RS61203B1 - Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raka jednjaka i drugih malignih tumora - Google Patents

Description

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, proteine, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidne epitope tumor-asocirane T ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima koji mogu na primer služiti kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore, ili za stimulaciju T ćelija ex vivo i prenos u pacijente. Peptidi vezani za molekule glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC), ili peptidi kao takvi, mogu takođe biti ciljevi antitela, solubilnih T-ćelijskih receptora i drugih molekula koji imaju sposobnost vezivanja.

Predmetni pronalazak odnosi se na peptidnu sekvencu dobijenu iz HLA molekula klase I humanih tumorskih ćelija koja može da se koristi u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora, ili kao cilj za razvoj farmaceutski/imunološki aktivnih jedinjenja i ćelija.

OSNOVNE INFORMACIJE O PRONALASKU

Rak jednjaka je osmi najčešći maligni tumor širom sveta, sa petogodišnjom prevalencijom od 464.063 pacijenta u 2012. godini. Stope mortaliteta su vrlo slične stopama incidence (400.169 naspram 455.784 u 2012. godini), što ističe visoku stopu smrtnosti od raka jednjaka (World Cancer Report, 2014; Ferlay et al., 2013; Bray et al., 2013).

Karcinom skvamoznih ćelija i adenokarcinom predstavljaju dva najčešća podtipa raka jednjaka. Oba podtipa su češća kod muškaraca nego kod žena, ali pokazuju različitu geografsku distribuciju. Karcinom skvamoznih ćelija je prevalentniji u regionima sa niskim resursima, sa naročito visokim stopama incidence u Islamskoj Republici Iranu, delovima Kine i Zimbabveu. Adenokarcinom je najčešći tip raka jednjaka među belcima i u populacijama sa visokim društveno-ekonomskim statusom, na čelu sa Ujedinjenim Kraljevstvom, Australijom, Holandijom i SAD. Najjači faktori rizika za razvoj karcinoma skvamoznih ćelija jednjaka uključuju konzumiranje alkohola i duvana, dok je adenokarcinom jednjaka uglavnom povezan sa gojaznošću i gastroezofagealnom refluksnom bolešću. Stope incidence adenokarcinoma jednjaka stabilno rastu u zemljama sa visokim prihodima, što bi moglo da se pripiše rastućim stopama gojaznosti i gastroezofagealne refluksne bolesti, kao i promenama u klasifikaciji tumora na gastroezofagealnom spoju. Neuroendokrini karcinom, adenoidni cistični karcinom, adenoskvamozni karcinom, mukoepidermoidni karcinom, mešoviti adenoneuroendokrini karcinom, različiti sarkomi i melanomi predstavljaju ređe podtipove raka jednjaka (World Cancer Report, 2014).

Primarna strategija terapije za rak jednjaka zavisi od faze i lokacije tumora, histološkog tipa i medicinskog stanja pacijenta. Sama hirurška intervencija nije dovoljna, osim u maloj podgrupi pacijenata sa karcinomom skvamoznih ćelija. Generalno, hiruršku intervenciju treba kombinovati sa preoperativnom i eventualno postoperativnom hemioterapijom ili preoperativnom hemioradijacijom, dok se pokazalo da samo preoperativno ili postoperativno zračenje ne pruža nikakve koristi u pogledu preživljavanja. Režimi hemioterapije uključuju oksaliplatin plus fluorouracil, karboplatin plus paklitaksel, cisplatin plus fluorouracil, FOLFOX i cisplatin plus irinotekan. Pacijente sa HER2-pozitivnim tumorima treba lečiti u skladu sa smernicama za gastrični rak koristeći kombinaciju cisplatina, fluorouracila i trastuzumaba, jer su randomizovani podaci za ciljane terapije kod raka jednjaka veoma ograničeni (Stahl et al., 2013; Leitlinie Magenkarzinom, 2012).

Generalno, većina tipova raka jednjaka može dobro da se kontroliše ako se pacijenti jave u ranoj fazi tumora, dok je uspeh terapije vrlo ograničen u kasnijim fazama. Stoga bi razvoj novih protokola skrininga mogao biti vrlo efikasan u smanjenju stopa smrtnosti povezanih sa rakom jednjaka (World Cancer Report, 2014).

Imunoterapija bi mogla da bude obećavajući novi pristup lečenju uznapredovalog raka jednjaka. Pokazalo se da je kod raka jednjaka prekomerno eksprimirano nekoliko gena povezanih sa rakom i karcinom/testis antigena, uključujući različite MAGE gene, NY-ESO-1 i EpCAM (Kimura et al., 2007; Liang et al., 2005b; Inoue et al., 1995; Bujas et al., 2011; Tanaka et al., 1997; Quillien et al., 1997). Ovi geni predstavljaju vrlo interesantne ciljeve za imunoterapiju i većina njih se ispituje za lečenje drugih maligniteta (ClinicalTrials.gov, 2015). Pored toga, kod raka jednjaka opisana je ushodna regulacija PD-L1 i PD-L2, koja je bila u korelaciji sa lošijom prognozom. Stoga bi pacijenti sa rakom jednjaka sa PD-L1 pozitivnim tumorima mogli imati koristi od anti-PD-L1 imunoterapije (Ohigashi et al., 2005).

Klinički podaci o imunoterapijskim pristupima kod raka jednjaka su trenutno još uvek relativno oskudni, jer je završen samo vrlo ograničen broj kliničkih ispitivanja u ranoj fazi (Toomey et al., 2013). Vakcina koja se sastoji od tri peptida izvedena iz tri različita karcinom/testis antigena (TTK protein kinaza, kompleks limfocitnih antigena-6 lokus K i insulinu sličan faktor rasta (IGF)-II iRNK vezujući protein 3) data je pacijentima sa uznapredovalim rakom jednjaka u ispitivanju 1. faze, sa osrednjim rezultatima (Kono et al., 2009). Intratumorska injekcija aktiviranih T ćelija nakon in vitro izazivanja autolognim malignim ćelijama i interleukinom 2 izazvala je kompletne ili delimične tumorske odgovore kod četiri od jedanaest pacijenata u studiji faze l/ll (Toh et al., 2000; Toh et al., 2002). Trenutno se sprovode dodatna klinička ispitivanja za procenu uticaja različitih imunoterapija na rak jednjaka, uključujući adoptivnu ćelijsku terapiju (NCT01691625, NCT01691664, NCT01795976, NCT02096614, NCT02457650), strategije vakcinacije (NCT01143545, NCT01522820) i anti-PD-L1 terapiju (NCT02340975) (ClinicalTrials.gov, 2015).

Imajući u vidu teška neželjena dejstva i trošak lečenja raka, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju raka uopšte i konkretno raka jednjaka. Takođe postoji potreba da se identifikuju faktori koji predstavljaju biomarkere za rak uopšte i konkretno za rak jednjaka, koji bi doveli do boljeg dijagnostikovanja raka, bolje procene prognoze i predviđanja uspeha lečenja.

Imunoterapija raka predstavlja mogućnost specifičnog ciljanja ćelija raka uz svođenje neželjenih dejstava na minimum. Imunoterapija raka iskorišćava postojanje tumor-asociranih antigena.

Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena (TAA) sadrži sledeće velike grupe:

a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumor-specifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije i NY-ESO-1.

b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao. Većina poznatih antigena diferencijacije nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za rak prostate. c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd.). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora. Tumorska specifičnost (ili asociranost) peptida može takođe biti posledica toga što peptid potiče iz tumor- (-asociranog) egzona u slučaju proteina sa tumor-specifičnim (-asociranim) izoformama.

e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumorspecifični.

f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

Imunoterapija bazirana na T ćelijama cilja peptidne epitope dobijene iz tumorasociranih ili tumor-specifičnih proteina, koje prezentuju molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC). Antigeni koje prepoznaju tumorspecifični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Postoje dve klase MHC molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. MHC molekuli klase I su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina, MHC molekuli klase II od alfa i beta lanca. Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima.

MHC molekuli klase I se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. Oni prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ova) i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju npr. u toku endocitoze, i nakon toga obrađuju.

Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T ćelije koje nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.

CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora (Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za citotoksične T ćelije (CTL) (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, ćelije prirodne ubice (NK), makrofage i granulocite (Hwang et al., 2007).

U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, otkriveno je da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel et al., 2006).

Elongirani (duži) peptidi pronalaska mogu da deluju kao MHC klasa II aktivni epitopi.

T-pomoćničke ćelije, aktivirane od strane MHC klasa II epitopa, imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CD8-pozitivnih T limfocita, CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferonagama (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Postoje dokazi da su CD4 T ćelije direktni antitumorski efektori (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na imunske ćelije, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora ranije se nije smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici su uspešno identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1).

Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ T ćelija (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.

Da bi peptid MHC klase I pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on takođe mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji se vezuju za MHC klasa I su obično dužine 8–12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da naknadno prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane T limfocita kao tumor-specifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne ili u uporedivo malim količinama od strane normalnih zdravih tkiva. U poželjnom otelotvorenju, peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog njihove funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektno tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). Esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, kako bi se osiguralo da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije koja ima odgovarajući TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

Stoga su TAA početna tačka za razvoj terapije zasnovane na T ćelijama uključujući, bez ograničavanja, tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA obično su zasnovani na upotrebi T ćelija koje mogu biti izolovane iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva. Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. U veoma poželjnom otelotvorenju pronalaska je zato važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).

U slučaju ciljanja kompleksa peptid-MHC pomoću specifičnih TCR-ova (npr. solubilni TCR) i antitela u skladu sa pronalaskom, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. U tim slučajevima presudni faktor je prezentacija.

Rizzolo i sar. (u radu: Conventional and microwave-assisted SPPS approach: a comparative synthesis of PTHrP(1-34)NH2D3 J Pept Sci.2011 Oct; 17(10):708-14) bave se metodom sinteze za polipeptide i porede Fmoc/tBu MW-asistirani SPPS 1-34 N-terminalnog fragmenta paratiroidnom hormonu srodnog peptida (PTHrP) sa njegovim konvencionalnim SPPS sprovedenim u RT. Tokom etapne elongacije peptida koji je vezan za smolu, praćenje je obavljeno sprovođenjem MW-asistiranih mini-cepanja i njihovom analizom pomoću UPLC-ESI-MS. Identifikacija nekih sekvenci delecije bila je korisna za prepoznavanje kritičnih spajanja i kao takva je pomogla u uvođenju MW zračenja u ovim fazama. Tokom sinteze se prikazuju samo fragmenti peptida. Ništa se ne navodi u pogledu upotrebe peptida patentnog zahteva u medicini.

US 2005/033023 predstavlja 10mer peptid FLHHLIAEIH (PTR-2, ID BR. SEKV: 3) koji se preklapa sa ID BR. SEKV: 9 predmetne patentne prijave, HLIAEIHTA. U US 2005/033023, PTH-rP molekuli su skrinirani „Parker“ algoritmom (BlMAS) kako bi se predvideli peptidi koji imaju motive za visoko teorijsko vezivanje za HLA-A(*)02.01. Utvrđeno je da PTR-2 ima najviši afinitet vezivanja za HLA-A(*)02.01, ali motiv predmetnog peptida nije identifikovan u US 2005/033023.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

U prvom aspektu predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 9, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u medicini.

U sledećim tabelama prikazani su peptid za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, odgovarajući ID BR. SEKV i prospektivni izvorni (osnovni) geni za ove peptide. Svi peptidi u tabeli 1 i tabeli 2 vezuju se za HLA-A*02. Peptidi u tabeli 2 objavljeni su ranije u velikim spiskovima kao rezultati visoko propusnih skrininga sa velikim stopama greške ili su izračunati pomoću algoritama, ali nisu nikada ranije bili povezani sa malignim tumorom. Peptidi u tabeli 3 su dodatni peptidi koji mogu biti korisni u kombinaciji sa drugim peptidima za upotrebu pronalaska. Peptidi u tabeli 4 su pored toga korisni u dijagnostikovanju i/ili lečenju različitih drugih maligniteta, koji podrazumevaju prekomernu ekspresiju ili prekomernu prezentaciju dotičnog osnovnog polipeptida.

Tabela 1: Predstavljeni peptidi, ID BR. SEKV: 9 je za upotrebu u skladu sa pronalaskom

1

Tabela 2: Dodatni predstavljeni peptidi bez prethodno poznate povezanosti sa malignim tumorima

Tabela 3: Peptidi korisni za npr. personalizovane antitumorske terapije

Predmetni pronalazak se dalje uopšteno odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti, kao što su, na primer, rak pluća, rak mokraćne bešike, rak jajnika, melanom, rak materice, hepatocelularni karcinom, rak bubrežnih ćelija, maligni tumor mozga, kolorektalni karcinom, rak dojke, rak želuca, rak pankreasa, rak žučne kese, rak žučnih puteva, rak prostate i leukemija.

Predstavljeni su peptidi – samostalni ili u kombinaciji – iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 93. Više poželjni su peptidi – samostalni ili u kombinaciji – izabrani iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 76 (vidite tabelu 1) i njihove primene u imunoterapiji raka jednjaka, raka pluća, raka mokraćne bešike, raka jajnika, melanoma, raka materice, hepatocelularnog karcinoma, raka bubrežnih ćelija, malignog tumora mozga, kolorektalnog karcinoma, raka dojke,

1

raka želuca, raka pankreasa, raka žučne kese, raka žučnih puteva, raka prostate i leukemije, a poželjno raka jednjaka.

Predstavljeni su peptidi – samostalni ili u kombinaciji – izabrani iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 26, 30, 32, 34, 37, 40, 51, 55, 57, 58, 59, 62, 81 i 82 i njihove primene u imunoterapiji raka jednjaka, raka pluća, raka mokraćne bešike, raka jajnika, melanoma, raka materice, hepatocelularnog karcinoma, raka bubrežnih ćelija, malignog tumora mozga, kolorektalnog karcinoma, raka dojke, raka želuca, raka pankreasa, raka žučne kese, raka žučnih puteva, raka prostate i leukemije, a poželjno raka jednjaka. Dalje naročito poželjan je peptid za upotrebu u skladu sa ID BR. SEKV: 9.

Kako je prikazano u sledećoj tabeli 4A, mnogi od predstavljenih peptida se takođe nalaze i na drugim vrstama tumora, te se stoga mogu koristiti i u imunoterapiji drugih indikacija. Takođe pogledajte sliku 1 i primer 1.

Tabela 4A: Predstavljeni peptidi i njihove specifične primene u drugim proliferativnim oboljenjima, posebno u drugim malignim bolestima. ID BR. SEKV: 9 je za upotrebu u skladu sa pronalaskom. U tabeli je prikazano, za izabrane peptide, na kojim dodatnim vrstama tumora su pronađeni i bilo da su prekomerno prezentovani na više od 5% izmerenih uzoraka tumora ili prezentovani na više od 5% izmerenih uzoraka tumora pri čemu je odnos geometrijskih srednjih vrednosti tumora u odnosu na normalna tkiva veći od 3. Prekomerna prezentacija se definiše kao viša prezentacija na uzorku tumora u poređenju sa normalnim uzorkom sa najvišom prezentacijom. Normalna tkiva u odnosu na koja je prekomerna prezentacija testirana bila su: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak, centralni nerv, kolon, duodenum, jednjak, žučna kesa, srce, bubreg, jetra, pluća, limfni čvor, mononuklearne bele krvne ćelije, pankreas, periferni nerv, peritoneum, hipofiza, pleura, rektum, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, timus, štitasta žlezda, trahea, ureter, mokraćna bešika, vena.

1

Tabela 4B: Predstavljeni peptidi i njihove specifične primene u drugim proliferativnim oboljenjima, posebno u drugim malignim bolestima (izmena i dopuna tabele 4). U tabeli je prikazano, kao u tabeli 4A, za izabrane peptide, na kojim dodatnim vrstama tumora je pronađeno da pokazuju prekomernu prezentaciju (uključujući specifičnu prezentaciju) na više od 5% izmerenih uzoraka tumora, ili prezentaciju na više od 5% izmerenih uzoraka tumora pri čemu je odnos geometrijskih srednjih vrednosti tumora u odnosu na normalna tkiva veći od 3. Prekomerna prezentacija se definiše kao viša prezentacija na uzorku tumora u poređenju sa normalnim uzorkom sa najvišom prezentacijom. Normalna tkiva u odnosu na koja je prekomerna prezentacija testirana bila su: masno tkivo,

1

nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak, centralni nerv, kolon, duodenum, jednjak, oko, žučna kesa, srce, bubreg, jetra, pluća, limfni čvor, mononuklearne bele krvne ćelije, pankreas, paraštitasta žlezda, periferni nerv, peritoneum, hipofiza, pleura, rektum, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, štitasta žlezda, trahea, ureter, mokraćna bešika, vena.

1

1

NSCLC = nesitnoćelijski karcinom pluća, SCLC = sitnoćelijski karcinom pluća, RCC = karcinom bubrega, CRC = karcinom kolona ili rektuma, GC = karcinom želuca, HCC = karcinom jetre, PC = karcinom pankreasa, PrC = karcinom prostate, BRCA = karcinom dojke, OC = karcinom jajnika, NHL = non-Hočkin limfom, AML = akutna mijeloidna leukemija, CLL = hronična limfocitna leukemija, HNSCC = skvamocelularni karcinom glave i vrata.

Tako se drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi na upotrebu najmanje jednog predstavljenog peptida u skladu sa bilo kojim od ID BR. SEKV 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 11, 13, 17, 40, 57, 58, 62, 67, 72, 76, 77, 80, 82, 88, 92 i 94 za – u jednom poželjnom otelotvorenju kombinovano – lečenje nesitnoćelijskog karcinoma pluća.

Tako se drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom za, poželjno kombinovano, lečenje proliferativne bolesti izabrane iz grupe koju čine rak jednjaka, rak pluća, rak mokraćne bešike, rak jajnika, melanom, rak materice, hepatocelularni karcinom, rak bubrežnih ćelija, maligni tumor mozga, kolorektalni karcinom, rak dojke, rak želuca, rak pankreasa, rak žučne kese, rak žučnih puteva, rak prostate i leukemija.

