RS57450B1

RS57450B1 - Postupak za proizvodnju kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline

Info

Publication number: RS57450B1
Application number: RS20180864A
Authority: RS
Inventors: Ichiro Shibuya; Hiroaki Okano; Yoshitomo Kanaoka; Nobuchika Takesue
Original assignee: Asahi Group Holdings Ltd
Priority date: 2008-11-18
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2018-09-28
Also published as: EP3385369B1; WO2010058616A1; JP5587635B2; RS62280B1; US20110223287A1; JP2010148517A; AU2009318734A1; EP2402428A1; JPWO2010058527A1; BRPI0922088B1; JP4503700B1; JP4757944B2; CN102216442A; JP2011115180A; EP2402428B1; JPWO2010058616A1; BRPI0922088A8; US9005683B2; DK3385369T3; EP2402428A4

Description

Opis pronalaska

Polje pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline, na kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline, na ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline, kao i na hranu ili piće koje sadrži ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline. Konkretnije, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za povećanje proizvodnje glutaminske kiseline u kvascu u skladu sa patentnim zahtevima 1, 2 i 3, kao i na postupak za dobijanje kvasca u skladu sa patentnim zahtevom 4.

Patentna prijava je zasnovana na, i ima prioritet nad, japanskom patentnom prijavom br. 2008-294642 podnetom 18.11. 2008. godine i PCT/JP2009/059206 podnetom 19.5. 2009. godine.

Pozadina pronalaska

U ovom trenutku postoji globalna potreba za prirodnim i zdravstvno blagotvornim, neveštačkim začinima bez primene aditiva, posebno u Japanu i razvijenim zemljama, uključujući zemlje Evrope i SAD. U pogledu ove potražnje, iako su u industriji ekstrakcije kvasaca razvijeni ekstrakti sa visokom dodatom vrednošću i unapređenim “umamijem”, kao što su nukleinske kiseline, razvoj takođe napreduje i u pravcu aminokiselina, kao što je glutaminska kiselina, koja je primer “umamija” ekvivalentan nukleinskim kiselinama.

Glutaminska kiselina se široko upotrebljava već duže vreme, u obliku natrijum glutamata kao hemijskog začina, ili u sličnim oblicima. Nedavno se pojavila preferencija ka upotrebi kultura ili ekstrakata ili sličnih oblika, koji se dobijaju gajenjem, u kulturi, kvasca koji sadrži glutaminsku kiselinu, u hrani ili napicima.

Na primer, PTL (patentna literatura 1) opisuje sredstvo za unapređenje slasti koje sadrži ekstrakt kvasca kao aktivni sastojak, gde navedeni ekstrakt kvasca sadrži natrijum 5’-inozat i(li) natrijum 5’-adenilat, natrijum-5’-guanilat, natrijum-5’-uridilat i natrijum 5’-citidilat u koncentraciji od 1% do 15%, redom, kao i natrijum glutamat u koncentraciji od 1% do 20%.

PTL 2 opisuje postupak za proizvodnju ekstrakta kvasca koji sadrži najmanje 3% intraćelijske slobodne glutaminske kiseline, u odnosu na suvi ostatak ekstrakta, a koji podrazumeva korak digestije kvasca koji sadrži 15 mg ili više slobodnog glutamina na 1g suve biomase.

PTL 3 opisuje ekstrakt kvasca koji se dobija digestijom ili razlaganjem kvasca, u kojem se ekstrakt kvasca propušta kroz filter membranu sa prečnikom 1 µm i dobijena tečnost se podvrgava gel filtraciji, a kada se u frakcionisanom eluatu detektuju peptidi, pomoću apsorpcione spektrofotometrije na 220 nm, udeo peptida koji imaju molekulsku masu 10,000 ili višu je 10% ili više u odnosu na ukupnu količinu detektovanih peptida.

PTL 4 opisuje ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline, koji sadrži 13% ili više, u masenim procentima, L-glutaminske kiseline (u obliku Na soli).

PTL 5 opisuje ekstrakt kvasca u kome je sadržaj slobodnih aminokiselina 25% u masenim procentima ili više, a ukupan sadržaj organoleptičkih komponenti na bazi nukleinskih kiselina je 2%, ili više, u masenim procentima.

PTL6 opisuje začinski preparat koji sadrži supstance za unapređenje ukusa na bazi nukleinskih kiselina, glutaminskih kiselina, kalijuma i mlečne kiseline, natrijum laktata ili kalijum laktata, u kome je molarni odnos supstanci za unapređenje ukusa na bazi nukleinskih kiselina i glutaminske kiseline u opsegu od 1:2 do 40, a molarni odnos (supstance za unapređenje ukusa na bazi nukleinskih kiselina glutaminska kiselina) : kalijum : (mlečna kiselina, natrijum laktat ili kalijum laktat) u opsegu od 1 : 5 do 80 : 10 do 80.

PTL 7 opisuje kvasac koji je otporan na inhibitor rasta koji je antagonist glutaminskke kiseline i koji u biomasi akumulira glutaminsku kiselinu.

PTL 8 opisuje postupak za proizvodnju ekstrakta kvasca, koji koristi Yarrowia lipolytica, kvasac koji je rezistentan na nistatin, lek koji ometa strukturu i funkciju ćelijske membrane, i koji ima kapacitet da akumulira 530 mg/l ili više L-glutaminske kiseline u biomasi.

JP 09-047295 A opisuje gajenje, u kulturi, kvasca koji je transformisan tako da eksprimira heterologi protein. Međutim, ova publikacija ne opisuje postupak za dobijanje kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline iz dva koraka.

JP 09-276843 A opisuje postupak za prečišćavanje organskog zagađivača pomoću bakterija, koji podrazumeva smanjenje brzine razmnožavanja bakterija u toku logaritamske faze rasta. Međutim, ova publikacija ne opisuje postupak za gajenje, u kulturi, kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline, u dva koraka.

WO 1998/035049 opisuje gajenje, u kulturi, kvasca koji je transformisan tako da eksprimira protein disulfid izomerazu iz kvasca (PDI), u uslovima pH u opsegu od 6,5 do 8,0. Međutim, ova publikacija ne pominje postupak za gajenje kvasca u kulturi, u dva koraka, za potrebe za koje je namenjen predmetni pronalazak.

JP 09-313169 A opisuje postupak za proizvodnju L-glutaminske kiseline gajenjem, u kulturi, kvasca koji je rezistentan na nistatin, u uslovima kada se pH kreće u opsegu od 3,0 do 8,0. Kvasac koji se gaji u takvoj kulturi je modifikovan u odnosu na kvasac koji se javlja u prirodi, a nije opisan za potrebe postupka gajenja kvasca u kulturi u dva koraka, kao što je opisano u predmetnoj prijavi.

Literatura iz stanja tehnike

Patentna literatura

[PTL 1]: Japanski patent br.3088709

[PTL 2]: JP-A br.2002-171961

[PTL 3]: JP-A br.2005-102549

[PTL 4]: JP-A br.2006-129835

[PTL 5]: JP-A br.2007-49989

[PTL 6]: JP-A br. H05-227911

[PTL 7]: JP-A br. H09-294581

[PTL 8]: Japanski patent br.3896606

Kratak opis pronalaska

Tehnički problem

Međutim, stanje tehnike često pati od nedostataka kao što su kompleksnost operacija, kao što je potreba za tretman za razlaganje uključujući i kiselo-hidrolitički tretman (HVP tretman). Dalje, sadržaj slobodne glutaminske kiseline ekstrakata kvasca koji su u ovom trenutku komercijalno dostupni obično je oko 10%, tako da postoji potreba za postupkom proizvodnje ekstrakta kvasca sa većom koncentracijom glutaminske kiseline.

PTL 1 opisuje ekstrakt kvasca koji sadrži natrijum glutamat u koncentraciji od 1% do 20%. Međutim, ekstrakt kvasca kao komercijalni proizvod sadrži natrijum glutamat u koncentraciji od 5,0%, koji se praktično koristi, i ne postoji opis proizvoda koji je ekstrakt kvasca a koji sadrži 5,0% ili više natrijum glutamata.

PTL 2 pati od kompleksnosti operacija, usled toga što se izvršava manipulacija gena, kao i od loših karakteristika bezbednosti, organoleptičkog kvaliteta i sličnih, kada je reč o hrani.

PTL 3 opisuje koji sadrži 10% ili više natrijum glutamata (sode) u suvoj masi, ali ne objavljuje radne primere koji to specifično pokazuju.

PTL 4 podrazumeva kompleksne operacije, kao što je enzimski tretman.

