JP2578363B2

JP2578363B2 - 陽イオン交換樹脂

Info

Publication number: JP2578363B2
Application number: JP63265685A
Authority: JP
Inventors: 嘉則井上; 浩樹熊谷
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 1987-10-27
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 1997-02-05
Anticipated expiration: 2012-02-05
Also published as: JPH01315348A

Description

【発明の詳細な説明】＜産業上の利用分野＞本発明は、クロマト管に充填されタンパク質が共存し
ている試料中の陽イオンを液体クロマトグラフィー手法
（イオンクロマトグラフィー手法も含む）を用いて定量
分析するのに用いて好適な陽イオン交換樹脂（充填剤）
に関する。

＜従来の技術＞一般に、タンパク質が共存している試料中の陽イオン
を液体クロマトグラフィー手法（イオンクロマトグラフ
ィー手法も含む）を用いて定量分析すると次のような問
題が生じていた。即ち、分離カラム内に充填された陽イ
オン交換樹脂の表面若しくはイオン交換基に試料中のタ
ンパク質などが吸着し、みかけ上のイオン交換容量が低
下して陽イオンの分離性能が低下したり定量性が低下す
ることが多かった。また、このようにして吸着したタン
パク質が蓄積することにより上記分離カラムの圧力が上
昇することも多く、このような圧力上昇が生ずると上記
分離カラムの再生は実際上不可能となっていた。このよ
うな問題を解決する方法としては、試料からあらかじめ
タンパク質を除去する方法，上記分離カラムを頻繁に洗
浄して吸着したタンパク質を除去する方法，及びタンパ
ク質を吸着するプレカラムを備えた切換弁を分離カラム
の前に設置してタンパク質を除去する方法などが行なわ
れていた。

＜発明が解決しようとする問題点＞然しながら、試料からあらかじめタンパク質を除去す
る方法の場合、第１に試料の前処理に時間がかかるこ
と、第２に除タンパク剤が測定対象イオンの分離に悪影
響を及ぼす可能性があること、第３に沈澱などで除去さ
れるタンパク質の中に目的成分が取りこまれてしまうこ
となどの欠点があった。また、分離カラムを頻繁に洗浄
して吸着したタンパク質を除去する方法の場合は、第１
に分析を一旦停止しカラムに移動相と異なる溶媒を流さ
なければならず、分析の連続性を維持したりメンテナン
スの効率確保などの面から好ましいことではないこと、
第２に一旦吸着したタンパク質は簡単に洗い流すことが
できず結果的にカラムの消耗が早いという欠点があっ
た。タンパク質を吸着するプレカラムを分離カラムの前
に設置してタンパク質を除去する方法は、上述のような
欠点がなく現在では最も優れた方法であるが、装置が複
雑なうえプレカラム（吸着カラム）のメンテナンスが必
要となるという新たな欠点があった。

本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、
その目的は、クロマト管に充填されタンパク質が共存し
ている試料中の陽イオンを液体クロマトグラフィー手法
（イオンクロマトグラフィー手法も含む）を用いて定量
分析するのに好適な陽イオン交換樹脂（充填剤）を提供
することにある。

＜問題点を解決するための手段＞このような目的を達成するために、本発明は、（１）タンパク質が共存している水溶液中の陽イオンを
分離、定量する球状体の陽イオン交換樹脂において、前記球状体は、表面に結合されていて、前記タンパク質が帯電する電
荷に反発する正の電荷を有する固定タンパク質と、構造のいたるところにあって、前記タンパク質の分子
径より小さな径の微細孔と、この微細孔の内部表面に結合されていて、前記微細孔
に入った前記陽イオンをイオン交換する陽イオン交換基
と、を具備し、前記タンパク質が正電荷を有するpH領域で
前記陽イオンを定量分析することを特徴としている。」（２）前記固定タンパク質はアルブミン（牛血清）若し
くはアミノ基をもつ多糖類であることを特徴としてい
る。