Predmetni pronalazak se pored toga odnosi na peptid za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom koji ima sposobnost da se veže za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 9, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u medicini.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina koji sadrži N-terminalne 80 aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziran na (ili u sekvencu) antitela, kao, na primer,

1

antitela koje je specifično za dendritične ćelije.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptid za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju bolesti i medicini, konkretno u lečenju raka.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela koja su specifična protiv peptida za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili kompleksa navedenog peptida za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom sa MHC i metode za pravljenje istih.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove), konkretno solubilne TCR (sTCR) i klonirane TCR ubačene u autologne ili alogene T ćelije, i metode za pravljenje istih, kao i NK ćelije ili druge ćelije koje nose navedeni TCR ili koje unakrsno reaguju sa navedenim TCR-ovima.

Antitela i TCR su dodatna otelotvorenja imunoterapijske upotrebe peptida u skladu sa prikazanim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije kako je ranije opisan. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod za proizvodnju peptida za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na navedeni metod u skladu sa predmetnim

2

pronalaskom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigenprezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV 9.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija proizvedenih u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na opisani peptid, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćeliju u skladu sa predmetnim pronalaskom, aktivirani T limfocit, T-ćelijski receptor ili antitelo ili drugi peptid – i/ili molekule koji vezuju peptid-MHC u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u vidu leka ili u proizvodnji leka. Poželjno, navedeni lek je aktivan protiv raka.

Poželjno, navedeni lek je ćelijska terapija, vakcina ili protein zasnovan na solubilnom TCR ili antitelu.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije malignog tumora ćelije raka jednjaka, raka pluća, raka mokraćne bešike, raka jajnika, melanoma, raka materice, hepatocelularnog karcinoma, raka bubrežnih ćelija, malignog tumora mozga, kolorektalnog karcinoma, raka dojke, raka želuca, raka pankreasa, raka žučne kese, raka žučnih puteva, raka prostate i leukemije, a poželjno ćelije raka jednjaka.

Na primer, antitelo ili rastvorljivi TCR može da se koristi za bojenje isečaka tumora radi detekcije prisustva peptida od interesovanja u kompleksu sa MHC.

Opciono, antitelo nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

Pokazalo se da su različiti polimorfizmi kod PTHLH povezani sa rizikom i prognozom karcinoma pluća (Manenti et al., 2000). Ushodna regulacija PTHLH kod C57BL/6 mišjeg modela spontano metastatskog karcinoma mlečne žlezde opisana je kao potencijalno uključena u metastatsku diseminaciju raka dojke (Johnstone et al., 2015). Pokazano je da se PTHLH ushodno reguliše kod oralnog skvamocelularnog karcinoma, hondroidnih neoplazmi, adultne T ćelijske leukemije/limfoma i svetloćelijskih karcinoma bubrežnih ćelija (Bellon et al., 2013; Yang et al., 2013a; Yao et al., 2014; Lv et al., 2014). Pokazano je da je ushodna regulacija PTHLH povezana sa lošom patološkom diferencijacijom i lošom prognozom kod pacijenata sa skvamocelularnim karcinomom glave i vrata (Lv et al., 2014). Pokazano je da se PTHLH ushodno reguliše putem p38 MAPK signalizacije, što doprinosi ekstravazaciji ćelija karcinoma kolona u pluća putem smrti endotelijalnih ćelija plućne mikrovaskulature nezavisno od kaspaza (Urosevic et al., 2014). Pokazano je da je PTHLH značajno diferencijalno eksprimiran kod skvamocelularnog karcinoma u poređenju sa normalnom kožom (Prasad et al., 2014). PTHLH je opisan kao deo genetskog potpisa koji čine četiri gena povezanog sa preživljavanjem kod pacijenata sa nesitnoćelijskim karcinomom pluća u ranoj fazi (Chang et al., 2012). Opisano je da poremećaj antiproliferativne funkcije mutacijama pomerenog okvira čitanja PTHLH doprinosi razvoju ranog kolorektalnog karcinoma kod pacijenata sa naslednim nepolipoznim kolorektalnim karcinomom (Yamaguchi et al., 2006). Pokazano je da je ushodna regulacija PTHLH povezana sa lošim ishodom kako u pogledu ukupnog preživljavanja tako i u pogledu preživljavanja bez prisustva bolesti kod pacijenata sa svetloćelijskim karcinomom bubrežnih ćelija koji su se podvrgli nefrektomiji (Yao et al., 2014). Pokazano je da PTHLH pozitivno modulira progresiju ćelijskog ciklusa i menja ekspresiju proteina uključenih u regulaciju ćelijskog ciklusa preko ERK1/2, p38, MAPK i PI3K signalnih puteva kod ćelijske linije Caco-2 kolorektalnog adenokarcinoma (Calvo et al., 2014).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

Na način kako su korišćeni u ovom tekstu, i sem ako nije naznačeno drugačije, svi termini su definisani kako je navedeno u nastavku.

Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane citotoksične T ćelije, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferona-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.

Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfaamino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, kao i dužine 10, 11, 12, 13 ili 14 ili duži, a u slučaju peptida MHC klase II (elongirane varijante predstavljenih peptida) oni mogu biti dužine od 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 ili više aminokiselina.

Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli.

2

Neophodno je napomenuti da se soli peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi in vivo nisu soli.

Termin „peptid“ će takođe obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.

Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR-ova protiv njega.

T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.

Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.

Tabela 5: Učestalosti ekspresije F HLA-A*02 i HLA-A*24 i najučestaliji serotipovi HLA-DR. Učestalosti su izvedene iz učestalosti haplotipova Gf unutar američke populacije adaptirane iz rada Mori i sar. (Mori et al., 1997) primenom Hardi-Vajnbergove formule F = 1 - (1-Gf)<2>. Kombinacije A*02 ili A*24 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili manje učestale nego što je očekivano u odnosu na njihove pojedinačne učestalosti usled neravnoteže povezivanja. Za detalje pogledajte rad Chanock i sar. (Chanock et al., 2004).

2

Peptidi za upotrebu pronalaska, poželjno kada su uključeni u vakcinu pronalaska kako je ovde opisana, vezuju se za A*02. Vakcina može takođe da uključuje svevezujuće MHC klasa II peptide. Stoga, vakcina pronalaska može da se koristi za lečenje malignog tumora kod pacijenata koji su A*02 pozitivni, pri čemu nije neophodan nikakav izbor za MHC klasa II alotipove zbog sve-vezujuće prirode ovih peptida.

Ako se A*02 peptidi pronalaska kombinuju sa peptidima koji se vezuju za drugi alel, na primer A*24, veći procenat bilo koje populacije pacijenata može da se leči u poređenju sa tim kada se cilja bilo koji od ova dva MHC klasa I alela sam. Dok u većini populacija pomoću bilo kog od ova dva alela samog može da se targetira manje od 50% pacijenata, vakcina koja sadrži HLA-A*24 i HLA-A*02 epitope može da leči najmanje 60% pacijenata u bilo kojoj relevantnoj populaciji. Konkretno, sledeći procenti pacijenata će biti pozitivni na najmanje jedan od ovih alela u

2

različitim regionima: SAD 61%, Zapadna Evropa 62%, Kina 75%, Južna Koreja 77%, Japan 86% (izračunato sa www.allelefrequencies.net).

U poželjnom otelotvorenju, termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer dezoksiribonukleotida.

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za (ili koji kodira) peptid“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, dendritičnu ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR-ova.

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata i jednolančanu i dvolančanu nukleinsku kiselinu. Tako, na primer za DNK, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence.

Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti izveden iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak izveden iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

2

Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.

Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u

2

relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito je obuhvaćen.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni pronalazak mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku. Termin „aktivni fragment“ označava fragment, obično peptida, polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline, koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom ili u vektoru, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.

U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca

2

upoređena sa traženom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili traženom sekvencom („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli: procenat identičnosti = 100 [1 - (C/R)]

gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što

(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i (iiii) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;

a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

Kako je ranije navedeno, predmetni pronalazak tako obezbeđuje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 9, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u medicini. Peptid za upotrebu pronalaska ima sposobnost da se vezuje za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.

U predmetnom pronalasku, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke dostupne su u javnim bazama podataka.

Naravno, peptid za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II. Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

Poželjno, kada se T ćelije specifične za peptid za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pM, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pM. Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane T ćelija dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.

U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, peptid za upotrebu je deo fuzionog proteina koji sadrži 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku „li“) koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497. U drugim fuzijama, peptidi za upotrebu predmetnog pronalaska mogu biti fuzirani na antitelo kako je opisano u ovom dokumentu, ili na njegov funkcionalni deo, naročito u sekvencu antitela, tako da budu specifično ciljani od strane navedenog antitela, ili, na primer, na ili u antitelo koje je specifično za dendritične ćelije kako su opisane u ovom dokumentu.

Pored toga, peptid za upotrebu može sadržati nepeptidne veze.

U reverznoj peptidnoj vezi, aminokiselinski ostaci nisu povezani peptidnim (-CO-NH-) vezama već je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzni peptidomimetici mogu biti napravljeni pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, na primer poput onih opisanih u radu Meziere i sar. (1997) (Meziere i sar, 1997). Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudopeptida koji sadrže izmene koje uključuju kostur, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Rad Meziere i sar. (Meziere et al., 1997) pokazuje da su ovi pseudopeptidi korisni za vezivanje MHC i T-pomoćničke ćelijske odgovore.

1

Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, mnogo su otporniji na proteolizu.

Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent US 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.

Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili tbutiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil, ili amido grupa.

Nadalje, ovako predstavljeni peptidi mogu biti sintetisani tako da se izmeni njihova prostorna konfiguracija. Na primer, može da se koristi D-izomer jednog ili više aminokiselinskih ostataka peptida, umesto uobičajenog L-izomera. Dodatno, najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka peptida pronalaska može da se supstituiše jednim od dobro poznatih aminokiselinskih ostataka koji se normalno ne javljaju u prirodi. Izmene poput ovih mogu služiti da se poveća stabilnost, bioraspoloživost i/ili vezivanje peptida pronalaska.

Uopšteno, peptidi (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas et al. (Lukas et al., 1981) i referencama koje su tamo citirane. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu

2

amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetilfenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih prethodno formiranih simetričnih anhidridnih derivata, sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog kuplovanja posredstvom N, N-dicikloheksil-karbodiimida/1 hidroksibenzotriazola. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, (rad Bruckdorfer et al., 2004) i reference koje su tamo citirane).

Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.

Da bi se izabrali prekomerno prezentovani peptidi, izračunava se profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijaciju replikata. Profil postavlja jedno uz drugo uzorke tumora od interesovanja sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila može zatim da se konsoliduje u rezultat prekomerne prezentacije pomoću izračunavanja p-vrednosti modela linearnih mešovitih efekata (Pinheiro et al., 2015) uz prilagođavanje za višestruko testiranje pomoću stope lažnog otkrivanja (Benjamini and Hochberg, 1995) (uporedite primer 1).

Radi identifikacije i relativne kvantifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprejjonizacije (nanoESI) tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih tumor-asociranih peptida (TUMAP) zabeleženih iz uzoraka raka jednjaka (N = 16 A*02-pozitivnih uzoraka) sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog karcinoma dobijenog od 16 pacijenta sa rakom jednjaka.

Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.

Ustanovljeni su nivoi prezentacije uključujući procene greške za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su isključivo prezentovani na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prezentovani u tumorskim u poređenju sa nemalignim

4

tkivima i organima.

Kompleksi HLA-peptid iz uzoraka tkiva malignog tumora jednjaka su prečišćeni, a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primere). Svi TUMAP koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima primarnog malignog tumora jednjaka, čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnom malignom tumoru jednjaka.

TUMAP identifikovani na multiplim tkivima malignog tumora jednjaka i normalnim tkivima kvantifikovani su pomoću brojanja jona LC-MS podataka bez obeležavanja. Metod pretpostavlja da oblasti LC-MS signala peptida koreliraju sa njegovom obilnošću u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprosečene po uzorku i sjedinjeni u stubičasti dijagram, koji se naziva profil prezentacije. Profil prezentacije objedinjuje različite metode analize kao što su pretraživanje baze podataka proteina, grupisanje spektra, slabljenje naelektrisanog stanja (gubitak naelektrisanja) i poravnanje vremena zadržavanja i normalizaciju.

Pored prekomerne prezentacije peptida, testirana je ekspresija iRNK osnovnog gena. Podaci o iRNK su dobijeni RNASeq analizama normalnih tkiva i malignih tkiva (vidite primer 2). Dodatni izvor podataka o normalnim tkivima bila je baza javno dostupnih podataka o ekspresiji RNK na osnovu oko 3000 uzoraka normalnog tkiva (Lonsdale, 2013). Peptidi koji su izvedeni iz proteina čija je kodirajuća iRNK visoko eksprimirana u malignom tkivu, ali je ima vrlo malo ili je uopšte nema u vitalnim normalnim tkivima, bili su poželjno uključeni u predmetni pronalazak.

Pored toga, linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2. omogućava direktnu apsolutnu kvantifikaciju nivoa MHC-, poželjno HLA-restrikovanog, peptida na malignim ili drugim inficiranim tkivima. Ukratko, ukupan broj ćelija je izračunat iz ukupnog sadržaja DNK analiziranog uzorka tkiva. Ukupna količina peptida za TUMAP u uzorku tkiva izmerena je pomoću nanoLC-MS/MS kao odnos prirodnih TUMAP i poznate količine verzije TUMAP obeležene izotopom, takozvanog unutrašnjeg standarda. Efikasnost izolacije TUMAP utvrđena je pomoću dodavanja kompleksa peptid:MHC svih izabranih TUMAP u lizat tkiva u najranijoj mogućoj tački procedure izolacije TUMAP i njihove detekcije pomoću nanoLC-MS/MS nakon završetka procedure izolacije peptida. Ukupan broj ćelija i ukupna količina peptida izračunati su iz merenja u triplikatu po uzorku tkiva. Efikasnosti izolacije specifičnog peptida izračunate su kao prosek iz 10 eksperimenata sa dodavanjem a svaki je meren u triplikatu (vidite primer 6 i tabelu 12).

Predmetni pronalazak obezbeđuje peptid za upotrebu u lečenju raka/tumora, poželjno raka jednjaka koji prekomerno ili isključivo prezentuje peptid za upotrebu pronalaska. Za peptid je pokazano masenom spektrometrijom da ga prirodno prezentuju HLA molekuli na primarnim humanim uzorcima raka jednjaka.

Dokazano je da su mnogi izvorni geni/proteini (koji se takođe nazivaju „proteini kompletne dužine“ ili „osnovni proteini“) iz kojih su dobijeni peptidi visoko prekomerno eksprimirani u malignom tumoru u poređenju sa normalnim tkivima – „normalna tkiva“ u pogledu ovog pronalaska će označavati ili zdrave ćelije jednjaka ili normalne ćelije drugih tkiva, što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena (vidite primer 2). Štaviše, sami peptidi su snažno prekomerno prezentovani na tumorskom tkivu – „tumorsko tkivo“ u pogledu ovog pronalaska će označavati uzorak od pacijenta koji boluje od raka jednjaka, ali ne na normalnim tkivima (vidite primer 1).

HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije raka jednjaka koje prezentuju dobijene peptide.

Za peptid za upotrebu predmetnog pronalaska je dokazano da je sposoban da stimuliše T-ćelijske odgovore i/ili da je prekomerno prezentovan i da samim tim može da se koristi za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, kao što su solubilini TCR-ovi, u skladu sa predmetnim pronalaskom (vidite primer 3 i primer 4). Pored toga, peptidi, kada su u kompleksu sa odgovarajućim MHC, mogu takođe da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, konkretno sTCR-ova, u skladu sa predmetnim pronalaskom. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi. Tako je peptid za upotrebu predmetnog pronalaska koristan za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj.

adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetnog pronalaska nisu prezentovani na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

Predmetni opis se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove) koji sadrže alfa lanac i beta lanac („alfa/beta TCR-ovi“). Predmetni opis se takođe odnosi na nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine za eksprimiranje TCR-ova i peptida predmetnog opisa; i metode za primenu istih.

Termin „T-ćelijski receptor“ (skraćeno TCR) odnosi se na heterodimerni molekul koji sadrži alfa polipeptidni lanac (alfa lanac) i beta polipeptidni lanac (beta lanac), naznačeno time što je heterodimerni receptor sposoban da se vezuje za peptidni antigen koji prezentuje HLA molekul. Termin takođe obuhvata takozvane gama/delta TCR-ove.

U jednom otelotvorenju opis obezbeđuje metod proizvodnje TCR-a kakav je opisan u ovom dokumentu, a metod se sastoji od uzgajanja ćelije domaćina koja je sposobna da eksprimira TCR u uslovima pogodnim za promociju ekspresije TCR-a.

U drugom aspektu opis se odnosi na metode u skladu sa opisom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom ili se antigen postavlja na MHC tetramere klase I tetramerizacijom monomera kompleksa antigen/MHC klase I.

Alfa i beta lanci alfa/beta TCR-ova i gama i delta lanci gama/delta TCR-ova se uopšteno smatraju kao da svaki ima dva „domena“, naime varijabilni i konstantni domen. Varijabilni domen sastoji se od spoja varijabilnog regiona (V) i spojnog regiona (J). Varijabilni domen može da sadrži i vodeći region (L). Beta i delta lanci mogu takođe da uključuju region diverziteta (D). Alfa i beta konstantni domeni mogu takođe da sadrže C-terminalne transmembranske (TM) domene koji usidravaju alfa i beta lance za ćelijsku membranu.

U pogledu gama/delta TCR-ova, termin „TCR gama varijabilni domen“ na način kako je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na spoj TCR gama V (TRGV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR gama J (TRGJ) regiona, a termin „TCR gama konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRGC region, ili na C-terminalno skraćenu TRGC sekvencu. Isto tako, termin „TCR delta varijabilni domen“ odnosi se na spoj TCR delta V (TRDV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR delta D/J (TRDD/TRDJ) regiona, a termin „TCR delta konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRDC region, ili na C-terminalno skraćenu TRDC sekvencu.