PTL5 podrazumeva kompleksne operacije kao što je upotreba enzima, a dodatni nedostatak je da je sadržaj glutaminske kiseline u suvom prahu tek oko 13%.

PTL 6 podazumeva prosto dodavanje glutaminske kiseline spolja.

PTL 7 pati od niskog sadržaja glutaminske kiseline u odnosu na masu suve biomase. PTL 8 podrazumeva kompleksne operacije kao što je prenošenje osobine rezistencije na lek na roditeljski soj.

Predmetni pronalazak je realizovan imajući u vidu opisanu situaciju, a cilj predmetnog pronalaska je da se obezbedi postupak za dobijanje kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline, koji sadrži veću koncentraciju glutaminske kiseline, posebno slobodne glutaminske kiseline, u poređenju sa stanjem tehnike. Takođe je opisan kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline, ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline i hrana i napici koji sadrže glutaminsku kiselinu.

Rešenje problema

Kao rezultat intenzivnog proučavanja usmerenog ka postizanju navedenog cilja, pronalazači predmetnog pronalaska su otkrili da sadržaj glutaminske kiseline u kvascu, posebno sadržaj slobodne glutaminske kiseline u kvascu, raste sa porastom pH rastvora kulture na konkretnu pH vrednost (pomeranje ka alkalnim vrednostima) u toku stacionarne faze rasta kvasca. Uz to, pronalazači su otkrili da ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline može da se dobije pripremom ekstrakta kvasca upravo od ovog kvasca. Predmetni pronalazak je realizovan na osnovu ovih otkrića. U skladu sa tim, opisana su i rešenja koja slede u opisu predmetne prijave.

(1) Postupak za gajenje kvasca u kulturi, koji podrazumeva korak podvrgavanja kvasca, u stacionarnoj fazi rasta u tečnoj kulturi, uslovima u kojima je pH tečne podloge 7,5 ili viši, a niži od 11.

(2) Postupak za gajenje kvasca u kulturi u skladu sa tačkom (1), gde korak gajenja u tečnoj kulturi podrazumeva:

- korak podešavanja pH tečne podloge na vrednost od 7,5 ili višu, a nižu od 11, nakon što rast kvasca uđe u stacionarnu fazu; i

- korak daljeg gajenja datog kvaca u kulturi u istom opsegu pH vrednosti.

(3) Postupak gajenja kvasca u skladu sa tačkom (2), gde korak podešavanja pH vrednosti u tečnoj podlozi na 7,5 ili više, a manje od 11, jeste korak dodavanja alkalne supstance u tečnu podlogu.

(4) Postupak gajenja kvasca u kulturi u skladu sa tačkom (1), gde se, u koraku gajenja u tečnoj kulturi, deo kvasca iz kulture s vremena na vreme uzorkuje i u uzorku se određuje sadržaj slobodne glutaminske kiseline.

(5) Postupak gajenja kvasca u kulturi u skladu sa bilo kojom od tačaka (1) do (4), gde je navedeni kvasac Saccharomyces cerevisiae ili Candida utilis.

(6) Postupak za dobijanje kvasca koji podrazumeva korak uzorkovanja kvasca gajenog u kulturi u skladu sa postupkom gajenja iz bilo koje od tačaka (1) do (5).

(7) Kvasac dobijen u postupku gajenja kvasca u kulturi iz bilo koje od tačaka (1) do (5) ili dobijen u postupku prizvodnje u skladu sa tačkom (6).

(8) Kvasac iz tačke (7), gde je sadržaj slobodne kiseline od 2,3% u masenim procentima do 10,0% u masenim procentima u odnosu na masu suve biomase kvasca.

(9) Kvasac iz tačke (8), gde je sadržaj slobodne glutaimnske kiseline od 4,0% u masenim procentima, do 10,0% u masenim procentima, u odnosu na suvu biomasu kvasca.

(10) Ekstrakt kvasca dobijen ekstrakcijom kvasca iz tačke (7).

(11) Ekstrakt kvasca iz tačke (10), gde je sadržaj slobodne glutaminske kiseline u ekstraktu kvasca od 7% u masenim procentima do 35% u masenim procentima u odnosu na suvu masu.

(12) Ekstrakt kvasca iz tačke (11), gde je sadržaj slobodne glutaminske kiseline u ekstraktu kvasca od 20% u masenim procentima do 35% u masenim procentima u odnosu na suvu masu.

(13) Ekstrakt kvasca sa sadržajem slobodne glutaminske kiseline 20% u masenim procentima do 35% u masenim procentima u odnosu na suvu masu.

(14) Kvasac sa sadržajem slobodne glutaminske kiseline 4,0% u masenim procentima do 10,0% u masenim procentima u odnosu na suvu biomasu kvasca.

(15) Začinski preparat koji sadrži kvasac u skladu sa bilo kojom od tačaka (10) do (13). (16) Hrana ili napitak koji sadrži kvasac u skladu sa bilo kojom od tačaka (7) do (9) i (14), ekstrakt kvasca u skladu sa bilo kojom od tačaka (10) do (13), ili začinski preparat u skladu sa tačkom (15).

Korisni efekti predmetnog pronalaska

Pomoću postupka za proizvodnju kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline u skladu sa predmetnim opisom, kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline u kome je sadržaj glutaminske kiseline, posebno sadržaj slobodne glutaminske kiseline, značajno uvećan, može lako da se dobije jednostavnim prilagođavanjem pH vrednosti tečne podloge za kvasac u stacionarnoj fazi rasta ka baznim vrednostima. Predmetni pronalazak stoga se odnosi na postupak za uvećanje proizvodnje glutaminske kiseline u kvascu, kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3.

U skladu sa još jednim rešenjem predmetne prijave, primenom operacije ekstrakcije na kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline u skladu sa predmetnom prijavom, može da se dobije ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline koji sadrži glutaminsku kiselinu, a posebno slobodnu glutaminsku kiselinu, u visokoj koncentraciji.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za dobijanje kvasca, koji podrazumeva korak uzorkovanja kvasca gajenog u kulturi u skladu sa postupkom gajenja u kulturi iz predmetnog pronalaska, kao što je definisano u patentnom zahtevu 4.

Kratak opis crteža

Slika 1 predstavlja krivu koja pokazuje povećanje broja ćelija u zavisnosti od vremena gajenja u kulturi iz Primera 2.

Slika 2 predstavlja krivu koja pokazuje povećanje suve biomase kvasca u zavisnosti od vremena gajenja u kulturi u primeru 2.

Slika 3 prikazuje promenu u pH tečne podloge u zavisnosti od vremena gajenja u kulturi u primeru 2.

Opis rešenja predmetnog pronalaska

Postupak za gajenje kvasca u skladu sa predmetnom prijavom podrazumeva korak podvrgavanja kvasca u stacionarnoj fazi rasta dejstvu tečne podloge za gajenje u kulturi pod uslovima u kojima je pH date tečne podloge 7,5 ili viši, a niži od 11. Primenom ovog postupka gajenja u kulturi, moguće je dobiti kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline.

U tekstu koji sledi biće detaljno opisana rešenja predmetnog pronalaska.

Kvasac iz predmetne prijave je bilo koji kvasac, sve dok je reč o jednoćelijskoj gljivici. Konkretni primeri kvasaca obuhvataju gljivice koje pripadaju rodu Saccharomyces, gljivice koje pripadaju rodu Shizosaccharomyces, gljivice koje pripadaju rodu Pichia, gljivice koje pripadaju rodu Candida, gljivice koje pripadaju rodu Kluyveromyces, gljivice koje pripadaju rodu Williopsis, gljivice koje pripadaju rodu Debaryomyces, gljivice koje pripadaju rodu Galactomyces, gljivice koje pripadaju rodu Torulaspora, gljivice koje pripadaju rodu Rhodotorula, gljivice koje pripadaju rodu Yarrowia i gljivice koje pripadaju rodu Zygosaccharomyces.

Među ovima, sa stanovišta jestivosti, poželjne su Candida tropicalis, Candida lipolytica, Candida utilis, Candida sake, Saccharomyces cerevisiae a obično se koriste i još su poželjniji Saccharomyces cerevisiae ili Candida utilis.

U praktičnoj primeni, kvasac se gaji u kulturi do stacionarne faze, u tečnoj podlozi koja sadrži izvor ugljenika, izvor azota, neorgansku so i slične, nakon čega se kvasac podvrgava gajenju u kulturi u tečnom stanju pod uslovima u kojima je pH tečne podloge za gajenje kvasca u stacionarnoj fazi rasta 7,5 ili više, a manji od 11.

