효소가 첨가되지 않은 용액(a). 헥소카이네이즈(hexokinase)만 첨가된 용액(b), 헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase)가 모두 첨가된 용액 (c) 및 헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈가 첨가되었지만, dNTP가 첨가되지 않은 용액 (d)으로 나누어 반응용액을 30℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 자가혈당측정기를 이용하여 용액 내의 포도당 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 효소가 첨가되지 않은 용액(a) 대비, 헥소카이네이즈(hexokinase)가 첨가된 용액(b)의 용액 내의 포도당 농도가 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈가 모두 첨가된 용액 (c)의 경우, 헥소카이네이즈만 첨가된 용액(b) 대비, 포도당 농도가 큰 폭으로 감소하는 것을 확인하였다. 상기 실험 결과를 통해, 본 발명에서 사용한 인산화효소 연쇄반응은 헥소카이네이즈 및 피루베이트 카이네이즈가 동시에 활성을 가지는 경우에만 높을 효율로 구동되는 것을 확인하였다. 또한, hexokinase 및 pyruvate kinase가 모두 첨가되었지만, dNTP가 첨가되지 않은 용액 (d)에서는 포도당 농도가 감소되지 않았다. 이를 통해, 본 발명에서 사용한 인산화효소 연쇄반응은 용액 내에 dNTP가 존재하는 경우에만 유도된다는 것을 확인하였다.

실시예 4: 서로 다른 종류의 dNTP에 의한 인산화효소 연쇄반응 구동 검증

서로 다른 종류의 dNTP에 의한 인산화효소 연쇄반응의 구동을 검증하기 위한 실험을 진행하였다. 실험균은 각각 dATP (a), dGTP (b), dCTP (c) 및 dTTP (d)를 각각 함유하면서, 헥소카이네이즈만을 함유한 용액과 헥소카이네이즈와 피루베이트 카이네이즈를 함께 함유한 용액으로 나누어 진행하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, dATP (a) 및 dGTP (b)가 첨가된 용액의 경우, 헥소카이네이즈와 피루베이트 카이네이즈가 첨가되었을 때, 인산화효소 연쇄반응에 의해 용액 내의 포도당 농도가 크게 감소하는 것을 확인하였다. 반면, dCTP (c) 및 dTTP (d)가 첨가된 용액의 경우, 헥소카이네이즈와 피루베이트 카이네이즈가 첨가되더라도, 용액 내의 포도당 농도 감소가 크지 않음을 확인하였다. 상기 실험 결과를 통해, 본 발명에서 사용한 인산화효소 연쇄반응은 주로 dATP 및 dGTP에 의해 유도된다는 것을 확인하였다.

실시예 5: 자가혈당측정기를 활용한 표적핵산 검출 반응 시스템 검증

상기 언급된 인산화효소 연쇄반응을 이용하여, 표적핵산의 유무에 따른 포도당 농도변화 확인실험을 진행하였다.

실험은 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였으며, 어떠한 효소도 첨가되지 않은 경우(a), 헥소키아아제가 첨가된 경우(b), 헥소카이네이즈와 피루베이트 카이네이즈가 모두 첨가된 경우(c)로 나누어 수행하였다.

그 결과, 어떠한 효소도 첨가되지 않은 경우 (a), 표적핵산 첨가 여부에 따른 포도당 농도 변화가 나타나지 않았다. 하지만, 헥소카이네이즈가 첨가된 경우 (b), 표적핵산 유무에 따른 포도당 농도 차이가 확인되었으며, 상기 인산화효소 연쇄반응을 유도하기 위해 헥소카이네이즈와 피루베이트 카이네이즈가 모두 첨가된 경우 (c), 표적핵산 유무에 따른 포도당 농도 차이가 더욱 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 6: PCR에 의해 생성되는 증폭 산물 농도에 따른 용액 내의 포도당 농도 변화 검증

PCR에 의해 생성되는 증폭 산물의 농도와 인산화효소 연쇄반응에 의해 결정되는 포도당 농도 사이의 상관관계를 확인하기 위한 실험을 진행하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 증폭 산물 농도 (0 ~ 75 nM)가 변화함에 따라, 용액 내의 포도당 농도가 선형적으로 변하는 것을 확인하였다. 상기 실험 결과를 통해, 본 발명에서 제안하는 자가혈당측정기 기반 표적핵산 검출기술을 이용하여 PCR 증폭 산물의 정량적 검출이 가능함을 검증하였다.

실시예 7: 자가혈당측정기를 활용한 표적핵산 검출 기술 선택도 검증

여러 종류의 핵산을 첨가하였을 때, 용액 내의 포도당 농도 변화를 확인하는 실험을 진행하였다. 실험군은 핵산이 첨가되지 않은 경우 (a), 표적핵산 (HBV gDNA)이 첨가된 경우 (b), 비특이적 핵산인 E.coli gDNA가 첨가된 경우 (c) 및 비특이적 핵산인 E.faecium gDNA가 첨가된 경우(d)로 나누어 수행하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 표적핵산 (HBV gDNA)이 첨가된 용액 (b)의 경우, 핵산이 첨가되지 않은 용액 (a) 대비 월등히 높은 포도당 농도가 측정되었다. 하지만, 비특이적 핵산 (Escherichia coli (c) 및 Enterococcus faecium (d) gDNA)이 첨가된 용액의 경우, 핵산이 첨가되지 않은 용액 (a)과 비슷한 포도당 농도가 측정되었다. 상기 실험 결과를 통해, 본 발명에서 제안하는 자가혈당측정기 기반 표적핵산 검출기술의 선택도를 검증하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Bionano Health Guard Research Center <120> Method for Detecting Target Nucleic Acid using Personal Glucose Meter <130> P18-B262 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctcgccaact tacaaggc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cagaggtgaa gcgaagtg 18

Claims

다음 단계를 포함하는 시료 내 표적핵산의 검출 또는 정량 방법:
(a) 검출용 핵산; dNTP; 표적핵산 증폭용 프라이머; 및 핵산중합효소를 함유하는 시료를 이용하여 표적핵산을 증폭시켜, 표적핵산 증폭반응 용액을 수득하는 단계;
(b) 상기 표적핵산 증폭반응 용액에 글루코오스; 포스포에놀피루베이트(PEP); 헥소카이네이즈(hexokinase); 및 피루베이트 카이네이즈(pyruvate kinase)를 포함하는 표적핵산 검출반응 용액을 첨가하고, 상기 글루코오스를 글루코오스-6-인산으로 전환하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 표적핵산 검출반응 용액의 글루코오스 농도를 측정하여 시료 내의 표적핵산을 검출 또는 정량하는 단계.
제1항에, 상기 (a) 단계의 표적핵산의 증폭은 PCR 반응, RT-PCR,Gap-LCR 리가아제 연쇄반응, Gap-LCR, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄반응 및 핵산염기서열 기반 증폭으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 측정은 혈당측정기를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 표적핵산이 없는 대조군을 이용한 결과보다 글루코오스의 농도가 높게 나타나는 경우, 시료에 표적핵산이 존재하는 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.