TCR-ovi predmetnog opisa se poželjno vezuju za kompleks peptid-HLA molekul sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 µmol/l ili manje, oko 50 µmol/l ili manje, oko 25 µmol/l ili manje, ili oko 10 mol/l ili manje. Još poželjniji su TCR-ovi visokog afiniteta koji imaju afinitete vezivanja od oko 1 µmol/l ili manje, oko 100 nmol/l ili manje, oko 50 nmol/l ili manje, oko 25 nmol/l ili manje. Neograničavajući primeri poželjnih opsega afiniteta vezivanja za TCR-ove predmetnog pronalaska obuhvataju oko 1 nmol/l do oko 10 nmol/l; oko 10 nmol/l do oko 20 nmol/l; oko 20 nmol/l do oko 30 nmol/l; oko 30 nmol/l do oko 40 nmol/l; oko 40 nmol/l do oko 50 nmol/l; oko 50 nmol/l do oko 60 nmol/l; oko 60 nmol/l do oko 70 nmol/l; oko 70 nmol/l do oko 80 nmol/l; oko 80 nmol/l do oko 90 nmol/l; i oko 90 nmol/l do oko 100 nmol/l.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu u vezi sa TCR predmetnog opisa, termin „specifično vezivanje“ i njegove gramatičke varijante koriste se da označe TCR koji ima afinitet vezivanja (KD) za kompleks peptid-HLA molekul od 100 µmol/l ili manje.

Alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu da imaju uvedenu disulfidnu vezu između njihovih konstantnih domena. Poželjni TCR-ovi ovog tipa obuhvataju one koji imaju TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena osim što su Thr 48 TRAC-a i Ser 57 TRBC1-a ili TRBC2-a zamenjeni cisteinskim ostacima, navedeni cisteini obrazuju disulfidnu vezu između TRAC sekvence konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvence konstantnog domena TCR-a.

Sa ili bez uvedene veze između lanaca navedene iznad, alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu imati TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena, a TRAC sekvenca konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvenca konstantnog domena TCR mogu biti povezane prirodnom disulfidnom vezom između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2.

TRC-ovi predmetnog opisa mogu sadržati detektabilnu oznaku izabranu iz grupe koju čine radionuklid, fluorofor i biotin. TRC-ovi predmetnog opisa mogu biti konjugovani za terapeutski aktivan agens, kao što je radionuklid, hemioterapijski agens ili toksin.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa koji ima najmanje jednu mutaciju u alfa lancu i/ili ima najmanje jednu mutaciju u beta lancu ima modifikovanu glikozilaciju u poređenju sa nemutiranim TCR.

U jednom otelotvorenju, TCR koji sadrži najmanje jednu mutaciju u alfa lancu TCR i/ili beta lancu TCR ima afinitet vezivanja za, i/ili poluživot vezivanja za, kompleks peptid-HLA molekul, koji je najmanje dvostruk od afiniteta vezivanja TCR koji sadrži nemutirani alfa lanac TCR i/ili nemutirani beta lanac TCR. Pojačanje afiniteta tumor-specifičnih TCR, i njegovo iskorišćavanje, oslanja se na postojanju prozora za optimalne TCR afinitete. Postojanje takvog prozora zasnovano je na opažanjima da TCR-ovi specifični za HLA-A2-restrikovane patogene imaju KD vrednosti koje su uopšteno oko 10 puta manje u poređenju sa TCR-ovima specifičnim za HLA-A2-restrikovane tumor-asocirane autoantigene. Sada je poznato da će imunski sistem, iako tumorski antigeni imaju potencijal da budu imunogeni, zato što tumori nastaju iz sopstvenih ćelija pojedinca, videti samo mutirane proteine ili proteine sa izmenjenom translacionom obradom kao strane. Antigeni koji su ushodno regulisani ili prekomerno eksprimirani (takozvani autoantigeni) neće nužno indukovati funkcionalni imunski odgovor protiv tumora: T ćelije koje eksprimiraju TCR-ove koji su visoko reaktivni na ove antigene bile su negativno selektovane u timusu tokom procesa koji se zove centralna tolerancija, što znači da ostaju samo T ćelije sa TCR-ovima niskog afiniteta za autoantigene.

U jednom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-alfa i/ili TCR-beta lance predmetnog opisa se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi se stvaraju a zatim testiraju za funkcionalnost, kao što je antigena specifičnost i funkcionalni aviditet. Zatim se alikvot konačnog proizvoda koristi za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćene iz pacijentovih PBMC), koja se ekspandira pre infuzije pacijentu.

U drugom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti sintetišu se TCR RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitro sintetisane TCR RNK se zatim uvode u primarne CD8+ T ćelije dobijene od zdravih donora elektroporacijom u cilju ponovnog eksprimiranja tumor-specifičnih TCR-alfa i/ili TCR-beta lanaca.

Radi povećanja ekspresije, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti operabilno povezane sa snažnim promoterima, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTRs), citomegalovirus (CMV), mišji virus matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK),ꞵ-aktin, ubikvitin, i simijan virus 40 (SV40)/CD43 kompozitni promoter, faktor elongacije (EF)-1a i promoter virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV). U jednom poželjnom otelotvorenju, promoter je heterologan za nukleinsku kiselinu koja se eksprimira.

Pored snažnih promotera, kasete TCR ekspresije predmetnog opisa mogu da sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačaju transgensku ekspresiju, uključujući centralni polipurinski trakt (cPPT), koji promoviše nukleusnu translokaciju lentivirusnih konstrukata (Follenzi et al., 2000), i posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (wPRE), koji povećava nivo transgenske ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).

Alfa i beta lanci TCR-a predmetnog pronalaska mogu da budu kodirani nukleinskim kiselinama koje se nalaze u zasebnim vektorima, ili mogu da budu kodirani polinukleotidima koji se nalaze u istom vektoru.

Postizanje površinske ekspresije TCR-a visokog stepena iziskuje da i TCR-alfa i TCR-beta lanci uvedenog TCR-a budu transkribovani u visokim nivoima. Da bi se to izvelo, TCR-alfa i TCR-beta lanci predmetnog opisa mogu da budu klonirani u bicistronske konstrukte u jednom vektoru, za koji je dokazano da je u stanju da prevaziđe ovu prepreku. Upotreba virusnog mesta vezivanja ribozoma (IRES) između TCR-alfa i TCR-beta lanaca rezultuje koordinisanom ekspresijom oba lanca, zato što se TCR-alfa i TCR-beta lanci stvaraju iz jednog transkripta koji se cepa na dva proteina tokom translacije, čime se osigurava da se proizvodi podjednak molarni odnos TCR-alfa i TCR-beta lanaca. (Schmitt et al.2009).

Nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti kodonski

4

optimizovane da bi se povećala ekspresija iz ćelije domaćina. Obilnost genetskog koda omogućava da neke aminokiseline budu kodirane pomoću više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje „optimalni“ od drugih zbog relativne raspoloživosti podudarnih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004). Pokazano je da modifikacija TCR-alfa i TCR-beta genskih sekvenci tako da svaka aminokiselina bude kodirana optimalnim kodonom za ekspresiju sisarskih gena, kao i eliminacija motiva nestabilnosti iRNK ili mesta kriptičkog cepanja, značajno pojačava ekspresiju TCR-alfa i TCR-beta gena (Scholten et al., 2006).

Pored toga, pogrešno uparivanje uvedenih i endogenih TCR lanaca može rezultovati dobijanjem specifičnosti koje predstavljaju značajan rizik za autoimunost. Na primer, obrazovanje mešovitih TCR dimera može smanjiti broj CD3 molekula dostupnih za obrazovanje pravilno uparenih TCR kompleksa, te stoga može značajno smanjiti funkcionalni aviditet ćelija koje eksprimiraju uvedeni TCR (Kuball et al., 2007).

Da bi se smanjilo pogrešno uparivanje, C-terminalni domen uvedenih TCR lanaca predmetnog opisa može da se modifikuje da bi se promovisao međulančani afinitet, uz smanjenje sposobnosti uvedenih lanaca da se sparuju sa endogenim TCR. Ove strategije mogu da uključuju zamenu humanih TCR-alfa i TCR-beta C-terminalnih domena sa njihovim mišjim antipodima (murinizovani C-terminalni domen); stvaranje druge međulančane disulfidne veze u C-terminalnom domenu uvođenjem drugog ostatka cisteina i u TCR-alfa i u TCR-beta lanac uvedenog TCR (cisteinska modifikacija); zamenjivanje interagujućih ostataka u C-terminalnim domenima TCR-alfa i TCR-beta lanca („knob-in-hole“); i fuziju varijabilnih domena TCR-alfa i TCR-beta lanaca direktno na CD3ζ (CD3ζ fuzija). (Schmitt et al.2009).

U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin se projektuje da eksprimira TCR predmetnog opisa. U poželjnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je humana T ćelija ili progenitorska T ćelija. U nekim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od pacijenta obolelog od raka. U drugim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od zdravog donora. Ćelije domaćini predmetnog opisa mogu da budu alogene ili autologne u odnosu na pacijenta koji će se lečiti. U jednom otelotvorenju, domaćin je gama/delta T ćelija transformisana da eksprimira alfa/beta TCR.

„Farmaceutska smeša“ je smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).

Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (pogledajte ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu -NH2 grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.

U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).

Poželjno, lek za upotrebu predmetnog pronalaska je imunoterapeutik, kao što je vakcina. On se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transficirane tako da koeksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (pogledajte u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (eng. keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i (Longenecker et al., 1993)). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 T ćelija je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 T ćelije, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti, i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.

U jednom aspektu, vakcina za upotrebu sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iznetu u ID BR. SEKV 9 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid za upotrebu pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje vektor ekspresije koji eksprimira peptid za upotrebu u skladu sa pronalaskom.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarnih kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju

4

alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK i sar. (Saiki et al., 1988). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu pronalaska. Tako, DNK koja kodira peptid za upotrebu pronalaska može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one izložene u, na primer, patentima US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira peptid za upotrebu pronalaska može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK pronalaska se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan kod kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takođe dostupan kod kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer, kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.

Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/l u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično ~0,1 mg/l. Prisustvo izvora SV40 replikacije će rezultovati visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMB1

4

(derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za b-laktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor f1. Vektori koji sadrže prepro-tripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica. Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u predmetnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.

U drugom otelotvorenju dva ili više predstavljenih peptida su kodirani i samim tim eksprimirani po sukcesivnom redosledu (slično konstruktima „brojanica“). Pritom, peptidi ili varijante peptida mogu biti povezani ili spojeni zajedno pomoću regija povezujućih aminokiselina, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti povezani bez bilo kakvih dodatnih peptida između njih. Ovi konstrukti mogu takođe da se koriste za antitumorsku terapiju i mogu indukovati imunske odgovore koji uključuju i MHC I i MHC II.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupni kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju ćelije kvasnica, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology

4

Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, rad Cohen et al. (Cohen et al., 1972) i (Green and Sambrook, 2012). Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman et al. (Sherman et al., 1986). Metod koji je izložio Beggs (Beggs, 1978) takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini pronalaska korisne za pripremanje peptida za upotrebu pronalaska, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida za upotrebu pronalaska tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.

U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog raka prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

4

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje metod za proizvodnju peptida za upotrebu, pri čemu metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid može biti pripremljen za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., 2012).

Polinukleotid koji se koristi za aktivnu vakcinaciju može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. Teufel i sar. (Teufel et al., 2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Lek za upotrebu pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više adjuvanasa. Adjuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imunski odgovor (npr. imunske odgovore posredovane CD8-pozitivnim T ćelijama i pomoćničkim T (TH) ćelijama na antigen, i na taj način se smatraju korisnim u leku predmetnog pronalaska. Pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu i ograničeni na, 1018 ISS, soli aluminijuma, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene od flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30,

4

IC31, imikvimod (ALDARA®), rezikvimod, ImuFact IMP321, interleukine poput IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® vektorski sistem, poli(laktid ko-glikolid) [PLG]-zasnovane i mikročestice dekstrana, talaktoferin, SRL172, virozome i druge virusu slične partikule, YF-17D, VEGF klopku, R848, beta-glukan, Pam3Cys, QS21 stimulon kompanije Aquila, koji je dobijen od saponina, mikobakterijske ekstrakte i sintetičke mimetike bakterijskog ćelijskog zida i druge zaštićene adjuvanse kao što su Ribi-jev Detox, Quil ili Superfos. Preferirani su adjuvansi kao što je Freund-ov ili GM-CSF. Nekoliko imunoloških adjuvanasa (npr. MF59) specifičnih za dendritične ćelije i njihova priprema su opisani ranije (Allison i Krummel, 1995). Takođe, mogu se koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno dovedeno u vezu sa uticajem na migraciju dendritičnih ćelija u limfna tkiva (npr. TNF-), ubrzavanjem sazrevanja dendritičnih ćelija u efikasne antigen-prezentujuće ćelije za T limfocite (npr. GM-CSF, IL-1 i IL-4) (patent registrovan u SAD pod brojem 5,849,589) i delovanjem kao imunoadjuvansi (npr. IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

Takođe, objavljeno je da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poboljšavaju efekte adjuvanasa u sastavu vakcine. Bez ograničavanja postojećom teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem urođenog (neadaptivnog) imunskog sistema preko Toll-like receptora (TLR), uglavnom TLR9. Aktivacija TLR9 pokrenuta CpG-om pojačava antigen-specifične humoralne i ćelijske odgovore na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske antigene, žive ili mrtve viruse, vakcine dendritičnim ćelijama, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate kako u profilaktičkim tako i terapijskim vakcinama. Što je važnije, on poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritičnih ćelija, što dovodi do pojačane aktivacije TH1 ćelija i snažnog stvaranja citotoksičnih T limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T ćelija. Predominacija TH1 indukovana pomoću TLR9 stimulacije se održava čak i u prisustvu adjuvanasa u vakcini kao što je aluminijum ili nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) koji normalno promovišu predominaciju TH2. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću adjuvansnu aktivnost kada se formulišu ili istovremeno

4

primenjuju sa drugim adjuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su naročito neophodne za indukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imunski odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitelima na punu dozu vakcine bez CpG u pojedinim eksperimentima (Krieg, 2006). Patent US 6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, adjuvanasa u obliku nenukleinskih kiselina i antigena za indukovanje antigen-specifičnog imunskog odgovora. Antagonist CpG TLR9 je dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) kompanije Mologen (Berlin, Nemačka) koji je preferirana komponenta farmaceutske smeše predmetnog pronalaska. Takođe, mogu se koristiti i drugi molekuli koji vezuju TLR kao što su RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.

Drugi primeri korisnih adjuvanasa uključuju, ali nisu i ograničeni na, hemijski modifikovane CpG-jeve (npr. CpR, Idera), analoge dsRNK kao što su Poly(I:C) i njegovi derivati (npr. AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ne-CpG bakterijska DNK ili RNK kao i imunoaktivne male molekule i antitela poput ciklofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab®-a, celebrex-a, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafeniba, temozolomida, temsirolimusa, XL-999, CP-547632, pazopaniba, VEGF klopke, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, druga antitela koja ciljaju ključne strukture imunskog sistema (npr. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mogu delovati terapijski i/ili kao adjuvans. Količine i koncentracije adjuvanasa i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska, stručnjak iz ove oblasti može lako da utvrdi bez izvođenja suvišnih eksperimenata.

Poželjni adjuvansi su anti-CD40, imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši za upotrebu u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši za upotrebu u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda i rezikvimoda. U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše za upotrebu u skladu sa pronalaskom, adjuvans je ciklofosfamid, imikvimod ili rezikvimod. Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.

Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, rastvarača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta iz A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253.

Važno je da se razume da imunski odgovor izazvan vakcinom za upotrebu u skladu sa pronalaskom napada maligni tumor u različitim ćelijskim fazama i različitim stadijumima razvoja. Pored toga napadaju se i različiti signalni putevi povezani sa malignim tumorom. Ovo je prednost u odnosu na vakcine koje ciljaju samo jedan ili nekoliko ciljeva, što može dovesti do toga da se tumor lako adaptira na napad (izbegavanje tumora). Pored toga, ne eksprimiraju svi pojedinačni tumori isti obrazac antigena. Zbog toga, kombinacija nekoliko tumor-asociranih peptida osigurava da svaki pojedinačan tumor nosi najmanje neki od ciljeva. Smeša je dizajnirana na takav način da se očekuje da svaki tumor eksprimira nekoliko antigena i pokriva nekoliko nezavisnih puteva neophodnih za rast i održavanje tumora. Tako, vakcina se lako može koristiti „iz zaliha“ za veću populaciju pacijenata. Ovo znači da prethodna selekcija pacijenata koji će biti lečeni vakcinom može da se ograniči na HLA tipizaciju, ne zahteva bilo kakve dodatne procene biomarkera za ekspresiju antigena, ali se i dalje osigurava da nekoliko ciljeva bude napadnuto istovremeno od strane indukovanog imunskog odgovora, što je važno za efikasnost (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

1

Peptid za upotrebu predmetnog pronalaska može da se koristi za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.

Zato, dalji aspekt pronalaska je obezbeđivanje metoda za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.

Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i publikacijama (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).

Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetnog pronalaska takođe smatra „specifičnim“.

2

Predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 9, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u medicini.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid za upotrebu u skladu sa pronalaskom koji ima sposobnost da se veže za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid za upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačen time što peptid sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačene time što je peptid deo fuzionog proteina, koji sadrži N-terminalne 80 aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenjivog lanca (Ii).

Drugo otelotvorenje predmetnog pronalaska odnosi se na peptid za upotrebu koji se ne javlja u prirodi, naznačen time što navedeni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV: 9 i koji je sintetički proizveden (npr. sintetisan) u vidu farmaceutski prihvatljive soli. Metodi sintetičke proizvodnje peptida dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Soli peptida za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno se razlikuju od peptida u njegovom stanju in vivo, zato što peptid stvoren in vivo nije so. Peptid u obliku neprirodne soli posreduje u rastvorljivosti peptida, konkretno u kontekstu farmaceutskih smeša koje sadrže peptide za upotrebu, npr. peptidne vakcine za upotrebu predstavljene u ovom dokumentu. Neophodna je dovoljna i barem značajna rastvorljivost peptida da bi se ispitaniku koji se leči efikasno obezbedili peptidi. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida za upotrebu. Ove soli u skladu sa pronalaskom obuhvataju alkalne i zemnoalkalne soli kao što su soli Hofmeister serije koja sadrži kao anjone PO4<3->, SO4<2->, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN<->i kao katjone NH4<+>, Rb<+>, K<+>, Na<+>, Cs<+>, Li<+>, Zn<2+>, Mg<2+>, Ca<2+>, Mn<2+>, Cu<2+>i Ba<2+>. Soli su konkretno izabrane od (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4),, Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2i Ba(SCN)2. Naročito poželjne su NH acetat, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl i CaCl2, kao, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli.