Sastav pogloge za ove sojeve gljivica nije posebno ograničen i može da podrazumeva sastav podloge koji se koristi u uobičajenim postupcima. Na primer, kao izvor ugljenika koriste se jedan, ili dva ili veći broj izvora izabranih iz grupe koja se sastoji od glukoze, saharoze, sirćetne kiseline, etanola, melase, otpadne tečnosti i pulpe iz dobijanja sumporne kiseline i sličnih izvoda koji se koriste u uobičajenim postupcima gajenja mikroorganizama. Kao izvor azota koriste se jedan ili dva ili više izvora izabranih iz grupe koja se sastoji od neorganskih soli kao što su urea, amonijak, amonijum sulfat, amonijum hlorid, ili amonijum fosfat i supstanci koje sadrže azot, kao što su tečnost dobijena fermentacijom kukuruza (corn steep liquor, CSL), kazein, ekstrakt kvasca ili pepton. Uz to, u podlogu mogu da se dodaju komponenta fosforne kiseline, kalijumska komponenta ili magnezijumska komponenta. Za ove namene, koriste se uobičajene industrijske sirovine kao što su kalcijum superfosfat, amonijum fosfat, kalijum hlorid, kalijum hidroksid, magnezijum sulfat ili magnezijum hlorid. Dalje, može da se koristi i neorganska so, kao što su joni cinka, bakra, mangana ili gvožđa. Uz to, mogu da se dodaju vitamini, supsance koje se dovode u vezu sa nukleinskim kiselina i slično.

Način gajenja može da bude bilo koji način izabran iz grupe koja se sastoji od gajenja u baču, kulture sa stalnim dodavanjem podloge i kontinualne kulture. Međutim, sa industrijskog stanovišta usvajaju se gajenje u kulturi sa stalnim dodatkom podloge i kontinualno gajenje.

Uslovi gajenja u kulturi u fazi logaritamskog rasta ili gajenja u kulturi pre podešavanja pH mogu da budu u skladu sa uobičajenim uslovima za gajenje kvasca u kulturi. Na primer, temperatura je u opsegu od 20°C do 40°C, poželjno je da to bude od 25°C do 35°C, a pH je u opsegu od 3,5 do 7,5, posebno je poželjno da to bude 4,0 do 6,0. Uz to, poželjni su aerobni uslovi.

Dalje, poželjno je da se kultura gaji uz mešanje i aeraciju. Zapremina za aeraciju i parametri mešanja mogu da se odrede na pogodan način, uzimajući u obzir zapreminu kulture i vreme, kao i početnu koncentraciju gljivica. Na primer, aeracija može da se primenjuje u opsegu od oko 0,2 VVM do 2 VVM (volume per volume per minutes, zapremina prema zapremini u minutu), a mešanje može da podrazumeva opseg od oko 50 rpm do 800 rpm.

Prema konkretnim rešenjima, postupak za gajenje tečne kulture kvasca u stacionarnoj fazi rasta pod uslovima u kojima je pH tečne podloge 7,5 ili viši, a niži od 11, nije posebno ograničen. Primeri postupaka podešavanja pH vrednosti obuhvataju postupak podešavanja pH tečne podloge na 7,5 ili više a manje od 11, kada kvasac uđe u stacionarnu fazu rasta, postupak podešavanja pH dodavanjem alkalne supstance u tečnu podlogu, kao i postupak podvrgavanja tečne podloge pomeranju pH vrednosti dodavanjem uree ili slične supstance u podlogu unapred, tako da pH prirodno dođe do vrednosti od 7,5 ill više, a niže od 11, sa protokom vremena gajenja kulture.

Količina bazne supstance koja se dodaje u podlogu nije ograničena, sve dok je pH u gorenavedenom opsegu. Sa stanovišta izbegavanja preteranog razblaživanja podloge, te izbegavanja nepoželjnih dejstava na proizvodnju glutaminske kiseline tokom kasnijeg gajenja u kulturi, poželjno je da količina bazne supstance bude 5% ili manje, u odnosu na količinu podloge. Na primer, količina uree kao bazne supstance nije posebno ograničena i zavisi od koncentracije biomase kvasca koji se gaji, ali je poželjno da se kreće u opsegu od oko 0,5% do 5% u odnosu na podlogu.

Postupak podešavanja pH tečne podloge na vrednost od 7,5 ili veću, a manju od 11, kada kvasac gajen u kulturi dostigne stacionarnu fazu rasta, nije posebno ograničen. Na primer, pogodno je da se bazna supstanca dodaje tako da se pH tečne podloge podesi na 7,5 ili više, a na manje od 11, a poželjno je da to bude na vrednost od 7,5 ili veću, a manju od 10.

pH može da se podesi u bilo kom trenutku, sve dok je kvasac u stacionarnoj fazi, ali je poželjno da se to izvede neposredno nakon što kvasac uđe u stacionarnu fazu. To je stoga što koncentracija slobodne glutaminske kiseline u kvascu može dovoljno da se poveća, a vreme za sprovođenje sveukupnog procesa može da se skrati. Ako se pH tečne podloge za kvasac u logaritamskoj fazi rasta podesi na 7,5 ili više a na manje od 11, rast kvasca se inhibira a koncentracija slobodne glutaminske kiseline se ne povećava, dakle, takav postupak nije poželjan.

Dalje, kada kvasac koji se gaji u kulturi prelazi u stacionarnu fazu rasta iz logaritamske faze rasta, kvasac se polako prebacuje iz logaritamske u stacionarnu fazu, da bi potom u potpunosti prešao u stacionarnu fazu, ali je, za potrebe predmetnog pronalaska, vreme postepenog približavanja potpunom prelasku u stacionarnu fazu iz logaritamske faze rasta takođe uključeno u stacionarnu fazu rasta.

Alkalna supstanca nije posebno ograničena, a primeri takvih supstanci obuhvataju sledeće komponente.

One obuhvataju neorganske baze kao što su NH4OH (amonijak, vodeni rastvor), gasoviti amonijak, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, kalcijum hidroksid ili magnezijum hidroksid, alkalnu bazu kao što su natrijum karbonat ili kalijum karbonat, organsku so kao što je urea i slične.

Među njima, poželjni su vodeni rastvor amonijaka, gasoviti amonijak ili urea.

Kada se kvasac u stacionarnoj fazi rasta gaji u kulturi u tečnoj podlozi sa pH 7,5 ili većim, a manjim od 11, temperatura i drugi uslovi mogu da prate uobičajene uslove za gajenje kvasaca u kulturi. Prema predmetnom pronalasku, temperatura je u opsegu od 20°C do 40°C, poželjno je da to bude 25°C do 35°C. Poželjno je da vreme gajenja u kulturi bude od neposredno nakon podešavanja pH vrednosti do 24 časa, poželjnije je da to bude od 1 do 15 časova, još poželjnije je da to bude 3 časa do 12 časova, a posebno je poželjno da to bude 3 časa do 6 časova.

Sadržaj slobodne glutaminske kiseline u kvascu nakon prelaska pH na vrednost od 7,5 ili višu, a manju od 11, pokazuje tendenciju rasta sa vremenom gajenja u kulturi, a nakon dostizanja maksimuma, tendenciju opadanja. Uz to, sadržaj glutaminske kiseline u kvascu zavisi od uslova kao što su koncentracija biomase kvasca koji se gaji, pH i temperatura. Smatra se da je to usled činjenice da preterano dugo gajenje u kulturi u alkalnim uslovima dovodi do preteranog dejstva alkalne supstance na kvasac. Stoga je predmetni pronalazak osmišljen tako

1

da se jedan deo kvasca koji se gaji u kulturi uzima kao uzorak nakon promene pH, pa se određuje sadržaj slobodne glutaminske kiseline u kvascu s vremena na vreme, poželjno je da to bude u regularnim vremenskim intervalima, iako optimalno vreme gajenja u kulturi može da se odabere za svaki set uslova gajenja, posebno za svaki pH nakon promene pH ka alkalnim vrednostima.

Drugim rečima, potvrđeno je da kvasac sa veoma visokim sadržajem slobodne glutaminske kiseline, tj. sa sadržajem slobodne glutaminske kiseline od 2,3% u masenim procentima do 10,0% u masenim procentima, u odnosu na suvu biomasu kvasca, može da se dobije dostizanjem maksimuma kulture a potom izolovanjem kvasca. Kada se kultura gaji i proizvodi pod poželjnijim uslovima, može da se dobije kvasac čiji sadržaj slobodne glutaminske kiseline se kreće u opsegu od 4,0% u masenim procentima do 10,0% u masenim procentima, u odnosu na masu suve biomase kvasca. Uz to, potvrđeno je da je moguće dobiti ekstrakt kvasca sa veoma visokim sadržajem glutaminske kiseline, do razmera koje nisu bile objavljene u stanju tehnike, tj. sadržajem slobodne glutaminske kiseline od 20% u masenim procentima do 35% u masenim procentima, upotrebom kvasca koji je dostigao maksimum.