Uopšteno, peptidi (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas et al. (Lukas et al., 1981) i referencama koje su tamo citirane. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetilfenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih prethodno formiranih simetričnih anhidridnih derivata, sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog kuplovanja posredstvom N, N-dicikloheksil-karbodiimida/1 hidroksibenzotriazola. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se

4

sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, (rad Bruckdorfer et al., 2004) i reference koje su tamo citirane).

Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptid za upotrebu u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini, konkretno u lečenju raka jednjaka.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod za proizvodnju peptida za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 9.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predstavljena je upotreba bilo kog opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili aktiviranog citotoksičnog T limfocita u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv malignog tumora.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek vakcina. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv malignog tumora.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije malignog tumora ćelije raka jednjaka ili ćelije drugih solidnih ili hematoloških tumora kao što su rak pluća, rak mokraćne bešike, rak jajnika, melanom, rak materice, hepatocelularni karcinom, rak bubrežnih ćelija, maligni tumor mozga, kolorektalni karcinom, rak dojke, rak želuca, rak pankreasa, rak žučne kese, rak žučnih puteva, rak prostate i leukemija.

Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti (npr. CDR-ovi, Fv, Fab i Fc fragmenti) ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog (poli)peptida raka jednjaka, isporučivanje toksina ćeliji raka jednjaka koja eksprimira markerski gen za karcinom u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida raka jednjaka) u skladu sa pronalaskom.

Kad god je to moguće, antitela pronalaska mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela pronalaska mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela pronalaska mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za rak jednjaka kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela pronalaska može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.

Na primer, cDNK koja kodira peptid za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV: 9, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasnice, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za rak jednjaka koji se koristi za stvaranje antitela u skladu sa pronalaskom.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela pogledajte, npr. rad Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, ili Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka malignog tumora fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.

Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (US 4,816,567).

Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.

Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu US 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).

Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u patentima WO 94/29348 i US 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.

Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disuflidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.

Antitela pronalaska mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR-a nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR-a ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.

Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti.

Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR-ova ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. Saglasno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (US 4,816,567), naznačena time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućim sekvencama iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira spojni region teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultuje kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.

Antitela pronalaska se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.

Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.

Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela, koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Nakon primene antitela, poželjno za tretiranje raka jednjaka, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija malignog tumora kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje malignog tumora.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja komplementarne determinišuće regione. U svrhu odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite, na primer, patent US 2013/0115191), domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer. Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO

1

2004/074322A1. Kombinacija sTCR opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.

Pored toga, peptidi i/ili TCR-ovi ili antitela ili drugi vezujući molekuli predmetnog pronalaska mogu da se koriste da se potvrdi dijagnoza raka patologa na osnovu bioptiranog uzorka.

Antitela ili TCR-ovi se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za vanćelijske domene dva ili više ciljeva proteina izabranih iz grupe koju čine gore navedeni proteini, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1x10 µmol/l.

Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.

Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je

2

dovoljan da se T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.

Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.

Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985).

Poželjno, pre transfekcije ćelija domaćin značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje kostimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i kostimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.

U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivne T ćelije.

Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 9.

Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje T ćelija in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Piebanski i sar. (Piebanski et al., 1995) upotrebili su autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje T ćelija. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih T ćelija pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih T ćelija mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih T ćelija. S. Walter i sar. (Walter et al., 2003) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnom pronalasku, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa kostimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin-12.

Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga, mogu se koristiti biljni virusi (vidite, na primer, rad Porta i sar. (Porta et al., 1994) koji opisuje razvoj mozaičkog virusa kravljeg graška kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.

Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida za upotrebu pronalaska korisne su u terapiji. Tako, dalji aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima pronalaska.

Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 9.

Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da

4

ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.

In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).

T ćelije predmetnog pronalaska mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Stoga, predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kao što je definisano ranije.

Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa nivoima ekspresije u normalnim (zdravim) tkivima, ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran’’ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih.

Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Pregledi se mogu naći u: Gattioni et al. i Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Drugi aspekt predmetnog pronalaska obuhvata upotrebu peptida za upotrebu koji je u kompleksu sa MHC za stvaranje T-ćelijskog receptora čija nukleinska kiselina je klonirana i uvedena u ćeliju domaćina, poželjno T ćeliju. Ova stvorena T ćelija može zatim da se prenese u pacijenta radi lečenja raka.

Svaki molekul pronalaska, tj. peptid za upotrebu, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirana T ćelija, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato, svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).

Predstavljen je komplet koji se sastoji od:

(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i

(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) rastvarač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.

Predstavljeni kompleti se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži/e uputstva o ili u vezi sa posudom koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.

Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr. 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni razblaživač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).

Nakon mešanja razblaživača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75 µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500 µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rablaživače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.

Predstavljeni kompleti mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.

Poželjno, predstavljeni kompleti obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.

Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd.) koji omogućava primenu predstavljenih agenasa koji su komponente predmetnog kompleta.

Predmetna formulacija je jedna koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. primena može biti pomoću infuzione pumpe.

Budući da je peptid za upotrebu pronalaska izolovan iz raka jednjaka, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje raka jednjaka.

U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP-ova) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta; i (b) biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo u tački (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.

Vakcina se proizvodi kada se izaberu peptidi za personalizovanu vakcinu zasnovanu na peptidima. Vakcina je poželjno tečna formulacija koja sadrži pojedinačne peptide rastvorene u između 20–40% DMSO, poželjno oko 30–35% DMSO, kao što je oko 33% DMSO.

Svaki peptid koji će biti uključen u proizvod se rastvara u DMSO. Koncentracija rastvora pojedinačnih peptida treba da se izabere u zavisnosti od broja peptida koji će biti uključeni u proizvod. Rastvori pojedinačan peptid-DMSO se mešaju u jednakim delovima kako bi se dobio rastvor koji sadrži sve peptide koji treba da budu uključeni u proizvod sa koncentracijom od ~2,5 mg/ml po peptidu. Pomešani rastvor se zatim razblažuje u odnosu 1:3 sa vodom za injekcije kako bi se dobila koncentracija od 0,826 mg/ml po peptidu u 33% DMSO. Razblaženi rastvor se filtrira kroz sterilni filter veličine 0,22 µm. Dobijen je konačan ukupni rastvor.

Konačni ukupni rastvor se puni u bočice i čuva na -20 °C do upotrebe. Jedna bočica sadrži 700 µl rastvora koji sadrži 0,578 mg svakog peptida. Od toga će 500 µl (oko 400 µg po peptidu) biti primenjeno za intradermalnu injekciju.

Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima koji opisuju njegova poželjna otelotvorenja, i uz upućivanje na pridružene slike, ali to neće biti ograničeno na ovde navedeno.

SLIKE

Na slikama 1A do 1V prikazana je prekomerna prezentacija različitih peptida u normalnim tkivima (beli stupci) i malignom tumoru jednjaka (crni stupci). A) Simbol gena: KRT14/KRT16, peptid: STYGGGLSV (ID BR. SEKV: 1) Tkiva s leva u desno: 1 masno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 8 arterija, 5 kostnih srži, 7 mozgova, 5 dojki, 2 hrskavice, 1 centralni nerv, 13 kolona, 1 duodenum, 2 žučne kese, 5 srca, 14 bubrega, 21 jetra, 44 pluća, 4 limfna čvora, 4 uzorka leukocita, 3 jajnika, 8 pankreasa, 5 perifernih nerava, 1 peritoneum, 3 hipofize, 4 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 rektuma, 7 pljuvačnih žlezdi, 4 skeletna mišića, 6 koža, 2 tanka creva, 4 slezine, 5 želudaca, 6 testisa, 3 timusa, 3 štitaste žlezde, 7 traheja, 2 uretera, 6 mokraćnih bešika, 2 materice, 2 vene, 6 jednjaka, 16 uzoraka malignog tumora jednjaka. Peptid je dodatno detektovan kod 4/91 malignih tumora pluća. Slika 1B) Simbol gena: GJB5, peptid: SIFEGLLSGV (ID BR. SEKV: 7). Tkiva s leva u desno: 1 masno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 8 arterija, 5 kostnih srži, 7 mozgova, 5 dojki, 2 hrskavice, 1 centralni nerv, 13 kolona, 1 duodenum, 2 žučne kese, 5 srca, 14 bubrega, 21 jetra, 44 pluća, 4 limfna čvora, 4 uzorka leukocita, 3 jajnika, 8 pankreasa, 5 perifernih nerava, 1 peritoneum, 3 hipofize, 4 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 rektuma, 7 pljuvačnih žlezdi, 4 skeletna mišića, 6 koža, 2 tanka creva, 4 slezine, 5 želudaca, 6 testisa, 3 timusa, 3 štitaste žlezde, 7 traheja, 2 uretera, 6 mokraćnih bešika, 2 materice, 2 vene, 6 jednjaka, 16 uzoraka malignog tumora jednjaka. Peptid je dodatno detektovan kod 1/43 malignih tumora prostate, 1/3 maligna tumora žučne kese, 1/20 malignih tumora jajnika, 5/91 malignog tumora pluća i 1/4 maligna tumora mokraćne bešike. Slika 2C) Simbol gena: PKP3, peptid: SLVSEQLEPA (ID BR. SEKV: 34). Tkiva s leva u desno: 1 masno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 8 arterija, 5 kostnih srži, 7 mozgova, 5 dojki, 2 hrskavice, 1 centralni nerv, 13 kolona, 1 duodenum, 2 žučne kese, 5 srca, 14 bubrega, 21 jetra, 44 pluća, 4 limfna čvora, 4 uzorka leukocita, 3 jajnika, 8 pankreasa, 5 perifernih nerava, 1 peritoneum, 3 hipofize, 4 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 rektuma, 7 pljuvačnih žlezdi, 4 skeletna mišića, 6 koža, 2 tanka creva, 4 slezine, 5 želudaca, 6 testisa, 3 timusa, 3 štitaste žlezde, 7 traheja, 2 uretera, 6 mokraćnih bešika, 2 materice, 2 vene, 6 jednjaka, 16 uzoraka malignog tumora jednjaka. Peptid je dodatno detektovan kod 8/24 kolorektalna maligna tumora, 1/20 malignih tumora jajnika, 1/46 malignih tumora želuca, 5/91 malignog tumora pluća i 2/4 maligna tumora mokraćne bešike. Slika 3D) Simbol gena: RNPEP, peptid: YTQPFSHYGQAL (ID BR. SEKV: 37). Tkiva s leva u desno: 1 masno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 8 arterija, 5 kostnih srži, 7 mozgova, 5 dojki, 2 hrskavice, 1 centralni nerv, 13 kolona, 1 duodenum, 2 žučne kese, 5 srca, 14 bubrega, 21 jetra, 44 pluća, 4 limfna čvora, 4 uzorka leukocita, 3 jajnika, 8 pankreasa, 5 perifernih nerava, 1 peritoneum, 3 hipofize, 4 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 rektuma, 7 pljuvačnih žlezdi, 4 skeletna mišića, 6 koža, 2 tanka creva, 4 slezine, 5 želudaca, 6 testisa, 3 timusa, 3 štitaste žlezde, 7 traheja, 2 uretera, 6 mokraćnih bešika, 2 materice, 2 vene, 6 jednjaka, 16 uzoraka malignog tumora jednjaka. Peptid je dodatno detektovan kod 1/19 malignih tumora pankreasa, 7/46 malignih tumora želuca i 1/91 malignog tumora pluća. Slika 4E) Simbol gena: NUP155, peptid: ALQEALENA (ID BR. SEKV: 80). Uzorci s leva u desno: 4 ćelijske linije (1 bubrega, 1 pankreasa, 1 prostate, 1 mijeloidne leukemije), 3 normalna tkiva (1 pluće, 1 prostata, 1 tanko crevo), 47 malignih tkiva (5 malignih tumora mozga, 2 maligna tumora dojke, 1 maligni tumor kolona, 2 maligna tumora jednjaka, 1 hronična leukocitna leukemija, 2 maligna tumora jetre, 22 maligna tumora pluća, 7 malignih tumora jajnika, 4 maligna tumora prostate, 1 maligni tumor rektuma). Slika 5F) Simbol gena: KRT5, peptid: SLYNLGGSKRISI (ID BR. SEKV: 2). Tkiva s leva u desno: 20 malignih tkiva (9 malignih tumora glave i vrata, 2 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor jednjaka i želuca, 7 malignih tumora pluća, 1 maligni tumor mokraćne bešike). Slika 6G) Simbol gena: KRT5, peptid: TASAITPSV (ID BR. SEKV: 3). Tkiva s leva u desno: 17 malignih tkiva (2 maligna tumora jednjaka, 6 malignih tumora glave i vrata, 7 malignih tumora pluća, 2 maligna tumora mokraćne bešike). Slika 7H) Simbol gena: S100A2, peptid: SLDENSDQQV (ID BR. SEKV: 10). Tkiva s leva u desno: 7 malignih tkiva (3 maligna tumora glave i vrata, 2 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor pluća, 1 maligni tumor mokraćne bešike). Slika 8I) Simbol gena: LAMB3, peptid: ALWLPTDSATV (ID BR. SEKV: 11). Tkiva s leva u desno: 12 malignih tkiva (2 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 8 malignih tumora pluća, 1 maligni tumor kože). Slika 9J) Simbol gena: IL36RN, peptid: SLSPVILGV (ID BR. SEKV: 13). Tkiva s leva u desno: 26 malignih tkiva (8 malignih tumora glave i vrata, 3 maligna tumora jednjaka, 10 malignih tumora pluća, 3 maligna tumora kože, 1 maligni tumor mokraćne bešike, 1 maligni tumor materice). Slika 10K) Simbol gena: ANO1, peptid: LLANGVYAA (ID BR. SEKV: 15). Tkiva s leva u desno: 8 malignih tkiva (2 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 1 maligni tumor jetre, 1 maligni tumor pluća, 1 maligni tumor želuca, 1 maligni tumor mokraćne bešike, 1 maligni tumor materice). Slika 11L) Simbol gena: F7, IGHV4-31, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHM, peptid: MISRTPEV (ID BR. SEKV: 17). Tkiva s leva u desno: 19 malignih tkiva (2 maligna tumora jednjaka, 2 maligna tumora bubrega, 2 maligna tumora jetre, 9 malignih tumora pluća, 1 maligni tumor limfnog čvora, 1 maligni tumor testisa, 2 maligna tumora mokraćne bešike). Slika 12M) Simbol gena: QSER1, peptid: SLNGNQVTV (ID BR. SEKV: 30). Tkiva s leva u desno: 1 ćelijska linija (1 pankreasa), 14 malignih tkiva (1 maligni tumor glave i vrata, 1 maligni tumor žučnih puteva, 1 maligni tumor mozga, 1 maligni tumor dojke, 1 maligni tumor jednjaka, 1 maligni tumor bubrega, 1 maligni tumor pluća, 2 maligna tumora kože, 3 maligna tumora mokraćne bešike, 2 maligna tumora materice). Slika 13N) Simbol gena: HAS3, peptid: YMLDIFHEV (ID BR. SEKV: 32). Tkiva s leva u desno: 1 normalno tkivo (1 materica), 15 malignih tkiva (1 maligni tumor mozga, 2 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 3 maligna tumora glave i vrata, 4 maligna tumora pluća, 4 maligna tumora mokraćne bešike). Slika 14O) Simbol gena: PKP3, peptid: SLVSEQLEPA (ID BR. SEKV: 34). Tkiva s leva u desno: 1 ćelijska linija (1 pankreasa), 1 normalno tkivo (1 kolon), 28 malignih tkiva (6 malignih tumora glave i vrata, 1 maligni tumor dojke, 1 maligni tumor cekuma, 3 maligna tumora kolona, 1 kolorektalni maligni tumor, 3 maligna tumora jednjaka, 6 malignih tumora pluća, 1 maligni tumor jajnika, 3 maligna tumora rektuma, 3 maligna tumora mokraćne bešike). Slika 15P) Simbol gena: SERPINH1, peptid: GLAFSLYQA (ID BR. SEKV: 40). Tkiva s leva u desno: 3 ćelijske linije (1 bubrega, 2 pankreasa), 4 normalna tkiva (1 nadbubrežna žlezda, 1 pluće, 2 placente), 41 maligno tkivo (3 maligna tumora glave i vrata, 3 maligna tumora dojke, 2 maligna tumora kolona, 2 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 1 maligni tumor jetre, 15 malignih tumora pluća, 1 maligni tumor jajnika, 1 maligni tumor pankreasa, 3 maligna tumora rektuma, 2 maligna tumora kože, 1 maligni tumor želuca, 4 maligna tumora mokraćne bešike, 2 maligna tumora materice). Slika 1Q) Simbol gena: TMEM132A, peptid: ALVEVTEHV (ID BR. SEKV: 56). Tkiva s leva u desno: 7 normalnih tkiva (5 pluća, 1 štitasta žlezda, 1 traheja), 64 maligna tkiva (6 malignih tumora glave i vrata, 12 malignih tumora mozga, 4 maligna tumora dojke, 3 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 5 malignih tumora bubrega, 21 maligni tumor pluća, 1 maligni tumor limfnog čvora, 7 malignih tumora jajnika, 1 maligni tumor pankreasa, 1 maligni tumor kože, 2 maligna tumora materice). Slika 2R) Simbol gena: PRC1, peptid: GLAPNTPGKA (ID BR. SEKV: 57). Tkiva s leva u desno: 14 malignih tkiva (1 maligni tumor glave i vrata, 1 maligni tumor dojke, 2 maligna tumora jednjaka, 6 malignih tumora pluća, 1 maligni tumor jajnika, 1 maligni tumor kože, 1 maligni tumor mokraćne bešike, 1 maligni tumor materice). Slika 3S) Simbol gena: MAPK6, peptid: LILESIPVV (ID BR. SEKV: 58). Tkiva s leva u desno: 2 ćelijske linije (1 krvne ćelije, 1 kože), 25 malignih tkiva (5 malignih tumora glave i vrata, 1 maligni tumor kolona, 2 maligna tumora jednjaka, 1 leukocitna leukemija, 8 malignih tumora pluća, 2 maligna tumora limfnog čvora, 3 maligna tumora kože, 2 maligna tumora mokraćne bešike, 1 maligni tumor materice). Slika 4T) Simbol gena: PPP4R1, peptid: SLLDTLREV (ID BR. SEKV: 59). Tkiva s leva u desno: 1 normalno tkivo (1 tanko crevo), 8 malignih tkiva (1 maligni tumor glave i vrata, 2 maligna tumora jednjaka, 4 maligna tumora pluća, 1 maligni tumor jajnika). Slika 5U) Simbol gena: TP63, peptid:

1

VLVPYEPPQV (ID BR. SEKV: 77). Tkiva s leva u desno: 2 normalna tkiva (1 jednjak, 1 traheja), 47 malignih tkiva (8 malignih tumora glave i vrata, 4 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor žučne kese, 14 malignih tumora pluća, 7 malignih tumora limfnog čvora, 2 maligna tumora prostate, 1 maligni tumor kože, 8 malignih tumora mokraćne bešike). Slika 6V) Simbol gena: KIAA0947, peptid: AVLPHVDQV (ID BR. SEKV: 81). Tkiva s leva u desno: 3 ćelijske linije (1 krvne ćelije, 1 pankreasa), 12 malignih tkiva (5 malignih tumora mozga, 2 maligna tumora jednjaka, 1 maligni tumor pluća, 3 maligna tumora limfnog čvora, 1 maligni tumor materice).