Kao što je prethodno opisano, u skladu sa postupkom proizvodnje koji je opisan u predmetnoj prijavi, moguće je gajenje kvasca sa visokim sadržajem slobodne glutaminske kiseline u kulturi, a kvasac sa veoma visokim sadržajem slobodne glutaminske kiseline može da se dobije adekvatnim izolovanjem iz takve kulture. Stoga, iz dobijenog kvasca može da se dobije ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem slobodne glutaminske kiseline. Dalje, podrazumeva se da je dobijeni kvasac, kao i ekstrakt kvasca, bogat ukupnom glutaminskom kiselinom, kao i slobodnom glutaminskom kiselinom.

Na primer, PTL 1 i slični opisuju ekstrakt kvasca koji sadrži 20%, u masenim procentima, glutaminske kiseline u obliku natrijum glutamata (molekulska masa od oko 169), što odgovara sadržaju koji nije veći od 17% u masenim procentima u odnosu na sadržaj same glutaminske kiseline (molekulska masa od oko 147). Takođe je očigledno da je kvasac dobijen postupkom proizvodnje koji je ovde opisan i(li) u skladu sa predmetnim pronalaskom kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline koji nije bio objavljen u stanju tehnike.

U predmetnoj prijavi, izraz “sadržaj slobodne glutaminske kiseline u odnosu na suvu biomasu kvasca” označava udeo (u masenim %) slobodne glutaminske kiseline sadržane u suvoj masi koja se dobija sušenjem biomase kvasca. Uz to, izraz “sadržaj slobodne glutaminske kiseline u suvoj masi ekstrakta kvasca” označava udeo (u masenim procentima) slobodne glutaminske kiseline sadržan u suvoj masi koja se dobija sušenjem ekstrakta kvasca.

Sadržaj slobodne glutaminske kiseline u biomasi kvasca ili u ekstraktu kvasca meri se, na primer, pomoću biosenzora BF-5 proizvođača Oji Scientific Instruments. Ovaj aparat je aparat koji kvantitativno određuje glutaminsku kiselinu u rastvoru, pomoću enzimske elektrode koja specifično reaguje na glutaminsku kiselinu, a ta konkretna enzimska elektroda ne reaguje na glutaminsku kiselinu unutar proteina ili peptida. Stoga je moguće selektivno kvantitativno odrediti samo sadržaj slobodne glutaminske kiseline primenom takvog aparata.

Uz to, sadržaj slobodne glutaminske kiseline može da se meri automatskim analizatorom aminokiselina JLC-500/V proizvođača JEOL Ltd., analizatorom Acquity UPLC proizvođača Waters Corporation (USA), ili sličnim aparatima, ali sam aparat kojim se izvodi ta analiza nije posebno ograničen.

Postupak prema predmetnoj prijavi i(li) pronalasku omogućava proizvodnju kvasca koji sadrži veliku količinu glutaminske kiseline, posebno slobodne glutaminske kiseline, u biomasi. Tako dobijeni kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline u skladu sa predmetnom prijavom može da sadrži 2,3%, u masenim procentima, ili više, poželjno je da to bude 2,3% u masenim procentima do 9,1% u masenim procentima, još poželjnije je da to bude 4,0% u masenim procentima do 9,1% u masenim procentima, u suvoj biomasi kvasca. Na primer, može da se dobije kvasac koji sadrži 2,3% u masenim procentima do 7,4% u masenim procentima, poželjnije je da to bude 4,0% u masenim procentima do 7,4% u masenim procentima slobodne glutaminske kiseline u suvoj biomasi kvasca.

Stoga, ekstrakt kvasca koji sadrži veliku količinu slobodne glutaminske kiseline, komponentu sa poželjnim organoleptičkim profilom, može da se dobije na pogodan način ekstrakcijom i pripremom ekstrakta kvasca iz kvasca.

Kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline koji se dobija primenom postupka prema predmetnoj prijavi i(li) predmetnom pronalasku sadrži veliku količinu slobodne amonikiseline, ali i veliku količinu slobodne glutaminske kiseline. Na primer, ekstrakt kvasca koji sadrži više od 7%, u masenim procentima ili više, poželjno je da to bude 7% u masenim procentima do 35% u masenim procentima, još poželjnije je da to bude 12% u masenim procentima do 35% u masenim procentima, a čak još poželjnije je da to bude 20% u masenim procentima do 35% u masenim procentima, slobodne glutaminske kiseline dobijene iz biomase kvasca, u odnosu na masu suvog ekstrakta kvasca može da se dobije pripremom ekstrakta kvasca pomoću kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline u skladu sa predmetnom prijavom. Na primer, takođe može da se dobije ekstrakt kvasca koji sadrži 7% u masenim procentima do 30% u masenim procentima, još poželjnije je da to bude 12% u masenim procentima do 30% u masenim procentima, a čak još poželjnije je da to bude 20% u masenim procentima do 30% u masenim procentima, slobodne glutaminske kiseline. Dalje, takođe može da se dobije ekstrakt kvasca koji sadrži više od 30% u masenim procentima i 35% u masenim procentima ili manje slobodne glutaminske kiseline.

Shodno tome, ekstrakt kvasca dobijen u skladu sa predmetnom prijavom pokazuje veoma povoljna organoleptička svojstva (za poboljšavanje ukusa) i omogućava, primenom ovakvih proizvoda na hranu ili napitke, dobijanje hrane ili napitka sa dubokom, raskošnom aromom.

Dalje, predmetni pronalazak omogućava dobijanje kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline pomoću jednostavnog procesa izvođenja promene pH tečne podloge ka alkalnim vrednostima. Dalje, kao što je prethodno opisano, podloga koja se koristi nije nužno neka posebna podloga i može da se pripremi od jeftinih sirovina kao što je amonijak.

U dosadašnjoj uobičajenoj praksi, sadržaj slobodne glutaminske kiseline u kvascu povećavan je pomoću rekombinantnih ili mutantnih sojeva, uglavnom modifikacijom gena (videti PTL 2, 7, 8 i slične). S druge strane, u skladu sa postupkom prema predmetnoj prijavi i(li) predmetnom pronalasku, gajenje kvasca u kulturi u stacionarnoj fazi rasta pod alkalnim uslovima može da poveća sadržaj slobodne glutaminske kiseline u kvascu, bez modifikacije gena. Dakle, predmetni pronalazak podrazumeva postupak koji je u stanju da unapredi sadržaj slobodne glutaminske kiseline u kvascu bez genetskih modifikacija puteva metabolizma glutaminske kiseline i njene akumulacije, koji su svojstveni za kvasac. Stoga, primena postupaka prema predmetnoj prijavi i(li) predmetnom pronalasku može značajno da poveća sadržaj slobodne glutaminske kiseline u kvascu koji se javlja u prirodi, bez sprovođenja tretmana modifikacijom gena koji može da dovede do pogoršanja organoleptičkih karakteristika hrane ili napitaka. Dalje, podrazumeva se da kvasac obezbeđen pomoću postupka prema predmetnoj prijavi i(li) predmetnom pronalasku može da bude kvasac koji se javlja u prirodi (kvasac koji nije podvrgut tretmanu genetske modifikacije) ili mutantni soj.

Iako se kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline koji sadrži visoku koncentraciju glutaminske kiseline u biomasi kvasca dobija u skladu sa postupkom koji je opisan u predmetnoj prijavi, frakcija koja sadrži glutaminsku kiselinu može da se dobije iz kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline.

Izdvajanje frakcije koja sadrži glutaminsku kiselinu iz kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline može da se izvede bilo kojim postupkom, sve dok je to postupak koji je u uobičajenoj upotrebi.

Dalje, ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline može da se dobije iz kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline koji se gaji u skladu sa prethodno opisanim

1

postupkom. Priprema ekstrakta kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline može da se izvede bilo kojim postupkom, sve dok je to postupak koji je u uobičajenoj upotrebi. Na primer, mogu da se primene postupak autodigestije, postupak enzimskog razlaganja, postupak kiselog razlaganja, postupak baznog razlaganja, postupak ekstrakcije toplom vodom ili slični. Dalje, uopšteno posmatrano, smatra se da je skoro celokupna količina glutaminske kiseline u ekstraktu kvasca dobijenom samo postupkom ekstrakcije toplom vodom slobodna glutaminska kiselina, za razliku od ekstrakta kvasca koji se dobija postupcima koji podrazumevaju enzimske reakcije, kao što je postupak autodigestije.

Kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline u skladu sa predmetnom prijavom bogat je slobodnom glutaminskom kiselinom te se stoga ekstrakcijom samo toplom vodom dobija ekstrakt kvasca sa povoljnim organoleptičkim svojstvima.

U uobičajenoj dosadašnjoj praksi, za potrebe unapređenja sadržaja organoleptički aktivnih aminokiselina kao što je slobodna glutaminska kiselina obično se izvodio hidrolitički tretman pomoću kiseline ili baze, ili sličan tretman, sa biljnim ili životinjskim proteinima. Međutim, proteinski hidrolizat je problematičan usled inkroporacije monohlorpropanola (MCP) za koje se sumnja da su karcinogeni.

S druge strane, budući da kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline dobijen pomoću postupka prema predmetnoj prijavi i(li) predmetnom pronalasku sam po sebi sadrži velike količine slobodne glutaminske kiseline, ekstrakt kvasca sa dovoljno visokim sadržajem slobodne glutaminske kiseline može da se dobije čak i bez izvođenja tretmana razlaganja kiselinom ili bazom, ili sličnog tretmana razlaganja, ili enzimskog tretmana nakon ekstrakcije kvasca postupkom ekstrakcije toplom vodom, ili sličnim postupkom. Dakle, upotrebom kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline, u skladu sa predmetnom prijavom, moguće je na jednostavan način pripremiti ekstrakt kvasca koji je odličan i po ukusu i po bezbednosnom profilu.

Dalje, ekstrakt kvasca u prahu sa visokim sadržajem glutaminske kiseline može da se dobije sprašivanjem ekstrakta kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline u skladu sa predmetnom prijavom, a ekstrakt kvasca koji sadrži 7%, u masenim procentima, do 35% u masenim procentima slobodne glutaminske kiseline može da se dobije prikladnim odabirom gljivice kvasca.

Dalje, suva biomasa kvasca može da se dobije iz kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline koji se gaji u skladu sa prethodno opisanim postupkom. Priprema suve biomase kvasca može da se izvede bilo kojim postupkom, sve dok je to postupak koji je u uobičajenoj upotrebi. Sa industrijskog stanovišta, moguće je primeniti postupak liofilizacije, postupak sušenja prskanjem, postupak sušenja u dobošu i slične postupke.

Dalje, ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline, suva biomasa kvasca, ekstrakt kvasca dobijen iz kvasca ili ekstrakt kvasca u prahu u skladu sa predmetnom prijavom mogu da se formulišu u začinski preparat. Dalje, začinski preparat može da bude sačinjen samo od ekstrakta kvasca ili sličnog sastojka u skladu sa predmetnom prijavom, ili može da sadrži i druge sastojke, kao što su stabilizatori i konzervansi, uz ekstrakt kvasca ili sličan proizvod u skladu sa predmetnom prijavom. Začinski preparat može lako da se koristi u različitim vrstama hrane ili napitaka, slično drugim začinskim preparatima.

Dalje, opisan je kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline dobijen prethodno opisanim postupkom, kao i hrana ili napitak koji sadrže ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline estrahovan iz kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline. Uvršćavanjem kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline ili sličnog proizvoda, moguće je efikasno dobiti hranu ili napitak koji sadrži visoku koncentraciju glutaminske kiseline.

Takva hrana ili napitak mogu da budu bilo koji hrana ili napitak, sve dok je reč o hrani ili napitku u koji može da se doda tipičan suvi kvasac, ekstrakt kvasca ili začinski preparat koji ih sadrži.

Primeri obuhvataju alkoholna pića, hladne napitke, fermentisanu hranu, začine, supe, hleb i konditorske proizvode.

Kako bi se dobila hrana ili napitak u skladu sa predmetnom prijavom, u procesu proizvodnje hrane ili napitka može da se doda preparat dobijen iz kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline ili frakcija iz kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline. Uz to, sam kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline može se koristiti i kao sirovina, sam po sebi.

Primer 1

U daljem tekstu, predmetni pronalazak biće detaljnije opisan u skladu sa primerima koji slede.

Prema postupku koji je opisan u primerima 1 do 8 koji slede, kvasac (Saccharomyces cerevisiae soj AB9846) je gajen u kulturi, pa je izvedena ekstrakcija u cilju dobijanja ekstrakta kulture kvasca i analize glutaminske kiseline.

1

1. Pripremno (preliminarno) gajenje u kulturi

Pripremljene su dve podloge, svaka od njih sačinjena u sledećem sastavu, u zapremini od 350 ml (u erlenmajerima od 2 l sa odbojnicima).

(Sastav podloge)

Melasa: 8%

Urea: 0,6%

(NH4)2SO4: 0,16% (amonijum sulfat)

(NH4)2HPO4: 0,08% (diamonijum hidrogen fosfat)

(Postupak dobijanja)

(1) 167 ml melase (sadržaj šećera: 36%) pomešano je sa Milli-Q vodom tako da se dobije 750 ml, pa je količina od 350 ml/erlenmajeru odmerena u erlenmajere od 2 l sa odbojnicima.

(2) Smeša je tretirana u autoklavu (121<o>C, 15 minuta).

(3) Neposredno pri korišćenju podloge, u podlogu koja se sastoji samo od melase dodata je 1/50 zapremine (po 7 ml) tečne azotne komponente (x100) u aseptičnim uslovima.

(Uslovi gajenja u kulturi)

Temperatura: 30°C

Mućkanje: 160 rpm (rotaciono)

Vreme gajenja: 24 časa

(Inokulaciona zapremina: 300 ml)

2. Glavni korak gajenja u kulturi

Podloga sledećeg sastava pripremljena je u zapremini od 2000 ml (podešena da bude 3 l po završetku dodavanja).

(Sastav podloge)

0,18% amonium hlorid (u odnosu na 3 l, po završetku dodavanja): 5,3 g

0,04% (NH4)2HPO4(diamonijum hidrogen fosfat, po završetku dodavanja): 1,2 g

Nakon toga, kultura je gajena pod sledećim uslovima.

1

(Uslovi gajenja u kulturi)

Temperatura: 30°C

Aeracija: 3 l/min

Mešanje: 600 rpm

pH kontrola: kontrola minimalne vrednosti: pH 5,0 (pomoću 10% vodenog rastvora amonijaka), bez kontrole maksimalne vrednosti

Sredstvo protiv penušanja: štok rastvor ADEKANATE

Podloga za dodavanje: melasa (sadržaj šećera: 36%), zapremina: 800 ml (u boci za podlogu od 1 l, konačna koncentracija 8%)

3. Promena pH vrednosti

Potom, neposredno nakon što je kultura kvasca ušla u stacionarnu fazu rasta, pH kulture je podešen na alkalni opseg dodatkom vodenog rastvora NH4OH (10%) (u daljem tekstu: podešavanje pH vrednosti) (podešena na pH od 7 do 11), nakon čega je kvasac još neko kratko vreme gajen u kulturi. Gajenje kvasca u kulturi završeno je 24 časa nakon što je počeo glavni korak gajenja u kulturi.

4. Postupak izolovanja kvasca

(1) Rastvor kulture dobijen u glavnom koraku gajenja kvasca u kulturi prebačen je u 50 ml plastičnu kivetu za centrifugiranje (FALCON 2070), nakon čega je usledilo centrifugiranje (3.000 g, 20°C, 5 min, HP-26).

(2) Supernatant je odbačen a pelet je suspendovan u 20 ml Milli-Q vode, pa je usledilo centrifugiranje (3.000 g, 20°C, 5 min, HP-26). Ova procedura ponovljena je dva puta.

(3) Supernatant je odbačen a pelet je suspendovan u 20 ml Milli-Q vode.

5. Merenje mase suve biomase kvasca

2ml suspenzije kvasca odmereno je u prethodno odmeren aluminijumski sud (prečnik: 5 cm), pa je usledilo sušenje na 105°C 4 časa.

Izmerena je masa posle sušenja pa je masa čvrste supstance (masa suve biomase, jedinica g/l) izračunata prema sledećoj jedinačini (1).

Masa nakon sušenja kvasca – masa aluminijumskog suda = masa suve biomase kvasca (1)

1

6. Dobijanje rastvora ekstrakta postupkom ekstrakcije toplom vodom

(1) Preostala suspenzija kvasca (oko 18 ml) je centrifugirana (3.000 g, 20°C, 5 min, HP-26).