Na slikama 2A do D prikazani su primerni profili ekspresije ovde predstavljenih izvornih gena koji su visoko prekomerno eksprimirani ili ekskluzivno eksprimirani u malignom tumoru jednjaka u panelu normalnih tkiva (beli stupci) i 11 uzoraka malignog tumora jednjaka (crni stupci). Tkiva s leva u desno: 7 arterija, 1 mozak, 1 srce, 2 jetre, 2 pluća, 2 vene, 1 masno tkivo, 1 nadbubrežna žlezda, 4 kostne srži, 1 kolon, 2 jednjaka, 2 žučne kese, 1 bubreg, 6 limfnih čvorova, 1 pankreas, 1 hipofiza, 1 rektum, 1 skeletni mišić, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 timus, 1 štitasta žlezda, 5 traheja, 1 mokraćna bešika, 1 dojka, 3 jajnika, 3 placente, 1 prostata, 1 testis, 1 materica, 11 uzoraka malignog tumora jednjaka. Slika 2A) Simbol gena: PTHLH; Slika 2B) Simbol gena: KRT14; Slika 2C) Simbol gena: FAM83A; Slika 2D) Simbol gena: PDPN.

Na slikama 3A do E prikazani su primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*02+ donora, tj. primerni podaci o imunogenosti: rezultati protočne citometrije nakon bojenja peptid-specifičnog multimera. Slika 3A) Simbol gena: SF3B3, peptid: ELDRTPPEV (ID BR. SEKV: 97); Slika 3B) Simbol gena: TNC, peptid: AMTQLLAGV (ID BR. SEKV: 101). Takođe, CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*02 u kompleksu sa peptidom ID BR. SEKV: 5 (C, levi panel), peptidom ID BR. SEKV: 2 (D, levi panel) odnosno peptidom ID BR. SEKV: 77 (E, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*02/ID br. sekv. 5 (C), A*02/ID br. sekv. 2 (D) ili A*02/ID br. sekv. 77 (E). Desni paneli (C, D i E) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*02/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažnopozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide.

2

Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

PRIMERI

PRIMER 1

Identifikacija i kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Uzorci tkiva

Tkiva tumora pacijenata dobijena su od Asterand (Detroit, SAD i Royston, Herts, UK); ProteoGenex Inc., (Culver City, CA, SAD); Tissue Solutions Ltd. (Glazgov, UK); Univerzitetske bolnice u Tibingenu. Normalna tkiva dobijena su od Asterand (Detroit, SAD i Royston, Herts, UK); Bio-Options Inc. (CA, SAD); BioServe (Beltsville, MD, SAD); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, SAD); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD); Univerzitetske bolnice u Ženevi; Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu; Prefekturalnog medicinskog univerziteta u Kjotou (KPUM); Univerzitetske bolnice u Minhenu; ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SAD); Univerzitetske bolnice u Tibingenu; Tissue Solutions Ltd. (Glazgov, UK). Pre operacije ili autopsije, od svih pacijenata je pribavljen pisani informisani pristanak. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem neposredno nakon ekscizije i uskladištena na -70 °C ili manje do izolacije TUMAP.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

Pulovi HLA peptida iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem dobijeni su imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva u skladu sa blago modifikovanim protokolom (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) primenom HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranja kiselinom i ultrafiltracije.

Analize masenom spektrometrijom

Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverzno-fazne hromatografije (nanoAcquity UPLC sistem, Waters) a eluirani peptidi su analizirani u LTQ-velos i fuzionim hibridnim masenim spektrometrima (ThermoElectron) opremljenim ESI izvorom. Pulovi peptida su direktno postavljeni na analitičku mikrokapilarnu kolonu od fuzirane silike (75 µm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1,7 µm C18 reverzno-faznim materijalom (Waters) uz primenu brzine protoka od 400 nl u minutu. Nakon toga, peptidi su izdvojeni primenom dvostepenog 180-minutnog binarnog gradijenta iz 10% do 33% B pri brzini protoka od 300 nl u minutu. Gradijent su činili rastvarač A (0,1% mravlja kiselina u vodi) i rastvarač B (0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, New Objective) je korišćena za uvođenje u nanoESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometri su radili u režimu zavisnom od podataka primenom strategije TOP5 (5 najvećih). Ukratko, iniciran je ciklus skeniranja sa kompletnim skeniranjem visoke masene preciznosti u Orbitrap (R = 30000), što je bilo praćeno MS/MS skeniranjima takođe u Orbitrap (R = 7500) na 5 najzastupljenijih prekursorskih jona sa dinamičkim isključivanjem prethodno odabranih jona. Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću SEQUEST i dodatnom ručnom kontrolom. Identifikovana peptidna sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog peptida sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence.

Relativna LC-MS kvantifikacija bez obeležavanja izvršena je pomoću brojanja jona tj. ekstrakcijom i analizom LC-MS karakteristika (Mueller et al., 2007). Metod pretpostavlja da oblast LC-MS signala peptida korelira sa njegovom obilnošću u uzorku. Ekstrahovane karakteristike su dalje obrađene pomoću dekonvolucije naelektrisanog stanja i poravnanja vremena zadržavanja ((Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Na kraju, sve LC-MS karakteristike su referencirane sa rezultatima identifikacije sekvence kako bi se kvantitativni podaci od različitih uzoraka i tkiva kombinovali u profile prezentacije peptida. Kvantitativni podaci su normalizovani na dvostepeni način u skladu sa centralnom tendencijom kako bi se uračunala varijacija u okviru tehničkih i bioloških replikata. Tako svaki identifikovani peptid može biti povezan sa kvantitativnim podacima što omogućava relativnu kvantifikaciju između uzoraka i tkiva. Pored toga, svi kvantitativni podaci dobijeni za peptidne kandidate su ručno pregledani kako bi se osigurala doslednost podataka i potvrdila tačnost automatizovane analize. Za svaki peptid je izračunat profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijacije replikata. Profili postavljaju jedno uz drugo uzorke malignog tumora jednjaka sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva.

Profili prezentacije primernih prekomerno prezentovanih peptida prikazani su na

4

slici 1. Rezultati prezentacije za primerne peptide prikazani su u tabeli 8.

Tabela 8: Rezultati prezentacije. U tabeli su navedeni peptidi koji su veoma visoko prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+). Panel normalnih tkiva se sastojao od: masnog tkiva, nadbubrežne žlezde, arterije, vene, kostne srži, mozga, centralnog i perifernog nerva, kolona, rektuma, tankog creva uklj. duodenum, jednjaka, žučne kese, srca, bubrega, jetre, pluća, limfnog čvora, mononuklearnih belih krvnih ćelija, pankreasa, peritoneuma, hipofize, pleure, pljuvačne žlezde, skeletnog mišića, kože, slezine, želuca, timusa, štitaste žlezde, traheje, uretera, mokraćne bešike.

PRIMER 2

Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju ovde predstavljene peptide Prekomerna prezentacija ili specifična prezentacija peptida na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama je dovoljna za njihovu korisnost u imunoterapiji, a neki peptidi su tumor-specifični iako se njihov izvorni protein takođe javlja u normalnim tkivima. Ipak, profiliranje ekspresije iRNK dodaje dodatni nivo bezbednosti u izboru peptidnih ciljeva za imunoterapije. Naročito za terapijske opcije sa visokim rizicima u pogledu bezbednosti, kao što su afinitetno sazreli TCR-ovi, idealni ciljni peptid će biti dobijen od proteina koji je jedinstven za tumor i ne nalazi se na normalnim tkivima.

RNK izvori i priprema

Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su kako je navedeno ranije (pogledajte primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani avanom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.

Ukupna RNK iz tumorskog tkiva za RNASeq eksperimente dobijena je od: ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SAD); Tissue Solutions Ltd. (Glazgov, UK).

Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva za RNASeq eksperimente dobijena je od: Asterand (Detroit, SAD i Royston, Herts, UK); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SAD); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SAD); Istituto Nazionale Tumori „Pascale“, Molecular Biology and Viral Oncology Unit (Jedinica za molekularnu biologiju i virusnu onkologiju) (IRCCS) (Napulj, Italija); Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu (Nemačka); BioCat GmbH (Hajdelberg, Nemačka).

Kvalitet i kvantitet svih uzoraka RNK procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).

RNAseq eksperimenti

Analiza genske ekspresije uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je pomoću sekvenciranja naredne generacije (RNAseq) kompanije CeGaT (Tibingen, Nemačka). Ukratko, biblioteke za sekvenciranje pripremljene su pomoću Illumina HiSeq v4 kompleta reagenasa u skladu sa protokolom dobavljača (Illumina Inc, San Diego, CA, SAD), koji uključuje fragmentaciju RNK, konverziju cDNK i dodavanje adaptora za sekvenciranje. Biblioteke izvedene iz višestrukih uzoraka mešaju se ekvimolarno i sekvenciraju na aparatu za sekvenciranje Illumina HiSeq 2500 prema uputstvima proizvođača, generišući jednostruka krajnja očitavanja od 50 bp. Obrađena očitavanja se mapiraju na humanom genomu (GRCh38) pomoću STAR softvera. Podaci o ekspresiji se obezbeđuju na nivou transkripta kao RPKM (očitavanja po kilobazi na milion mapiranih očitavanja, koja generiše softver Cufflinks) i na nivou egzona (ukupna očitavanja, koja generiše softver Bedtools), na osnovu beleški Ensembl baze podataka o sekvencama (Ensembl77). Egzon očitavanja se normalizuju za dužinu egzona i veličinu poravnanja da bi se dobile RPKM vrednosti.

Primerni profili ekspresije ovde predstavljenih izvornih gena koji su visoko prekomerno eksprimirani ili isključivo eksprimirani u malignom tumoru jednjaka prikazani su na slici 2. Rezultati ekspresije za dalje primerne gene prikazani su u tabeli 9.

Tabela 9: Rezultati ekspresije. U tabeli su navedeni peptidi iz gena koji su veoma visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+). Početna vrednost za ovaj skor izračunata je iz merenja sledećih normalnih tkiva: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak, kolon, jednjak, žučna kesa, srce, bubreg, jetra, pluće, limfni čvor, pankreas, hipofiza, rektum, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, timus, štitasta žlezda, traheja, mokraćna bešika, vena.

PRIMER 3

In vitro imunogenost za MHC klasa I-prezentovane peptide

Da bi se dobile informacije u pogledu imunogenosti predstavljenih TUMAP, pronalazači su sproveli ispitivanja pomoću eseja za in vitro prajming T ćelija zasnovanog na ponovljenim stimulacijama CD8+ T ćelija sa veštačkim antigenprezentujućim ćelijama (aAPĆ) napunjenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način istraživači su mogli da pokažu imunogenost za HLA-A*0201-restrikovane TUMAP pronalaska, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije (tabela 10).

In vitro priprema CD8+ T ćelija

Da bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, pronalazači su prvo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*02 putem pozitivne selekcije primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka) zdravih donora dobijenih iz Univerzitetskih klinika u Manhajmu, Nemačka, nakon pribavljanja informisanog pristanka.

PBMC i izolovani CD8+ limfociti su inkubirani do primene u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Cologne, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U ovom koraku, u TCM je takođe dodato 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nurnberg, Nemačka).

Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanje su izvršeni u visoko definisanom in vitro sistemu primenom četiri različita pMHC molekula po uslovu stimulacije i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.

Prečišćeno kostimulatorno mišje IgG2a anti-humano CD28 At 9.3 (Jung et al., 1987) bilo je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom prečnika 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD).

pMHC korišćeni za stimulacije pozitivne i negativne kontrole bili su A*0201/MLA-001 (peptid ELAGIGILTV (ID BR. SEKV: 102) iz modifikovanog Melan-A/MART-1) odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5, ID BR. SEKV. 103).

800.000 perliI200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 4 x 12,5 ng različitih biotin-pMHC, isprano i naknadno je dodato 600 ng biotin anti-CD28 u zapremini od 200 pl. Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3 dana na 37 °C.

Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 4 dana na 37 °C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Za očitavanje pMHC multimera pomoću 8 različitih pMHC molekula po uslovu, korišćen je pristup dvodimenzionalnog kombinatornog kodiranja kako je ranije opisano (Andersen et al., 2012) sa manjim modifikacijama koje obuhvataju spajanje sa 5 različitih fluorohroma. Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa bojom Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka), klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Heidelberg, Nemačka) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen odgovarajućim laserima i filterima. Peptid-specifične ćelije izračunate su kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro prajming specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovan je upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih multimer+ među CD8+ T ćelijama a procenat specifičnih multimer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od srednje vrednosti stimulacija negativne kontrole).

In vitro imunogenost za peptide raka jednjaka

Za testirane HLA klasa I peptide, in vitro imunogenost je mogla da se pokaže stvaranjem peptid-specifičnih T-ćelijskih linija. Primerni rezultati protočne citometrije nakon bojenja TUMAP-specifičnog multimera za dva ovde predstavljena peptida (ID BR. SEKV 97 i ID BR. SEKV 101) prikazani su na slici 3 zajedno sa odgovarajućim negativnim kontrolama. Rezultati za pet peptida iz pronalaska sumirani su u tabeli 10A.

Tabela 10A: in vitro imunogenost predstavljenih HLA klasa I peptida

Primerni rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane podnosioca za ovde predstavljene peptide. <20% = ; 20%–49% = +; 50%–69% = ++; >= 70% = +++

1

Tabela 10B: In vitro imunogenost predstavljenih HLA klasa I peptida

Primerni rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane podnosioca za ovde predstavljene peptide. Rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti su naznačeni. Procenat pozitivnih mesta i donora (među procenjivim) su sumirani kako je naznačeno <20 % = ; 20%-49% = +; 50%-69% = ++; >= 70% = +++

PRIMER 4

Sinteza peptida

Svi peptidi su sintetisani pomoću standardne i dobro ustanovljene sinteze peptida u čvrstoj fazi primenom strategije Fmoc. Identitet i prečišćenost svakog pojedinačnog peptida utvrđeni su masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Peptidi su dobijeni u vidu belih do krem liofilizata (trifluoro-acetatne soli) u čistoćama >50%. Svi TUMAP se poželjno primenjuju u obliku trifluoro-acetatnih soli ili acetatnih soli, mogući su i drugi oblici soli.

PRIMER 5

Testovi vezivanja MHC

Peptidi kandidati za terapije zasnovane na T ćelijama kako su predstavljeni su dalje testirani u pogledu njihovog kapaciteta vezivanja MHC (afinitet). Pojedinačni

2

kompleksi peptid-MHC su proizvedeni pomoću izmene liganada pod UV, gde je peptid osetljiv na UV odvojen odmah nakon UV zračenja i zamenjen peptidom od interesa prema analizi. Samo peptidi kandidati koji mogu efikasno da vežu i stabilizuju peptid-receptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Da bi se utvrdio prinos reakcije zamene, sprovedena je ELISA zasnovana na detekciji lakog lanca (β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Esej je sproveden kako je uopšteno opisano u radu Rodenko et al. (Rodenko et al., 2006).

MAXISorp pločice sa 96 mesta (NUNC) obložene su preko noći sa 2 ug/ml streptavidina u PBS-u na sobnoj temperaturi, isprane 4 puta i blokirane tokom 1 h na 37 °C u 2% BSA koji sadrži pufer za blokiranje. Ponovo presavijeni HLA-A*02:01/MLA-001 monomeri služili su kao standardi, pokrivajući opseg od 15–500 ng/ml. Monomeri peptid-MHC iz UV-izmenjivačke reakcije razblaženi su 100 puta u puferu za blokiranje. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37 °C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2 µg/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 h na 37 °C, isprani ponovo i detektovani sa rastvorom TMB koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Peptidi kandidati koji pokazuju visok prinos izmene (poželjno veći od 50%, najpoželjnije veći od 75%) se generalno preferiraju za generisanje i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T-ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer oni pokazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.

Tabela 11: Rezultati vezivanja MHC klase I.

Vezivanje HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-A*02:01 rangirano je pomoću prinosa izmene peptida: ≥10% = ; ≥20% = +; ≥50 = ++; ≥ 75% = +++

4

PRIMER 6

Apsolutna kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Stvaranje vezivača, kao što su antitela i/ili TCR-ovi, je težak proces, koji se može sprovesti samo za određeni broj izabranih ciljeva. U slučaju tumor-asociranih i tumor-specifičnih peptida, kriterijumi za odabir obuhvataju, bez ograničavanja, ekskluzivnost prezentacije i gustinu peptida prezentovanog na površini ćelije. Kvantifikacija kopija TUMAP po ćeliji u uzorcima solidnog tumora iziskuje apsolutnu kvantifikaciju izolovanog TUMAP, efikasnost izolacije TUMAP i broj ćelija u analiziranom uzorku tkiva.