(2) 1,5 ml preostale suspenzije odmeren je u ependorf kivetu koja je potom prebačena u grejalicu, gde je grejana na 80°C 30 minuta (kako bi se dobio ekstrakt). Alternativno, kiveta sa suspenzijom može da se zagreva na vodenom kupatilu na 100°C 10 minuta (kako bi se dobio ekstrakt).

(3) Potom je supernatant (ekstrakt) razdvojen centrifugiranjem (6.000 g, 4°C, 5 minuta).

7. Postupak merenja sadržaja slobodne glutaminske kiseline

Slobodna glutaminska kiselina u 300 ml rastvora ekstrakta određena je kvantitativno pomoću biosenzora. U skladu sa postupkom merenja pomoću biosenzora, moguće je selektivno kvantitativno odrediti samo slobodnu glutaminsku kiselinu u rastvoru ekstrakta. Konkretnije, merenje je izvršeno sa razblaženjem rastvora ekstrakta (razblaženje oko 5 puta) pomoću BF-5 proizvođača Oji Scientific Instruments, dok su za izradu kalibracione krive korišćeni standardni rastvori od 1 mM i 5 mM.

Rezultati dobijeni za promenu pH vrednosti na pH 7,00, 7,50, 8,00, 8,00 i 11,00 prikazani su u tabeli 1. Kada je reč o opsegu pH vrednosti od 8,00 do 9,00, u tabeli 2 prikazani su rezultati za inkremente promene pH vrednosti od 0,25. Kada je reč o opsegu pH vrednosti od 9,00 do 10,00, u tabeli 3 prikazani su rezultati za inkremente promene pH vrednosti od 0,25. Kao što se vidi iz podataka o broju ćelija i masi suve biomase kvasca koji su prikazani u tabeli 2, promena pH vrednosti izvedena je nakon što je kvasac ušao u stacionarnu fazu rasta.

Tabela 1

1

Tabela 2

Tabela 3

Kao što je prikazano u tabeli 1, potvrđeno je da sadržaj (%, u masenim procentima) slobodne glutaminske kiseline u suvoj biomasi kvasca raste od pH vrednosti na 7,5 ili većoj, a nižoj od 11,0, pre promene pH vrednosti i 6 časova nakon promene pH vrednosti. Konkretnije, na pH vrednosti od 9,0, sadržaj slobodne glutaminske kiseline porastao je dva puta ili više, od 2,2% u masenim procentima do 5,3% u masenim procentima, kao posledica promene pH vrednosti, čime je potvrđen značajan porast sadržaja slobodne glutaminske kiseline.

1

Konkretnije, kada je zadata pH vrednost (pH vrednost nakon promene pH) u opsegu od 8,0 do 9,0, potvrđeno je, kao što je prikazano u tabeli 2, da veća pH vrednost dovodi do većeg porasta sadržaja (%, u masenim procentima) slobodne glutaminske kiseline u suvoj biomasi kvasca, kao posledica promene pH vrednosti.

S druge strane, kao što je prikazano u tabeli 3, kada je pH u opsegu od 9,00 do 10,00, potvrđeno je da je porast sadržaja (%, u masenim procentima) slobodne glutaminske kiseline u suvoj biomasi kvasca, koji je posledica promene pH vrednosti, značajniji što je niža zadata pH vrednost. Konkretnije, na zadatoj pH vrednosti od 9,00, sadržaj glutaminske kiseline porastao je sa 2,3% u masenim procentima na 5,7% u masenim procentima, kao posledica promene pH vrednosti. Uz to, iako to nije prikazano u tabeli, na zadatoj pH vrednosti od 9,00, sadržaj slobodne glutaminske kiseline u suvoj biomasi kvasca bio je 4,6% u masenim procentima, 3 časa nakon promene pH vrednosti.

Uz to, među ovim kulturama kvasca, potvrđeno je da ekstrakt kvasca dobijen pomoću kvasca koji je podvrgnut promeni pH vrednosti na zadatu vrednost između pH 7,5 i pH 11,0 pokazuje porast sadržaja (% u masenim procentima) glutaminske kiseline u suvoj masi, u poređenju sa ekstraktom kvasca dobijenim pre podvrgavanja kulture promeni pH vrednosti, te je ekstrakt kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline dobijen pripremom ekstrakta kvasca iz kvasca dobijenog postupkom koji je ovde opisan. Na primer, kada je reč o kvascu dobijenom na zadatoj vrednosti pH kulture od 9,00 kao što je prikazano u tabeli 1, u ekstraktu kvasca dobijenom iz kvasca pre podvrgavanja kulture promeni pH vrednosti, sadržaj glutaminske kiseline u suvoj masi bio je 22,4% u masenim procentima u ekstraktu kvasca dobijenom 6 časova nakon promene pH vrednosti. Uz to, kada je reč o kvascu dobijenom na istoj zadatoj vrednosti pH kulture od 9,00 (videti tabelu 3), sadržaj glutaminske kiseline u odnosu na suvu masu bio je 19,4% u masenim procentima u ekstraktu kvasca dobijenom iz kvasca koji je gajen 3 h nakon promene pH vrednosti kulture, dok je sadržaj glutaminske kiseline u suvoj masi bio 25,5% u masenim procentima u ekstraktu kvasca dobijenom gajenjem kulture još 6 časova nakon promene pH vrednosti. Uz to, kada je reč o kvascu dobijenom na zadatoj vrednosti pH kulture od 9,25, sadržaj glutaminske kiseline u suvoj masi bio je 21,3% u masenim procentima u ekstraktu kvasca dobijenom 6 časova nakon promene pH vrednosti.

Iz rezultata koji su prikazani iznad, pokazano je da sadržaj glutaminske kiseline u kvascu raste sa podešavanjem pH vrednosti kulture na 7,5 ili više, ali na manje od 11, nakon ulaska u stacionarnu fazu rasta. Konkretnije, sadržaj glutaminske kiseline bio je visok 3 do 6 časova nakon podešavanja pH vrednosti.

2

Primer 2

Gajenje u preliminarnoj kulturi izvršeno je isto kao u koraku 1 primera 1, nakon čega je glavni korak gajenja u kulturi izveden pod sledećim uslovima.

Umesto da se promena pH vrednosti izvrši nakon ulaska kulture u stacionarnu fazu rasta, urea je prethodno dodata u podlogu za glavni korak gajenja u kulturi, tako da se pH vrednost spontano promenila, čime je dobijen kvasac sa visokim sadržajem glutaminske kiseline.

Prvo je pripremljena podloga sledećeg sastava u zapremini od 2000 ml (podešena da bude 3 l po završetku dodavanja).

(Sastav podloge)

0,18% amonium hlorid (u odnosu na 3 l, po završetku dodavanja): 5,3 g

0,04% (NH4)2HPO4(diamonijum hidrogen fosfat, po završetku dodavanja): 1,2 g 1% uree (u odnosu na 3 l, po završetku dodavanja): 30 g

Ostali uslovi bili su isti kao u primeru 1. Slika 1 prikazuje krivu porasta broja bakterijskih ćelija u zavisnosti od vremena gajenja u kulturi. Slika 2 prikazuje krivu porasta suve biomase kvasca u zavisnosti od vremena gajenja u kulturi. Slika 3 prikazuje promene u pH vrednosti kulture u zavisnosti od vremena gajenja u kulturi.

Kao što je prikazano na slici 1, porast broja ćelija (x 10<6>ćelija/ml) dostigao je stacionarnu vrednost nakon 18 časova gajenja u kulturi, što potvrđuje da je kultura ušla u stacionarnu fazu rasta. Uz to, masa suve biomase kvasca (g/l) dostigla je suštinski konstantnu vrednost nakon 24 časa gajenja u kulturi čime je potvrđeno da je kultura ušla u stacionarnu fazu rasta. Kada je meren pH vrednosti kulture, kao što je prikazano na slici 3, pH vrednost se promenila ka alkalnoj vrednosti (7,5 ili većoj, ali manjoj od 11) nakon što je kultura ušla u stacionarnu fazu rasta. Rezultati su dati u tabeli 4.

Tabela 4

Kao što je prikazano u tabeli 4, sadržaj glutaminske kiseline u suvoj biomasi kvasca dostigao je 7,4% u masenim procentima kada je pH vrednost kulture porasla, što odgovara porastu od 2,8 puta u poređenju sa sadržajem od 2,6% u masenim procentima pre porasta pH vrednosti.