Kvantifikacija peptida pomoću nanoLC-MS/MS

Za preciznu kvantifikaciju peptida pomoću masene spektrometrije, za svaki peptid je generisana kalibraciona kriva primenom internog standardnog metoda. Interni standard je dvostruko izotopom obeležena varijanta svakog peptida, tj. u sintezu TUMAP su uključene dve aminokiseline obeležene izotopom. On se od tumorasociranog peptida razlikuje samo po svojoj masi ali ne pokazuje razliku u drugim fizičko-hemijskim svojstvima (Anderson et al., 2012). Interni standard je dodat u svaki MS uzorak a svi MS signali su normalizovani prema MS signalu internog standarda kako bi se izjednačila potencijalna tehnička odstupanja između MS eksperimenata.

Kalibracione krive su pripremljene u najmanje tri različite matrice, tj. eluati HLA peptida iz prirodnih uzoraka slični rutinskim MS uzorcima, a svaki preparat je izmeren u MS ciklusima u duplikatu. Za evaluaciju, MS signali su normalizovani prema signalu internog standarda a kalibraciona kriva je izračunata logističkom regresijom.

Za kvantifikaciju tumor-asociranih peptida iz uzoraka tkiva, u odgovarajuće uzorke je takođe dodat interni standard; MS signali su normalizovani prema internom standardu i kvantifikovani pomoću kalibracione krive peptida.

Efikasnost izolacije peptid/MHC

Kao i za svaki postupak prečišćavanja proteina, izolacija proteina iz uzoraka tkiva povezana je sa određenim gubitkom proteina od interesovanja. Da bi se utvrdila efikasnost izolacije TUMAP, kompleksi peptid/MHC su stvoreni za sve TUMAP-ove izabrane za apsolutnu kvantifikaciju. Da bi mogli da se razlikuju spajkovani od prirodnih kompleksa peptid/MHC korišćene su jednostruko izotopom obeležene verzije TUMAP-ova, tj. u sintezu TUMAP je uključena jedna aminokiselina obeležena izotopom. Ovi kompleksi su dodati u sveže pripremljene lizate tkiva, tj. u najranijoj mogućoj tački procedure izolacije TUMAP, a zatim uhvaćeni kao prirodni kompleksi peptid/MHC u narednom afinitetnom prečišćavanju. Merenje dobijanja jednostruko obeleženih TUMAP-ova stoga omogućava donošenje zaključaka u pogledu efikasnosti izolacije pojedinačnih prirodnih TUMAP-ova.

Efikasnost izolacije je analizirana na malom broju uzoraka i bila je uporediva među ovim uzorcima tkiva. Suprotno tome, efikasnost izolacije se razlikuje između pojedinačnih peptida. Ovo sugeriše da efikasnost izolacije, iako određena u samo ograničenom broju uzoraka tkiva, može da se ekstrapolira na bilo koji drugi preparat tkiva. Ipak, neophodno je da se svaki TUMAP pojedinačno analizira zato što efikasnost izolacije ne može da se ekstrapolira sa jednog peptida na druge.

Utvrđivanje broja ćelija u solidnom, zamrznutom tkivu

Da bi se utvrdio broj ćelija uzoraka tkiva podvrgnutih apsolutnoj kvantifikaciji peptida, pronalazači su primenili analizu sadržaja DNK. Ovaj metod je primenjiv za širok spektar uzoraka različitog porekla i, što je najvažnije, zamrznute uzorke (Alcoser et al., 2011; Forsey and Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). U toku protokola izolacije peptida, uzorak tkiva se obrađuje do homogenog lizata, iz kojeg se uzima mali alikvot lizata. Alikvot se deli na tri dela, iz kojih se izoluje DNK (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Nemačka). Ukupan sadržaj DNK iz svake izolacije DNK se kvantifikuje pomoću eseja kvantifikacije DNK zasnovanog na fluorescenciji (komplet eseja Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Nemačka) u najmanje dva replikata.

Da bi se izračunao broj ćelija, stvorena je standardna kriva DNK iz alikvota pojedinačnih zdravih ćelija krvi, sa rasponom definisanih brojeva ćelija. Standardna kriva se koristi za izračunavanje ukupnog sadržaja ćelija iz ukupnog sadržaja DNK iz svake izolacije DNK. Srednja vrednost ukupnog broja ćelija uzorka tkiva korišćenog za izolaciju peptida se ekstrapolira uzimajući u obzir poznatu zapreminu alikvota lizata i ukupnu zapreminu lizata.

Kopije peptida po ćeliji

Uz pomoć podataka iz gore navedenih eksperimenata pronalazači su izračunali broj kopija TUMAP po ćeliji deljenjem ukupne količine peptida sa ukupnim brojem ćelija uzorka, nakon čega je sledilo deljenje kroz efikasnost izolacije. Brojevi kopija po ćeliji za izabrane peptide prikazani su u tabeli 12.

Tabela 12: Apsolutni brojevi kopija. U tabeli su navedeni rezultati apsolutne kvantifikacije peptida u NSCLC uzorcima tumora. Srednji broj kopija po ćelija naznačen je za svaki peptid: <100 = ; >=100 = +; >=1,000 ++; >=10,000 = +++. Naznačen je broj uzoraka, u kojima su dostupni procenjivi, visoko kvalitetni MS podaci.

Lista referenci

Abbas, W. et al., Front Oncol 5 (2015): 75

Adams, S. et al., PLoS.One. 9 (2014): e112945

Al Moustafa, A. E. et al., Oncogene 21 (2002): 2634-2640

Al-Mahdi, R. et al., Cell Adh.Migr. (2015): 0

Alcoser, S. Y. et al., BMC.Biotechnol. 11 (2011): 124

Alholle, A. et al., Epigenetics. 8 (2013): 1198-1204

Ali, R. H. et al., Hum.Pathol.45 (2014): 2453-2462

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

Alper, M. et al., Mol.Cell Biochem. 393 (2014): 165-175

Alsagaby, S. A. et al., J Proteome.Res 13 (2014): 5051-5062 Altmannsberger, M. et al., Am.J Pathol. 118 (1985): 85-95 Ammendola, M. et al., PLoS.One. 9 (2014): e99512

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902

Anderson, N. L. et al., J Proteome.Res 11 (2012): 1868-1878 Appay, V. et al., Eur.J Immunol.36 (2006): 1805-1814

Arentz, G. et al., Clin Proteomics. 8 (2011): 16

Arif, Q. et al., Arch.Pathol.Lab Med.139 (2015): 978-980

Auvinen, P. et al., Breast Cancer Res Treat.143 (2014): 277-286 Avasarala, S. et al., PLoS.One.8 (2013): e76895

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Bandres, E. et al., Oncol Rep. 12 (2004): 287-292

Banerjee, K. et al., Int.J Cancer (2015)

Barros-Filho, M. C. et al., J Clin Endocrinol.Metab 100 (2015): E890-E899 Bashyam, M. D. et al., Neoplasia. 7 (2005): 556-562

Basu, S. et al., PLoS.One.10 (2015): e0123979

Baxter, P. A. et al., Acta Neuropathol.Commun.2 (2014): 160

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Becker, S. A. et al., Cancer Res 56 (1996): 5092-5097

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Bellon, M. et al., Blood 121 (2013): 5045-5054

Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300

Bhattacharjee, R. B. et al., Cell Biol Int.36 (2012): 697-704

Bin Amer, S. M. et al., Saudi.Med.J 29 (2008): 507-513

Blanch, A. et al., PLoS.One.8 (2013): e66436

Blanco, M. A. et al., Cell Res 22 (2012): 1339-1355

Blenk, S. et al., Cancer Inform.3 (2007): 399-420

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Boyer, A. P. et al., Mol.Cell Proteomics.12 (2013): 180-193

Bozza, W. P. et al., Oncotarget. 6 (2015): 32723-32736

Braulke, T. et al., Arch.Biochem.Biophys. 298 (1992): 176-181

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Bray, F. et al., Int J Cancer 132 (2013): 1133-1145

Brechmann, M. et al., Immunity.37 (2012): 697-708

Bredholt, G. et al., Oncotarget. 6 (2015): 39676-39691

Breuninger, S. et al., Am.J Pathol. 176 (2010): 2509-2519

Brezinova, J. et al., Cancer Genet.Cytogenet.173 (2007): 10-16 Broghammer, M. et al., Cancer Lett.214 (2004): 225-229

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol.5 (2004): 29-43

Buckley, N. E. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014): e1070

Bui, P. H. et al., Mol.Pharmacol.76 (2009): 1044-1052

Buim, M. E. et al., Oncology 69 (2005): 445-454

Bujas, T. et al., Eur.J Histochem.55 (2011): e7

Cai, J. L. et al., Chin J Cancer Res 23 (2011): 59-63

Cai, Q. et al., Nat Genet.46 (2014): 886-890

Calmon, M. F. et al., Epigenetics. 10 (2015): 622-632

Calvo, N. et al., Biochem.Cell Biol 92 (2014): 305-315

Canet, B. et al., Hum.Pathol.42 (2011): 833-839

Cao, Z. et al., Mol.Oncol 8 (2014): 285-296

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother.53 (2004): 345-357 Carinci, F. et al., Int.J Immunopathol.Pharmacol.18 (2005): 513-524 Cazier, J. B. et al., Nat Commun.5 (2014): 3756

Cetindis, M. et al., Eur.Arch.Otorhinolaryngol. (2015) Chakrabarti, G. et al., Cancer Metab 3 (2015): 12

Chaneton, B. et al., Trends Biochem.Sci. 37 (2012): 309-316 Chang, I. W. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 5441-5450

Chang, J. W. et al., Anticancer Res 32 (2012): 1259-1265 Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol.65 (2004): 1211-1223 Chauvet, C. et al., PLoS.One. 6 (2011): e22545

Che, J. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 6559-6568

Chen, B. et al., Mol.Cancer Res 10 (2012): 305-315

Chen, K. D. et al., Cell Death.Dis.5 (2014a): e1244

Chen, L. et al., Int.J Mol.Sci.15 (2014b): 11435-11445

Chen, Q. et al., Cell Physiol Biochem. 35 (2015a): 1052-1061 Chen, R. S. et al., Oncogene 28 (2009): 599-609

Chen, S. et al., Cancer Epidemiol. 37 (2013): 172-178

Chen, W. M. et al., Dig.Dis.Sci.60 (2015b): 1655-1662

Chen, Y. et al., Med.Oncol 31 (2014c): 304

Chen, Y. C. et al., Int.J Cancer 135 (2014d): 117-127

Chen, Z. T. et al., Int.J Mol.Sci.16 (2015c): 15497-15530 Cheon, D. J. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 711-723

Cheuk, W. et al., Pathology 33 (2001): 7-12

Cho, S. J. et al., PLoS.One.8 (2013): e71724

Choi, W. I. et al., Cell Physiol Biochem.23 (2009): 359-370 Chuang, W. Y. et al., Histol.Histopathol. 28 (2013): 293-299 Chung, J. et al., J Cell Biol 158 (2002): 165-174

Chung, T. K. et al., Int.J Cancer 137 (2015): 776-783

Cimino, D. et al., Int.J Cancer 123 (2008): 1327-1338

Cipriano, R. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 1156-1165 ClinicalTrials.gov, (2015), http://www.clinicaltrials.gov

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114 Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995) Colombetti, S. et al., J Immunol.176 (2006): 2730-2738

Council, L. et al., Mod.Pathol. 22 (2009): 639-650

Crossen, P. E. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 113 (1999): 126-133 Cui, D. et al., Oncogene 33 (2014): 2225-2235

Daigeler, A. et al., J Exp.Clin Cancer Res 27 (2008): 82

Dang, C. V. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 6479-6483

Dang, Q. et al., Med.Oncol 31 (2014): 24

Dar, A. A. et al., Immunology (2015)

Davids, M. S. et al., Leuk.Lymphoma 53 (2012): 2362-2370 Davidson, B. et al., Hum.Pathol.45 (2014): 691-700

de Groen, F. L. et al., Genes Chromosomes.Cancer 53 (2014): 339-348 de Jonge, H. J. et al., Leukemia 25 (2011): 1825-1833

1

de Sa, V. K. et al., Braz.J Med.Biol Res 46 (2013): 21-31

De, Keersmaecker K. et al., Haematologica 99 (2014): 85-93

De, Ponti A. et al., Cancer Lett. 369 (2015): 396-404

Deacu, E. et al., Cancer Res 64 (2004): 7690-7696

Deb, S. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 1223-1230

Debiec-Rychter, M. et al., Genes Chromosomes.Cancer 38 (2003): 187-190 DeLaBarre, B. et al., Chem Biol 21 (2014): 1143-1161

Delker, D. A. et al., PLoS.One.9 (2014): e88367

Demirag, G. G. et al., Med.Oncol 29 (2012): 1518-1522

Demirci, H. et al., J Ophthalmic Vis.Res 8 (2013): 303-307

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170

Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Depianto, D. et al., Nat Genet.42 (2010): 910-914

Ding, L. et al., Nature 481 (2012): 506-510

Dotlic, S. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol. 22 (2014): 537-542 Downie, D. et al., Clin Cancer Res. 11 (2005): 7369-7375

Draberova, E. et al., J Neuropathol.Exp.Neurol.74 (2015): 723-742 Drayton, R. M. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 1990-2000

Du, J. et al., Int.J Mol.Sci.13 (2012): 15755-15766

Duanmin, H. et al., Hepatogastroenterology 60 (2013): 870-875 Dubrowinskaja, N. et al., Cancer Med.3 (2014): 300-309

Ehrlichova, M. et al., Genomics 102 (2013): 96-101

El-Naggar, A. M. et al., Cancer Cell 27 (2015): 682-697

Espinosa, A. M. et al., PLoS.One. 8 (2013): e55975

Esseghir, S. et al., J Pathol. 210 (2006): 420-430

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Fang, J. et al., BMC.Cancer 8 (2008a): 69

2

Fang, W. et al., J Transl.Med.6 (2008b): 32

Fejzo, M. S. et al., Int.J Mol.Sci.14 (2013): 3094-3109

Fellenberg, F. et al., J Invest Dermatol. 122 (2004): 1510-1517

Feng, G. et al., Leuk.Lymphoma 55 (2014): 2699-2705

Ferlay et al., GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No.11 [Internet], (2013), http://globocan.iarc.fr

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814

Fontaine, J. F. et al., PLoS.One.4 (2009): e7632

Forsey, R. W. et al., Biotechnol.Lett.31 (2009): 819-823

Fu, A. et al., Mol.Med.Rep.11 (2015a): 4727-4733

Fu, Y. et al., Cancer Biol.Ther 5 (2006): 741-744

Fu, Z. C. et al., Med.Sci.Monit.21 (2015b): 1276-1287

Fujita, A. et al., Genet.Mol.Res 7 (2008): 371-378

Fujita, N. et al., J Biochem.152 (2012): 407-413

Fujiwara, K. et al., PLoS.One.9 (2014): e107247

Furukawa, C. et al., Cancer Res 65 (2005): 7102-7110

Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med.2 (1996): 1096-1103

Gao, Y. B. et al., Nat Genet. 46 (2014): 1097-1102

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Giallourakis, C. C. et al., J Immunol.190 (2013): 5578-5587

Giovinazzo, F. et al., Cell Signal.25 (2013): 651-659

Gkika, D. et al., J Cell Biol 208 (2015): 89-107

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867

Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Goode, G. et al., PLoS.One. 9 (2014): e100103

Gordon, G. J. et al., BMC.Cancer 11 (2011): 169

Gorski, J. J. et al., Breast Cancer Res Treat. 122 (2010): 721-731

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012) Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014) Groulx, J. F. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1217-1227

Guo, X. et al., Sci.Rep.5 (2015): 11846

Gupta, V. et al., Curr.Pharm.Des 20 (2014): 2595-2606

Hagel, C. et al., J Neurooncol. 112 (2013): 191-197

Haggman, M. J. et al., Urology 50 (1997): 643-647

Hammam, O. et al., J Egypt.Soc.Parasitol. 44 (2014): 733-740 Hapgood, G. et al., Blood 126 (2015): 17-25

Haraguchi, N. et al., Int.J Oncol 43 (2013): 425-430

Harris, T. M. et al., Arch.Pathol.Lab Med. 139 (2015): 494-507 Haslene-Hox, H. et al., Biochim.Biophys.Acta 1834 (2013): 2347-2359 Hatina, J. et al., Neoplasma 59 (2012): 728-736

Hauser, A. D. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 130-142

He, X. et al., Int.J Biol Macromol.72 (2015): 1081-1089

Heffler, M. et al., Anticancer Agents Med.Chem 13 (2013): 584-594 Heubeck, B. et al., Eur.J Cancer 49 (2013): e1-e7

Hoeflich, K. P. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 839-849

Hofsli, E. et al., Br.J Cancer 99 (2008): 1330-1339

Hogan, L. E. et al., Blood 118 (2011): 5218-5226

Hountis, P. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 7327-7333

Hu, C. K. et al., Mol.Biol Cell 23 (2012): 2702-2711

Huang, F. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014a): 1093-1100

Huang, S. L. et al., Cancers (Basel) 7 (2015): 1052-1071

Huang, Y. D. et al., Hua Xi.Kou Qiang.Yi.Xue.Za Zhi.25 (2007): 500-503 Huang, Z. et al., Indian J Otolaryngol.Head Neck Surg.66 (2014b): 120-125 Huang, Z. et al., J Oral Pathol.Med. 43 (2014c): 191-198

Hussey, G. S. et al., Mol Cell 41 (2011): 419-431

4

Hwang, M. L. et al., J Immunol.179 (2007): 5829-5838 Ichinose, J. et al., Cancer Sci.105 (2014): 1135-1141