Primer 3

Dobijanje ekstrakta iz rastvora kulture kvasca i analiza glutaminske kiseline izvršeni su na isti način kao u primeru 1, osim što su korak pripremnog gajenja u kulturi i glavni korak gajenja u kulturi izvedeni u skladu sa sledećim uslovima.

(Sastav podloge)

Rastvor za pripremno gajenje kulture: 150 ml supernatanta odmereno je iz rastvora za pripremno gajenje kulture dobijenog postupkom za pripremno gajenje kulture iz primera 1, pa je koncentrat, u kome je koncentracija kvasca povećana do 15% - 20% korišćena kao rastvor za preliminarno gajenje u kulturi.

Voda 2000 ml

H2SO4(97%): 1.33 ml

Melasa (sadržaj šećera: 36%): 6,7 ml

(NH4)2HPO4: 0,06%

(Uslovi gajenja u kulturi)

Temperatura: 32°C

pH: 0 časova do 15,5 časova: ne prilagođava se

Mešanje: 600 rpm.

Nakon toga, kultura je gajena pod sledećim uslovima.

Nakon 15,5 časova: pH vrednost je promenjena dodavanjem vodenog rastvora amonijaka.

Mešanje: 600 rpm.

Podloga za dodavanje: melasa (sadržaj šećera: 36%): 870 ml NH4OH (10%): 100 do 200 ml fosforna kiselina (85%): 5 do 20 (g)

Kvasac je gajen u kulturi, nakon čega je pH vrednost promenjena pomoću vodenog NH4OH nakon 15,5 časova, pa je gajenje u kulturi nastavljeno. Dobijeni rezultati su dati u tabeli 5.

Tabela 5

Kao što je prikazano u tabeli 5, potvrđeno je da sadržaj (%, u masenim procentima) slobodne glutaminske kiseline porastao u suvoj biomasi kvasca na pH vrednosti na 9,0, pre promene pH vrednosti i 6 časova nakon promene pH vrednosti. Sadržaj glutaminske kiseline koji je bio 9,0% u masenim procentima dao je sadržaj od oko 25% glutaminske kiseline u ekstraktu kvasca.

Sastav podloge bio je različit u odnosu na primer 1, pa je potvrđeno da je podloga bilo kog sastava u stanju da podrži porast sadržaja glutaminske kiseline na način koji je zavisan od pH vrednosti.

Primer 4

Dobijanje ekstrakta iz rastvora sa kulturom kvasca i analiza glutaminske kiseline izvedeni su na isti način kao u primeru 3, osim što je podloga za dodavanje u glavnom koraku gajenja u kulturi pripremljena tako da zadovolji sledeće uslove, a vreme gajenja nakon promene pH vrednosti bilo je 3 časa. Dobijeni rezultati su dati u tabeli 6.

2

Podloga za dodavanje: melasa (sadržaj šećera: 36%): 760 ml do 870 ml NH4OH (10%): 100 ml do 200ml fosforna kiselina (85%): 5 do 20 (g)

Tabela 6

Kao što je prikazano u tabeli 6, sadržaj (% u masenim procentima) slobodne glutaminske kiseline u suvoj biomasi kvasca bio je 8,44% u masenim procentima (primer 4-1), 8,06% u masenim procentima (primer 4-2), 8,45% u masenim procentima (primer 4-3) i 9,13% u masenim procentima (primer 4-4). S druge strane, sadržaj slobodne glutaminske kiseline u ekstraktu dobijenom iz takvog kvasca bio je 33,2% u masenim procentima (primer 4-1), 33,3% u masenim procentima (primer 4-2), 28,2% u masenim procentima (primer 4-3) i 27,1% u masenim procentima (primer 4-4).

Iz ovih rezultata jasno je da podvrgavanje kvasca u stacionarnoj fazi rasta promeni pH vrednosti omogućava dobijanje kvasca sa veoma velikim sadržajem slobodne glutaminske kiseline, to jest, sadržajem od 8% u masenim procentima ili više u suvoj biomasi kvasca, te da je moguće dobiti ekstrakt kvasca koji sadrži veliku količinu slobodne glutaminske kiseline koja nije poznata iz stanja tehnike, tj. sadržaj slobodne glutaminske kiseline od 30% u masenim procentima ili više.

Primer 5

Nakon toga, gajenje kvasca u kulturi sprovedeno je na isti način kao u primeru 1 pomoću kvasca (Candida utilis soj JCM1624), pa je pripremljen ekstrakt kvasca ekstrakcijom rastvora sa kulturom i izvršena je analiza glutaminske kiseline. Rezultati su dati u tabeli 7.

Tabela 7

Iz ovih rezultata, vidi se da je kvasac (Candida utilis soj JCM1624) takođe pokazao značajno povećanje sadržaja glutaminske kiseline u kvascu, kao posledica promene pH vrednosti nakon ulaska u stacionarnu fazu rasta.

Primer 6

Potom je izmeren sadržaj slobodne glutaminske kiseline i ukupni sadržaj slobodnih aminokiselina u suvoj masi za ekstrakt dobijen iz kvasca koji je dobijen na isti način kao u primeru 1 (pri zadatoj pH vrednosti od 9,0), osim što je vreme gajenja u kulturi bilo 3 časa. Uz to, merenje sadržaja slobodnih aminokiselina kao što je slobodna glutaminska kiselina izvedeno je pomoću analizatora Acquity UPLC proizvođača Waters Corporation, u skladu sa postupkom sa obeležavanjem pomoću AccQ-Tag Ultra markera. Dobijeni rezultati merenja su dati u tabeli 8. U tabeli 8, izraz "sadržaj glutaminske kiseline" odnosi se na slobodnu glutaminsku kiselinu u odnosu na suvu masu ekstrakta kvasca, dok izraz "ukupni sadržaj aminokiselina" označava ukupan sadržaj slobodnih aminokiselina u suvoj masi ekstrakta kvasca.

Tabela 8

Kao što je prikazano u tabeli 8, sadržaj slobodne glutaminske kiseline pre i nakon promene pH bio je 6,9 masenih % i 26 masenih %, redom, što predstavlja uvećanje od približno 3,7 puta. S druge strane, ukupni sadržaj slobodnih aminokiselina povećao se sa 11,4 masenih % na 43 masenih %.

Primer 7

Zatim su izmereni i upoređeni sadržaj slobodne glutaminske kiseline i ukupni sadržaj slobodnih aminokiselina u suvoj masi ekstrakta kvasca za ekstrakt kvasca koji je dobijen na

2

isti način kao u primeru 1 (pH vrednosti od 9,0) i za komercijalno dostupne ekstrakte kvasca (komparativni primeri 1 do 8). Uz to, merenje slobodnih aminokiselina kao što je slobodna glutaminska kiselina izvršeno je na isti način kao u primeru 6. Sadržaj slobodne glutaminske kiseline (u masenim procentima) i sadržaj ukupnih slobodnih aminokiselina (u masenim procentima) uz odnosu na suvu masu svakog od ekstrakata kvasca, dobijen kao rezultat merenja, predstavljen je u tabeli 9. U tabeli 9, izraz "sadržaj glutaminske kiseline" odnosi se na slobodnu glutaminsku kiselinu u odnosu na suvu masu ekstrakta kvasca, dok izraz "ukupni sadržaj aminokiselina" označava ukupan sadržaj slobodnih aminokiselina u suvoj masi ekstrakta kvasca.

Tabela 9

Iz prethodnih rezultata, vidi se da je sadržaj slobodne glutaminske kiseline u ekstraktu kvasca u skladu sa predmetnom prijavom veoma visok, to jest, 29,1 masenih %. Ekstrakt kvasca koji sadrži slobodnu glutaminsku kiselinu u veoma visokoj koncentraciji kao što je prethodno opisano nije ranije objavljen u stanju tehnike. Rezultati ukazuju da je ekstrakt kvasca prema predmetnoj prijavi poželjniji kao začin.

Primer 8

Uz upotrebu ekstrakta kvasca u prahu (dobijenog iz Saccharomyces cerevisiae soj AB9846, sadržaj glutaminske kiseline 23%, u masenim procentima) koji je dobijen sprašivanjem ekstrakta kvasca dobijenog iz kvasca u skladu sa primerom 1 (pH 9,0), pripremljene su čorba od paste pasulja i konsome supa. Količina ekstrakta kvasca koja je dodata u čorbu od paste pasulja i konsome supu bila je 0,2%.

2

Uz upotrebu mesnog praška MEAST POWDER N (proizvođača Asahi Food & Healthcare Co., Ltd., sadržaj glutaminske kiseline: 4% u masenim procentima) kao komparativnog primera, pripremljene su čorba od paste pasulja i konsome supa, isto kao i u primeru iznad. Izvršena je ocena senzornih karakteristika u skladu sa sledećim postupkom.

Postupak ocenjivanja

Komparativni senzorni test izvršen je uz učešće 10 posebnih panelista, sa slepim poređenjem u dve tačke. Izvršen je t-test u obliku parnih komparativnih testova.

Kriterijumi za ocenjivanje

3 kriterijuma: slani ukus (efekat umanjenja količine soli), umami i aromatičnost ukusa, ocenjivani su u 5 stadijuma na način koji je detaljinije opisan ispod, pri čemu je porcija čorbe od paste pasulja ili konsome supe uzeta kao referentna tačka 0. "Izuzetno jako" = 2; "jako" = 1; "ni jako ni slabo" = 0; "slabo" = -1; "izuzetno slabo" = -2.

Rezultati za čorbu od paste pasulja dati su u tabeli 10, a rezultati za konsome supu u tabeli 11.

2

Iz rezultata u tabeli 10 vidi se da je čorba od paste pasulja pokazala razliku u prosečnim vrednostima za slani ukus i umami, kao i značaju razliku u aromatičnosti ukusa. Iz rezultata u tabeli 11 vidi se da je konsome supa pokazala razliku u prosečnim vrednostima za slan ukus i aromatičnost ukusa, i značajnu razliku za umami. Smatra se da je to posledica činjenice da ekstrakt kvasca iz predmetne prijave ima značajno veći sadržaj glutaminske kiseline od onih iz stanja tehnike.

Primer 9

Budući da se i drugi kvasci, osim Saccharomyces cerevisiae soj AB9846 i Candida utilis soj JCM1624 takođe dobijaju sa povećanim sadržajem glutaminske kiseline u kvascu pomoću podešavanja (promene) pH nakon stacionarne faze, 10 sojeva roda Saccharomyces, 4 soja roda Candida i dva soja roda Kluyveromyces gajeni su u kulturi na isti način kao u primeru 1, nakon čega je određivan sadržaj glutaminske kiseline. Konkretnije, gajenje u kulturi i merenje sadržaja glutaminske kiseline izvršeni su za Saccharomyces cerevisiae (pivski kvasac) soj AB1, Saccharomyces cerevisiae (Kyokai br.4, vinski) soj AB2, Saccharomyces cerevisiae (Kyokai kvasac br. 5) soj AB3, (vinski kvasac) soj AB4 iz roda Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae (pekarski kvasac) soj AB5, Saccharomyces cerevisiae (pekarski kvasac) soj AB6, (viski kvasac) soj AB7 iz roda Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae soj AB8, Saccharomyces sake (Kyokai kvasac br. 6) soj AB9, Saccharomyces bayanus soj AB10, Candida utilis (IAM0626) soj AB11, Candida utilis (IFO0639) soj AB12, Candida utilis (JCM2287 je roditeljski soj) soj AB13, Candida utilis (JCM2287 je roditeljski soj) soj AB14, Kluyveromyces lactis (IFO1090) soj AB15 i Kluyveromyces lactis soj AB16. Uz to, Saccharomyces cerevisiae soj AB9846 gajen je u kulturi i za njega je izvršeno merenje sadržaja glutaminske kiseline, kao kontrola.

Konkretnije, glavni korak gajenja svakog od ovih kvasaca u kulturi, koji je prethodno preliminarno fermentisan u podlozi od melase (8% melasa, 0,6% urea, 0,16% amonijum sulfat i 0,08% diamonijum hidrogen fosfat) izveden je u podlozi (0,18% amonijum hlorida, 0,04% diamonijum hidrogen fosfata) u kojoj se kao podloga za dodavanje koristi melasa (sadržaj šećera: 36%) u zapremini od 800 ml (u boci za podlogu od 1 l, konačno 8%). Temperatura i uslovi aeracije/mešanja kulture bili su isti kao za primer 1.

Neposredno nakon što je kvasac koji se gaji u kulturi ušao u stacionarnu fazu rasta, izvršena je promena pH vrednosti dodatkom vodenog rastvora NH4OH (10%) (zadata vrednost pH od 7 do 11), pa je kvasac dalje gajen u kulturi. Gajenje kvasca u kulturi završeno je 48 časova nakon što je počeo glavni korak gajenja u kulturi. Iz izolovanog kvasca pripremljeni su suva biomasa kvasca i ekstrakt kvasca, na isti način kao u primeru 1, pa je u njima merena količina slobodne glutaminske kiseline.

Rezultati merenja sadržaja slobodne glutaminske kiseline (u masenim procentima) u suvoj biomasi kvasca dati su u tabeli 12, a rezultati merenja sadržaja slobodne glutaminske kiseline (u masenim procentima) u ekstraktima kvasca dati su u tabeli 13. Kada je reč o testovima br. 6 do 10, sadržaj glutaminske kiseline nije meren pre porasta pH.

Tabela 12

1

Tabela 13

2 Kao što je prikazano u tabeli 12 i tabeli 13, potvrđeno je da svi sojevi pokazuju nagli porast sadržaja slobodne glutaminske kiseline nakon porasta pH, u poređenju sa sadržajem pre porasta pH. Dalje, kada je reč o testovima br. 6 do 10, iako sadržaj slobodne glutaminske kiseline pre porasta pH vrednosti nije meren, s obzirom da je sadržaj slobodne glutaminske kiseline u suvoj biomasi kvasca bio veći od 4,5%, u masenim procentima, za sve sojeve a sadržaj slobodne glutaminske kiseline u ekstraktu kvasca bio značajno veći od 20% u masenim procentima, smatra se da je sadržaj slobodne glutaminske kiseline značajno proastao usled povećanja pH vrednosti nakon dostizanja stacionarne faze. Iz ovih rezultata, očigledno je da se efekat povećanja sadržaja glutaminske kiseline u skladu sa postupkom prema predmetnom pronalasku ispoljava kod različitih kvasaca, bez ograničenja na poseban soj, a takav efekat se ispoljava ukoliko je soj kvasca, u najmanju ruku, soj koji pripada rodu Saccharomyces ili soj koji pripada rodu Candida.

Industrijska primenljivost

Budući da je moguće dobiti kvasac koji održava visok sadržaj glutaminske kiseline pomoću postupka za proizvodnju kvasca sa visokim sadržajem glutaminske kiseline u skladu sa predmetnom prijavom i(li) pronalaskom, takav kvasac može da se koristi u prehrambenoj industriji, kao što su preparati na bazi ekstrakta kvasca.

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za povećanje proizvodnje glutaminske kiseline u kvascu, naznačen time što podrazumeva korake

a. gajenja kulture kvasca u logaritamskoj fazi rasta na pH u opsegu od 3,5 do 7,5 i na temperaturi u opsegu od 20°C do 40°C i

b. nakon što navedena kultura kvasca dostigne stacionarnu fazu rasta, podvrgavanje navedene kulture gajenju u tečnoj kulturi u uslovima u kojima se pH tečne podloge menja ka alkalnom opsegu od 7,5 i višem, ali manjem od 11, a temperatura je u opsegu od 20°C do 40°C,

gde je navedeni kvasac izabran iz grupe koja se sastoji od: Saccharomyces cerevisiae AB1, Saccharomyces cerevisiae AB4 i Saccharomyces cerevisiae AB5, a u koraku gajenja kulture u tečnoj podlozi, deo kulture kvasca se odvaja nakon promene pH pa se s vremena na vreme meri sadržaj slobodne glutaminske kiseline.

2. Postupak za povećanje proizvodnje glutaminske kiseline u kvascu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što korak gajenja u tečnoj kulturi obuhvata: korak podešavanja pH tečne podloge na vrednost od 7,5 ili veću, a manju od 11 nakon što rast kvasca dostegne stacionarnu fazu; i korak daljeg gajenja kvasca u kulturi u istom opsegu pH.

3. Postupak za povećanje proizvodnje glutaminske kiseline u kvascu prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što korak podešavanja pH vrednosti na 7,5 ili više, ali na manje od 11 jeste korak dodavanja alkalne supstance u tečnu podlogu.

4. Postupak za proizvodnju kvasca koji ima sadržaj glutaminske kiseline od 2,3% do 10% u masenim procentima u odnosu na suvu masu kvasca i gde je navedeni kvasac

4

Saccharomyces cerevisiae AB1, Saccharomyces cerevisiae AB4 ili Saccharomyces cerevisiae AB5, naznačen time što dati postupak podrazumeva gajenje kvasca u kulturi u skladu sa postupkom iz patentnih zahteva 1 do 3 te izolovanje navedenog kvasca iz kulture.