Ida-Yonemochi, H. et al., Mod.Pathol. 25 (2012): 784-794

Ii, M. et al., Int.J Oncol 39 (2011): 593-599

Inoue, H. et al., Int.J Cancer 63 (1995): 523-526

Inoue, K. et al., Subcell.Biochem. 85 (2014): 17-40

Iqbal, M. A. et al., FEBS Lett.588 (2014): 2685-2692

Irifune, H. et al., Cancer Biol Ther.4 (2005): 449-455

Ismail, M. F. et al., Tumour.Biol (2015)

Israelsen, W. J. et al., Semin.Cell Dev.Biol 43 (2015): 43-51 Jamieson, N. B. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 3316-3331 Januchowski, R. et al., Biomed.Pharmacother. 67 (2013): 240-245 Jiang, L. et al., Cell Cycle 14 (2015): 2881-2885

Jin, J. et al., Int.J Hematol.99 (2014): 750-757

Johnson, R. H. et al., Oncotarget. (2015)

Johnstone, C. N. et al., Dis.Model.Mech. 8 (2015): 237-251 Joosse, S. A. et al., Clin Cancer Res 18 (2012): 993-1003 Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615 Kabbage, M. et al., J Biomed.Biotechnol.2008 (2008): 564127 Kanehira, M. et al., Cancer Res 67 (2007): 3276-3285

Kang, S. et al., J Proteome.Res 9 (2010): 5638-5645

Kao, C. J. et al., Oncogene 27 (2008): 1397-1403

Karlsson, J. et al., Cancer Lett.357 (2015): 498-501

Kato, I. et al., Pathol.Int.59 (2009): 38-43

Katoh, M., Int.J Oncol 41 (2012): 1913-1918

Kaz, A. M. et al., Genes Chromosomes.Cancer 51 (2012): 384-393 Kazma, R. et al., PLoS.One. 7 (2012): e51680 Kerley-Hamilton, J. S. et al., Oncogene 24 (2005): 6090-6100 Khakpour, G. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 4905-4912

Khalil, A. A., Cancer Sci.98 (2007): 201-213

Khapare, N. et al., PLoS.One. 7 (2012): e38561

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000) Kido, T. et al., Genes (Basel) 1 (2010): 283-293

Kim, S. W. et al., OMICS.15 (2011): 281-292

Kimura, H. et al., Int.J Oncol 30 (2007): 171-179

Kinoshita, T. et al., Oncotarget. 3 (2012): 1386-1400

Kirov, A. et al., J Cell Biochem. (2015)

Kita, Y. et al., Eur.J Surg.Oncol 35 (2009): 52-58

Klopfleisch, R. et al., J Proteome.Res 9 (2010): 6380-6391 Koizume, S. et al., Cancer Res 66 (2006): 9453-9460

Koizume, S. et al., World J Clin Oncol 5 (2014): 908-920

Koizume, S. et al., Biomark.Cancer 7 (2015): 1-13

Kono, K. et al., Cancer Sci. 100 (2009): 1502-1509

Kottorou, A. E. et al., Acta Histochem. 114 (2012): 553-561

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Krisenko, M. O. et al., Biochim.Biophys.Acta 1853 (2015): 254-263 Kruse, A. J. et al., Int.J Gynecol.Cancer 24 (2014): 1616-1622 Kulkarni, G. et al., Breast Cancer Res Treat. 102 (2007): 31-41 Kultti, A. et al., Biomed.Res Int.2014 (2014): 817613

Kumar, M. et al., J Transl.Med.13 (2015): 8

Kumarakulasingham, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 3758-3765 Kuramitsu, Y. et al., Anticancer Res 30 (2010): 4459-4465 Kurimoto, F. et al., Int.J Mol.Med.8 (2001): 89-93

Kwon, O. H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.406 (2011): 539-545 Larrinaga, G. et al., Dis.Markers 35 (2013): 825-832 Lauvrak, S. U. et al., Br.J Cancer 109 (2013): 2228-2236 Leal, M. F. et al., World J Gastroenterol.18 (2012): 1531-1537 Ledet, E. M. et al., Prostate 73 (2013): 614-623

Lee, E. J. et al., J Genet.Genomics 42 (2015a): 355-371 Lee, H. W. et al., Dis.Esophagus. (2015b)

Lee, J. et al., Oncoscience.2 (2015c): 410-418

Lee, J. M., Reprod.Biol Endocrinol. 1 (2003): 69

Lee, M. H. et al., J Cell Sci.126 (2013): 1744-1752

Lee, M. H. et al., Ann.N.Y.Acad.Sci.1171 (2009): 87-93 Lee, S. H. et al., EMBO J 25 (2006): 4008-4019

Lee, S. Y. et al., J Clin Invest 122 (2012): 3211-3220

Lei, Y. Y. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.15 (2014): 8539-8548 Leithner, K. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 40

Leitlinie Magenkarzinom, 032-009OL, (2012)

Lexander, H. et al., Anal.Quant.Cytol.Histol.27 (2005): 263-272 Li, C. et al., Oncogene 23 (2004): 9336-9347

Li, C. et al., Am.J Cancer Res 5 (2015a): 1635-1648

Li, R. et al., Oncogene 25 (2006): 2628-2635

Li, X. et al., Pancreas 40 (2011): 753-761

Li, X. Q. et al., PLoS.One.7 (2012): e31146

Li, Y. et al., Neoplasia. 7 (2005): 1073-1080

Li, Y. et al., Cell Rep.12 (2015b): 388-395

Li, Y. et al., Lung Cancer 58 (2007): 171-183

Li, Z. et al., Biochim.Biophys.Acta 1846 (2014): 285-296 Liang, B. et al., World J Gastroenterol. 11 (2005a): 623-628 Liang, J. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 6391-6399

Liang, L. et al., Int.J Oncol 45 (2014): 659-666

Liang, Z. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi.27 (2005b): 534-537

Liao, J. S. et al., Zhejiang.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 44 (2015a): 329-334 Liao, W. et al., Oncotarget.6 (2015b): 24132-24147

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Lim, M. Y. et al., Int.J Chronic.Dis.2013 (2013): 578613

Lim, R. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.406 (2011): 408-413 Lin, C. et al., Oncotarget.6 (2015): 8434-8453

Lin, S. J. et al., J Proteomics.94 (2013): 186-201

Lin, X. et al., Med.Oncol 31 (2014): 42

Linher-Melville, K. et al., Mol.Cell Biochem.405 (2015): 205-221

Liu, B. et al., J Clin Endocrinol.Metab 99 (2014a): E786-E795

Liu, C. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014b): 690-698

Liu, D. et al., Genet.Mol.Res 13 (2014c): 8153-8162

Liu, J. P. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi.87 (2007a): 2719-2723

Liu, L. et al., Oncol Lett.7 (2014d): 2192-2198

Liu, Y. et al., J Neurooncol.99 (2010): 13-24

Liu, Y. et al., Cell Death.Dis.6 (2015): e1630

Liu, Y. et al., Oncol Rep.18 (2007b): 943-951

Liu, Y. F. et al., Tumour.Biol 35 (2014e): 3731-3741

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759

Lo, P. K. et al., Oncogene 31 (2012): 2614-2626

Lo, R. K. et al., J Biol Chem 278 (2003): 52154-52165

Lo, W. Y. et al., J Proteome.Res 6 (2007): 2143-2151

Lohr, J. G. et al., Cancer Cell 25 (2014): 91-101

Long, W. et al., J Clin Invest 122 (2012): 1869-1880

Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291 Longerich, T., Pathologe 35 Suppl 2 (2014): 177-184

Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585

Lou, S. et al., Stem Cells 31 (2013): 1942-1953

Lu, Z. et al., Cell Physiol Biochem. 33 (2014): 859-868

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795 Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004) Luo, W. et al., Trends Endocrinol.Metab 23 (2012): 560-566

Lv, Z. et al., J Exp.Clin Cancer Res 33 (2014): 100

Ma, Y. et al., Mol.Cell Proteomics. 8 (2009): 1878-1890 Madanayake, T. W. et al., BMC.Genomics 14 (2013): 833

Maiso, P. et al., Cancer Res 75 (2015): 2071-2082

Manenti, G. et al., Toxicol.Lett. 112-113 (2000): 257-263

Mao, P. et al., J Biol Chem 286 (2011): 19381-19391

Mao, P. et al., PLoS.One.8 (2013): e81803

Marcinkiewicz, K. M. et al., Exp.Cell Res 320 (2014): 128-143 Marg, A. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.401 (2010): 143-148 Marhold, M. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 556-564

Martin-Rufian, M. et al., J Mol.Med.(Berl) 92 (2014): 277-290 Matassa, D. S. et al., Cell Death.Dis. 4 (2013): e851

Mayas, M. D. et al., Anticancer Res 32 (2012): 3675-3682

Mazan-Mamczarz, K. et al., PLoS.Genet.10 (2014): e1004105 Mazurek, S., Ernst.Schering.Found.Symp.Proc. (2007): 99-124 Mazurek, S., Int.J Biochem.Cell Biol 43 (2011): 969-980

McBride, D. J. et al., J Pathol.227 (2012): 446-455

Melaiu, O. et al., Mutat.Res 771 (2015): 6-12

Messina, M. et al., Blood 123 (2014): 2378-2388

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Mimori, K. et al., Int.J Oncol 11 (1997): 959-964

Mirza, Z. et al., Anticancer Res 34 (2014): 1873-1884 Missero, C. et al., Exp.Dermatol. 23 (2014): 143-146

Moretti, R. M. et al., Oncol Rep.9 (2002): 1139-1143 Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027

Morris, L. G. et al., Nat Genet.45 (2013): 253-261

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res.12 (2006): 3435-3443 Mountzios, G. et al., Ann.Oncol 25 (2014): 1889-1900 Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

Mueller, L. N. et al., Proteomics.7 (2007): 3470-3480 Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638 Murray, G. I. et al., Histopathology 57 (2010): 202-211 Mustacchi, G. et al., Int.J Mol.Sci.14 (2013): 9686-9702 Naba, A. et al., Elife.3 (2014): e01308

Naboulsi, W. et al., J Proteome.Res (2015)

Naderi, A., Exp.Cell Res 331 (2015): 239-250

Nakao, K. et al., J Gastroenterol. 49 (2014): 589-593

Navara, C. S., Curr.Pharm.Des 10 (2004): 1739-1744

Naz, S. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 14-23

Neumann, M. et al., Blood 121 (2013): 4749-4752

Ng, S. K. et al., Clin Experiment.Ophthalmol. 43 (2015): 367-376 Nikitakis, N. G. et al., Am.J Clin Pathol.119 (2003): 574-586 Nishida, C. R. et al., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 497-502 Nwosu, V. et al., Hum.Mol Genet.10 (2001): 2313-2318 Nykopp, T. K. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 512

O'Gorman, D. B. et al., Endocrinology 143 (2002): 4287-4294

1

Oh, H. R. et al., Cell Oncol (Dordr.) 37 (2014): 455-461

Ohigashi, Y. et al., Clin Cancer Res. 11 (2005): 2947-2953

Okayama, H. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.23 (2014): 2884-2894 Okoh, V. O. et al., PLoS.One.8 (2013): e54206

Olstad, O. K. et al., Anticancer Res 23 (2003): 2201-2216

Ordonez, N. G., Arch.Pathol.Lab Med.129 (2005): 1407-1414

Orzol, P. et al., Histol.Histopathol. 30 (2015): 503-521

Padden, J. et al., Mol.Cell Proteomics.13 (2014): 2661-2672

Pan, B. et al., Mol.Biol Rep. 40 (2013): 27-33

Pan, T. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.456 (2015): 452-458 Papagerakis, S. et al., Hum.Pathol.34 (2003): 565-572

Park, Y. et al., Oncogene 34 (2015): 5037-5045

Parker, L. P. et al., Cancer Genomics Proteomics. 6 (2009): 189-194

Pathak, S. et al., Nutr.Cancer 66 (2014): 818-824

Peng, H. et al., Cell Oncol (Dordr.) 38 (2015): 165-172

Penney, K. L. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.24 (2015): 255-260 Perez, I. et al., Int.J Med.Sci. 12 (2015): 458-467

Persson, F. et al., Cancer Lett.260 (2008): 37-47

Pflueger, D. et al., Neoplasia. 15 (2013): 1231-1240

Pickering, C. R. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 6582-6592

Pillay, V. et al., S.Afr.Med.J 105 (2015): 656-658

Pils, D. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 178

Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (http://CRAN.R-project.org/packe=nlme) (2015)

Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Prasad, N. B. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 945-957

Puente, X. S. et al., Nature 526 (2015): 519-524

1 1

Qendro, V. et al., J Proteome.Res 13 (2014): 5031-5040

Qi, Y. et al., Proteomics.5 (2005): 2960-2971

Qi, Y. et al., J Breast Cancer 18 (2015): 218-224

Qie, S. et al., J Cell Biochem. 115 (2014): 498-509

Qu, Y. M. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi.90 (2010): 1958-1962

Qu, Z. et al., Cancer Med.3 (2014): 453-461

Quillien, V. et al., Anticancer Res.17 (1997): 387-391

Rabinovitz, I. et al., Biochem.Cell Biol 74 (1996): 811-821

Rabinovitz, I. et al., Clin Exp.Metastasis 13 (1995): 481-491

Rad, E. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 1149-1160

Rai, R. et al., Oral Oncol 40 (2004): 705-712

Raica, M. et al., Anticancer Res 28 (2008): 2997-3006

Ramirez-Exposito, M. J. et al., Maturitas 72 (2012): 79-83

Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Reeb, A. N. et al., J Clin Endocrinol.Metab 100 (2015): E232-E242

RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Rehman, I. et al., PLoS.One.7 (2012): e30885

Reis, S. T. et al., Clinics.(Sao Paulo) 68 (2013): 652-657

Remmelink, M. et al., Int.J Oncol 26 (2005): 247-258

Revill, K. et al., Gastroenterology 145 (2013): 1424-1435

Ricketts, C. J. et al., Clin Epigenetics. 5 (2013): 16

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rodenko, B. et al., Nat Protoc.1 (2006): 1120-1132

Roemer, A. et al., J Urol.172 (2004): 2162-2166

Romana, S. P. et al., Leukemia 20 (2006): 696-706

Rozenblum, E. et al., Hum.Genet. 110 (2002): 111-121

1 2

Ruminy, P. et al., Leukemia 25 (2011): 681-688

Safadi, R. A. et al., Oral Surg.Oral Med.Oral Pathol.Oral Radiol. 121 (2016): 402-411

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Sanchez-Palencia, A. et al., Int.J Cancer 129 (2011): 355-364

Santarpia, L. et al., Oncologist. 18 (2013): 1063-1073

Sarma, S. N. et al., Environ.Toxicol.Pharmacol. 32 (2011): 285-295 Sathyanarayana, U. G. et al., Cancer Res 64 (2004): 1425-1430

Sato, T. et al., Oncogene 33 (2014): 2215-2224

Sato, Y. et al., J Gastroenterol.Hepatol. 28 (2013): 1422-1429

Savaskan, N. E. et al., Ann.Anat. 192 (2010): 309-313

Savaskan, N. E. et al., Curr.Neuropharmacol. 13 (2015): 258-265

Savoy, R. M. et al., Endocr.Relat Cancer 20 (2013): R341-R356

Schlieben, P. et al., Vet.J 194 (2012): 210-214

Schmitt-Graeff, A. et al., Histopathology 51 (2007): 87-97

Schuld, N. J. et al., Cell Cycle 13 (2014): 941-952

Schumann, H. et al., Br.J Dermatol.167 (2012): 929-936

Scrideli, C. A. et al., J Neurooncol. 88 (2008): 281-291

Seda, V. et al., Eur.J Haematol. 94 (2015): 193-205

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Seitz, S. et al., Eur.J Cancer 36 (2000): 1507-1513

Semenza, G. L., Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol 76 (2011): 347-353 Seong, J. et al., Mol.Biol.Rep. 39 (2012): 3597-3601

Sethi, M. K. et al., J Proteomics.126 (2015): 54-67

Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986)

Shi, Z. et al., Int.J Gynecol.Cancer 22 (2012): 1125-1129

Shi, Z. G. et al., Clin Transl.Oncol 17 (2015): 65-73

1

Shibano, T. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0127271

Shin, S. H. et al., Lab Invest 94 (2014): 1396-1405

Shruthi, D. K. et al., J Oral Maxillofac.Pathol. 18 (2014): 365-371 Silva, J. M. et al., Cell 137 (2009): 1047-1061

Silva, L. P. et al., Anal.Chem. 85 (2013): 9536-9542

Singh, V. et al., OMICS.19 (2015): 688-699

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother.53 (2004): 187-195 Slaga, T. J. et al., J Investig.Dermatol.Symp.Proc. 1 (1996): 151-156 Small, E. J. et al., J Clin Oncol.24 (2006): 3089-3094

Sobolik-Delmaire, T. et al., Cell Commun.Adhes.14 (2007): 99-109 Spurr, I. B. et al., Chembiochem.13 (2012): 1628-1634

Stahl, M. et al., Ann.Oncol.24 Suppl 6 (2013): vi51-vi56

Stull, R. A. et al., BMC.Genomics 6 (2005): 55

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics.9 (2008): 163

Sugimoto, K. J. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 8980-8987 Suh, J. H. et al., J Korean Med.Sci. 28 (2013): 593-601

Sun, M. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.340 (2006): 209-214 Sun, Y. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.450 (2014): 1-6 Suzuki, S. et al., Pathol.Res Pract.210 (2014): 130-134

Swain, N. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 8407-8413

Szeliga, M. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 1855-1862

Takabe, P. et al., Exp.Cell Res 337 (2015): 1-15

Takahashi, H. et al., Urology 79 (2012): 240-248

Takeda, H. et al., Nat Genet.47 (2015): 142-150

Tamada, M. et al., Clin Cancer Res 18 (2012): 5554-5561

Tan, B. S. et al., Mol.Cancer Ther. 10 (2011): 1982-1992

Tanaka, F. et al., Int.J Oncol 10 (1997): 1113-1117

1 4

Tang, H. et al., Anticancer Drugs 18 (2007): 633-639

Tang, H. et al., Clin Cancer Res 19 (2013): 1577-1586

Tang, J. Q. et al., Beijing Da.Xue.Xue.Bao. 41 (2009): 531-536 Tang, J. Q. et al., Chin Med.J (Engl.) 123 (2010): 3559-3565 Tanis, T. et al., Arch.Oral Biol 59 (2014): 1155-1163

Tech, K. et al., Cancer Lett.356 (2015): 268-272

Teng, B. P. et al., Anticancer Agents Med.Chem 11 (2011): 620-628 Terada, T., Int.J Clin Exp.Pathol. 5 (2012): 596-600

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci.62 (2005): 1755-1762

Tew, G. W. et al., J Biol Chem 283 (2008): 963-976

Thomas, A. et al., Cancer Med. 2 (2013): 836-848

Tian, S. Y. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 3752-3762 Tofuku, K. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 175-183

Toh, U. et al., Int.J Clin Oncol 7 (2002): 372-375

Toh, U. et al., Clin Cancer Res. 6 (2000): 4663-4673

Toomey, P. G. et al., Cancer Control 20 (2013): 32-42

Tota, G. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 963

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Truong, T. et al., Endocr.Relat Cancer 21 (2014): 629-638 Tsujimoto, H. et al., Mol.Carcinog 26 (1999): 298-304

Tuupanen, S. et al., Br.J Cancer 111 (2014): 1657-1662

Tuval-Kochen, L. et al., PLoS.One. 8 (2013): e77260

Twa, D. D. et al., J Pathol.236 (2015): 136-141

Twarock, S. et al., Mol.Cancer 10 (2011): 30

Tzellos, T. G. et al., J Eur.Acad.Dermatol.Venereol.25 (2011): 679-687 Urosevic, J. et al., Nat Cell Biol 16 (2014): 685-694

Vachani, A. et al., Clin Cancer Res. 13 (2007): 2905-2915

1

Valladares-Ayerbes, M. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.19 (2010): 1432-1440

Valletta, D. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1407-1415

van, Geldermalsen M. et al., Oncogene (2015)

Varga, A. E. et al., Oncogene 24 (2005): 5043-5052

Varona, A. et al., Am.J Physiol Renal Physiol 292 (2007): F780-F788

Vasca, V. et al., Oncol Lett.8 (2014): 2501-2504

Venneti, S. et al., Brain Pathol. 23 (2013): 217-221

Virtakoivu, R. et al., Cancer Res 75 (2015): 2349-2362

Volkmer, J. P. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 109 (2012): 2078-2083

Volpi, A. et al., G.Chir 32 (2011): 59-63

Vui-Kee, K. et al., Kaohsiung.J Med.Sci.28 (2012): 243-250

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med.18 (2012): 1254-1261

Wang, D. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.458 (2015a): 313-320 Wang, H. et al., Front Oncol 4 (2014): 377

Wang, H. et al., Cancer Cell 18 (2010): 52-62

Wang, J. et al., Oncol Rep.33 (2015b): 1326-1334

Wang, T. et al., Tumour.Biol (2015c)

Wang, W. M. et al., J Biol Chem 278 (2003): 19549-19557

Wang, X. et al., Eur.J Pharmacol.768 (2015d): 116-122

Wang, X. M. et al., PLoS.One.8 (2013a): e55714

Wang, X. Y. et al., Int J Hyperthermia 29 (2013): 364-375

Wang, Y. et al., Neoplasma 62 (2015e): 966-973

Wang, Z. et al., Oncotarget.4 (2013b): 2476-2486

Wang, Z. et al., Melanoma Res 14 (2004): 107-114

Warner, S. L. et al., Future.Med.Chem 6 (2014): 1167-1178

Watanabe, Y. et al., Gastroenterology 136 (2009): 2149-2158

1

Wegdam, W. et al., PLoS.One.9 (2014): e108046

Wehner, M. et al., FEBS J 277 (2010): 1597-1605

Weiss, I. et al., Int.J Mol.Sci.13 (2012): 12925-12938

Weissbach, S. et al., Br.J Haematol. 169 (2015): 57-70

Wiedl, T. et al., J Proteomics.74 (2011): 1884-1894

Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423

Willoughby, V. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol. 16 (2008): 344-348 Wittke, I. et al., Cancer Lett.162 (2001): 237-243

Wojtalewicz, N. et al., PLoS.One. 9 (2014): e90461

Wong, N. et al., Cancer Lett.356 (2015): 184-191

Woo, T. et al., PLoS.One.10 (2015): e0142642

World Cancer Report, (2014)

Wu, G. et al., Onco.Targets.Ther.8 (2015): 2067-2074

Wu, S. et al., Acta Biochim.Biophys.Sin.(Shanghai) 45 (2013): 27-35 Wu, X. et al., Cancer Res 70 (2010): 2718-2727

Xiang, Y. et al., J Clin Invest 125 (2015): 2293-2306

Xu, J. et al., Genet.Mol.Res 13 (2014): 5732-5744

Xu, X. et al., Oncotarget.6 (2015): 26161-26176

Xue, L. Y. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi.32 (2010): 838-844

Yager, M. L. et al., Br.J Cancer 89 (2003): 860-863

Yamaguchi, T. et al., Dis.Colon Rectum 49 (2006): 399-406

Yamamoto, M. et al., PLoS.One. 6 (2011): e17149

Yamamoto, N. et al., Int.J Oncol 42 (2013): 1523-1532

Yang, C. et al., Tumour.Biol (2015a)

Yang, C. et al., Exp.Cell Res 331 (2015b): 377-386

Yang, H. Y. et al., J Proteomics. 75 (2012): 3639-3653

Yang, J. Y. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 388

1

Yang, S. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015c): 1265-1275 Yang, W. et al., Cancer Lett.339 (2013): 153-158

Yang, W. et al., Nature 499 (2013a): 491-495

Yang, W. et al., Int.J Oncol 42 (2013b): 690-698

Yao, M. et al., Cancer Med. 3 (2014): 845-854

Yao, R. et al., Histol.Histopathol. 22 (2007): 1025-1032

Yu, D. et al., Oncotarget.6 (2015a): 7619-7631

Yu, X. et al., Cancer Res 73 (2013): 2093-2103

Yu, Y. et al., Cancer Cell 28 (2015b): 82-96

Yuan, B. et al., Immunobiology 217 (2012): 738-742

Zang, W. et al., Mol.Cancer 14 (2015): 37

Zanini, S. et al., Cell Signal. 27 (2015): 899-907

Zare, M. et al., Mol.Carcinog 51 (2012): 796-806

Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Zha, C. et al., PLoS.One.10 (2015): e0122322

Zhang, D. et al., J Cell Mol.Med. 16 (2012): 1047-1059 Zhang, H. Y. et al., Mol.Biol Rep. 41 (2014): 5519-5524 Zhang, Q. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015a): 691-703 Zhang, S. et al., Cancer Res 64 (2004): 2977-2983

Zhang, S. et al., J Mol.Histol.45 (2014): 283-292

Zhang, S. N. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi.85 (2005): 1348-1351 Zhang, T. et al., Mol.Cancer 9 (2010): 72

Zhang, X. et al., Int.J Cancer 137 (2015b): 2803-2814 Zhang, X. et al., Tumour.Biol 36 (2015c): 5979-5985

Zhang, X. et al., PLoS.One.8 (2013): e72458

Zhang, Y. et al., Cancer Metastasis Rev 34 (2015d): 249-264 Zhang, Z. Z. et al., Mol.Cancer Ther.14 (2015e): 1162-1170

1

Zhao, D. et al., J Neurooncol. 118 (2014a): 39-47

Zhao, G. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.408 (2011): 154-159 Zhao, H. et al., Gene 548 (2014b): 234-243

Zhao, L. J. et al., Chin Med.J (Engl.) 126 (2013): 4260-4264 Zheng, Q. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 6255-6264

Zheng, R. et al., Int.Immunopharmacol.29 (2015): 919-925

Zhi, H. et al., J Pathol.217 (2009): 389-397

Zhou, Y. F. et al., World J Gastroenterol.20 (2014): 13172-13177 Zhu, H. et al., Cancer Lett.245 (2007a): 303-314

Zhu, L. et al., J Dermatol.Sci.72 (2013a): 311-319

Zhu, S. et al., J Biol Chem 282 (2007b): 14328-14336

Zhu, Y. et al., Prostate 73 (2013b): 1614-1622

Zhu, Y. P. et al., Oncotarget.6 (2015): 14488-14496

1

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ser Leu Tyr Asn Leu Gly Gly Ser Lys Arg Ile Ser Ile 1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Thr Ala Ser Ala Ile Thr Pro Ser Val

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ala Leu Phe Gly Thr Ile Leu Glu Leu

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asn Leu Met Ala Ser Gln Pro Gln Leu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Leu Leu Ser Gly Asp Leu Ile Phe Leu

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

11

Ser Ile Phe Glu Gly Leu Leu Ser Gly Val

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Ala Leu Leu Asp Gly Gly Ser Glu Ala Tyr Trp Arg Val 1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Ser Leu Asp Glu Asn Ser Asp Gln Gln Val

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Ala Leu Trp Leu Pro Thr Asp Ser Ala Thr Val

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Gly Leu Ala Ser Arg Ile Leu Asp Ala

1 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ser Leu Ser Pro Val Ile Leu Gly Val 1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Arg Leu Pro Asn Ala Gly Thr Gln Val 1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Leu Leu Ala Asn Gly Val Tyr Ala Ala 1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Val Leu Ala Glu Gly Gly Glu Gly Val 1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

Phe Leu Leu Asp Gln Val Gln Leu Gly Leu

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Gly Leu Ala Pro Phe Leu Leu Asn Ala Val

1 5 10

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ile Ile Glu Val Asp Pro Asp Thr Lys Glu Met Leu 1 5 10

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Ile Val Arg Glu Phe Leu Thr Ala Leu

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Lys Leu Asn Asp Thr Tyr Val Asn Val

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Lys Leu Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu

1 5

11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Leu Leu Phe Ala Gly Thr Met Thr Val 1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Leu Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala 1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Met Leu Ala Glu Lys Leu Leu Gln Ala 1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Asn Leu Arg Glu Gly Asp Gln Leu Leu 1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Ser Leu Asp Gly Phe Thr Ile Gln Val 1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Ser Leu Asp Gly Thr Glu Leu Gln Leu

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Ser Leu Asn Gly Asn Gln Val Thr Val

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Val Leu Pro Lys Leu Tyr Val Lys Leu

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val

1 5

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Gly Leu Asp Val Thr Ser Leu Arg Pro Phe Asp Leu 1 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Ser Leu Val Ser Glu Gln Leu Glu Pro Ala

1 5 10

<210> 35

11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Leu Leu Arg Phe Ser Gln Asp Asn Ala

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

Phe Leu Leu Arg Phe Ser Gln Asp Asn Ala

1 5 10

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

Tyr Thr Gln Pro Phe Ser His Tyr Gly Gln Ala Leu 1 5 10

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

Ile Ala Ala Ile Arg Gly Phe Leu Val

1 5

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Leu Val Arg Asp Thr Gln Ser Gly Ser Leu

1 5 10

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

11

Gly Leu Ala Phe Ser Leu Tyr Gln Ala

1 5

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu

1 5 10

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

Thr Gln Thr Ala Val Ile Thr Arg Ile

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Lys Val Val Gly Lys Asp Tyr Leu Leu

1 5

<210> 44

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

Ala Thr Gly Asn Asp Arg Lys Glu Ala Ala Glu Asn Ser Leu 1 5 10

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu

1 5

<210> 46

<211> 11

11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

Tyr Thr Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Ala Leu 1 5 10

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

Val Leu Ala Ser Gly Phe Leu Thr Val

1 5

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

Ser Met His Gln Met Leu Asp Gln Thr Leu

1 5 10

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Gly Leu Met Lys Asp Ile Val Gly Ala

1 5

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

Gly Met Asn Pro His Gln Thr Pro Ala Gln Leu 1 5 10

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

Lys Leu Phe Gly His Leu Thr Ser Ala

11

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

Val Ala Ile Gly Gly Val Asp Gly Asn Val Arg Leu 1 5 10

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

Val Val Val Thr Gly Leu Thr Leu Val

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val Lys Met

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

Gly Ala Ile Asp Leu Leu His Asn Val

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

Ala Leu Val Glu Val Thr Glu His Val

1 5

<210> 57

<211> 10

<212> PRT

11

<213> Homo sapiens

<400> 57

Gly Leu Ala Pro Asn Thr Pro Gly Lys Ala 1 5 10

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

Leu Ile Leu Glu Ser Ile Pro Val Val

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

Ser Leu Leu Asp Thr Leu Arg Glu Val

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

Val Val Met Glu Glu Leu Leu Lys Val

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

Thr Gln Thr Thr His Glu Leu Thr Ile

1 5

<210> 62

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

Ala Leu Tyr Glu Tyr Gln Pro Leu Gln Ile 1 5 10

12 <211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Leu Ala Tyr Thr Leu Gly Val Lys Gln Leu

1 5 10

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

Gly Leu Thr Asp Val Ile Arg Asp Val

1 5

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Tyr Val Val Gly Gly Phe Leu Tyr Gln Arg Leu 1 5 10

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

Leu Leu Asp Glu Lys Val Gln Ser Val

1 5

<210> 67

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

Ser Met Asn Gly Gly Val Phe Ala Val

1 5

<210> 68

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 1 5 10

<210> 69

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Gly Leu Leu Val Gly Ser Glu Lys Val Thr Met

1 5 10

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70

Phe Val Leu Asp Thr Ser Glu Ser Val

1 5

<210> 71

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

Ala Ser Asp Pro Ile Leu Tyr Arg Pro Val Ala Val 1 5 10

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

Phe Leu Pro Pro Ala Gln Val Thr Val

1 5

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

Lys Ile Thr Glu Ala Ile Gln Tyr Val

1 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Ile Leu Ala Ser Leu Ala Thr Ser Val

1 5

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

Gly Leu Met Asp Asp Val Asp Phe Lys Ala 1 5 10

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

Lys Val Ala Asp Tyr Ile Pro Gln Leu

1 5

<210> 77

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

Val Leu Val Pro Tyr Glu Pro Pro Gln Val 1 5 10

<210> 78

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

Lys Val Ala Asn Ile Ile Ala Glu Val

1 5

<210> 79

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

12

Gly Gln Asp Val Gly Arg Tyr Gln Val

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

Ala Leu Gln Glu Ala Leu Glu Asn Ala

1 5

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

Ala Val Leu Pro His Val Asp Gln Val

1 5

<210> 82

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

His Leu Leu Gly His Leu Glu Gln Ala

1 5

<210> 83

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83

Ala Leu Ala Asp Gly Val Val Ser Gln Ala 1 5 10

<210> 84

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 84

Ser Leu Ala Glu Ser Leu Asp Gln Ala

1 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 85

Asn Ile Ile Glu Leu Val His Gln Val 1 5

<210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 86

Gly Leu Leu Thr Glu Ile Arg Ala Val 1 5

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 87

Phe Leu Asp Asn Gly Pro Lys Thr Ile 1 5

<210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88

Gly Leu Trp Glu Gln Glu Asn His Leu 1 5

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 89

Ser Leu Ala Asp Ser Leu Tyr Asn Leu 1 5

<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90

12 Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu

1 5

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

Lys Leu Ile Asp Asp Val His Arg Leu

1 5

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 92

Ser Ile Leu Arg His Val Ala Glu Val

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 93

Val Leu Ile Asn Thr Ser Val Thr Leu

1 5

<210> 94

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 94

Thr Leu Leu Gln Glu Gln Gly Thr Lys Thr Val 1 5 10

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 95

Leu Ile Gln Asp Arg Val Ala Glu Val

1 5

<210> 96

12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

Gly Ala Ala Val Arg Ile Gly Ser Val Leu 1 5 10

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 97

Glu Leu Asp Arg Thr Pro Pro Glu Val

1 5

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 98

Val Leu Phe Pro Asn Leu Lys Thr Val

1 5

<210> 99

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 99

Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu 1 5 10

<210> 100

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 100

Gly Leu Tyr Pro Asp Ala Phe Ala Pro Val 1 5 10

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 101

12

Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val

1 5

<210> 102

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102

Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10

<210> 103

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 103

Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile

1 5

12

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 9; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u medicini.

2. Peptid za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.

3. Peptid za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina koji sadrži N-terminalne 80 aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii).

4. T-ćelijski receptor, poželjno rekombinantni, solubilni ili vezan za membranu T-ćelijski receptor koji je specifično reaktivan sa HLA ligandom kada je vezan za HLA molekul, naznačeno time što se navedeni ligand sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV 9.

5. Antitelo, konkretno solubilno ili antitelo vezano za membranu, koje specifično prepoznaje peptid za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1, poželjno peptid za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1 kada je vezan za MHC molekul.

6. Nukleinska kiselina koja kodira peptid za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 3, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, opciono povezana sa heterolognom promoterskom sekvencom, ili vektor ekspresije koji eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu.

7. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži peptid za upotrebu u skladu patentnim zahtevom 1 ili 3, ili nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno antigen-prezentujuća ćelija kao što je dendritična ćelija, ili naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno T ćelija ili NK ćelija.

8. Metod za proizvodnju peptida za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 3, ili za proizvodnju T-ćelijskog receptora u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili antitela u skladu sa patentnim zahtevom 5, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 7 koja prezentuje peptid za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili eksprimira nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, i izolovanja peptida ili TCR ili antitela iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

9. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih T limfocita, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigenspecifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1.

10. Aktivirani T limfocit, proizveden pomoću metoda u skladu sa patentnim zahtevom 9, koji selektivno prepoznaje ćeliju koja prezentuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u patentnom zahtevu 1.

11. Farmaceutska smeša koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4, i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, dodatne farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore za upotrebu u medicini.

12. Peptid za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili farmaceutska smeša za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 11, za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u lečenju raka.

13. Peptid za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, T-ćelijski receptor u

1

skladu sa patentnim zahtevom 4 ili farmaceutska smeša za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 11, za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačeno time što je navedeni rak izabran iz grupe koju čine rak jajnika, nesitnoćelijski karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, rak bubrega, rak mozga, rak kolona ili rektuma, rak želuca, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jednjaka, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese, rak žučnih puteva i drugi tumori koji pokazuju prekomernu ekspresiju proteina iz kojeg je dobijen peptid u skladu sa ID BR. SEKV 9.

1 1