＜実施例＞以下、本発明について図を用いて詳細に説明する。第
１図は、本発明の陽イオン交換樹脂の構成図で、一部を
拡大して示したものである。

陽イオン交換樹脂は、球状体をしていて、基材Ａの表
面には移動相のpH値が約４のとき弱い正電荷を有してい
る固定タンパク質（例えば、アルブミン（牛血清）やア
ミノ基を有する多糖類）Ｂが多数結合している。また、
陽イオン交換樹脂Ａの表面の一部には微細孔（図中で
は、楔状に示した部分、以下、細孔Ｄという）があり、
この細孔Ｄには陽イオン交換基Ｃが多数結合している。
このような構造の陽イオン交換樹脂において、試料中の
タンパク質Ｐは分子半径が大きいため細孔Ｄに入れず、
しかも正の電荷を有しているため上記アルブミンやアミ
ノ基を有する多糖類Ｂによってイオン排除される。ま
た、試料中の陽イオンS⁺は細孔Ｄ内の陽イオン交換基Ｃ
と陽イオン交換し、試料中の陰イオンS^-は上記固定タン
パク質（例えば、アルブミンやアミノ基を有する多糖
類）Ｂと極めて弱い陰イオン交換するようになってい
る。

第２図は、本発明に係わる陽イオン交換樹脂の製造方
法を説明するための工程説明図である。以下、この図を
用いて本発明の第１実施例及び第２実施例について詳説
する。

本発明の第１実施例の場合、第２図において、最初、
反応方法に合わせて一定の官能基をもつ高分子ゲルを用
意する。これは、基材となるものであり、具体的には、
エポキシ基が350μmol/g導入された粒子径12μｍのヒド
ロキシアルキルメタクリレート系架橋高分子ゲルなどが
該当する。尚、反応方法に合わせて一定の官能基を導入
した樹脂を作っても良い。次に、上記高分子ゲルをタン
パク質が固定化されやすい緩衝液中に分散させる。具体
的には、上記ヒドロキシアルキルメタクリレート系架橋
高分子ゲルの5g（乾燥重量）を、20mlの１％アルブミン
（牛血清）を含むpH9のトリス−塩酸緩衝液中に分散さ
せる。その後、該分散溶液（スラリー）中に、結合させ
るタンパク質を混合し固定化させ、反応終了後、上記緩
衝液で充分洗浄する。具体的には、30℃のインキュベー
タの中で12時間反応させ、反応終了後、上記緩衝液で充
分洗浄する。次に、イオン交換基となる化合物を混合
し、一定温度（タンパク質の変性を避けるため室温以下
が好ましい）の下で一定時間反応させる。具体的には、
γ−ヒドロキシプロピルスルホン酸溶液中に分散させ、
20℃で８時間反応させる。次に、反応によって生じた樹
脂を緩衝液で洗浄してのち充分に水洗し、その後、目的
の対イオンに交換する。具体的には、反応によって生じ
た樹脂を50mlの緩衝液で洗浄してのち100mlの純水で充
分に洗浄し、その後、0.5Mの塩化ナトリウム水溶液中に
分散させ過し、更に、0.5Mの塩化ナトリウム水溶液50
mlで洗浄した後、純水で充分に洗浄し、0.1Mの塩化ナト
リウム水溶液中に分散し１晩放置する。上述のようにし
て得られた陽イオン交換樹脂は、35μEq/mlのイオン交
換容量を持っていた。また、この陽イオン交換樹脂は、
例えば、内径5.0mm、長さ100mmのステンレス製クロマト
管に高圧スラリー充填法を用いて充填し、イオンクロマ
トグラフや液体クロマトグラフ用分離カラム等として使
用される。

ところで、上記基材としては、比較的親水性の多孔性
架橋高分子ゲルでその表面に一定の官能基を有している
か、その表面にタンパク質が結合できるような官能基を
導入できる樹脂でなければならない。更に、このような
樹脂の持つ細孔は、結合したり試料中に存在するタンパ
ク質が浸透できないか若しくは僅かしか浸透できない程
度に小さくなければならない。具体的には、下記（イ）
又は（ロ）のような樹脂が望ましい。

（イ）カルボニル基，アミノ基，ホルミル基，水酸基，
又はエポキシ基などを有するポリメタクリレート樹脂，
ポリビニルアルコール樹脂，若しくはポリエーテル樹脂
など。

（ロ）ハロゲン基または水酸基を有し、且つ、上記官能
基およびタンパク質が化学的に結合できる官能基の導入
が可能なポリメタクリレート樹脂，ポリビニルアルコー
ル樹脂，若しくはポリエーテル樹脂など。

また、上記表面結合タンパク質は、前記基材の官能基
と反応し且つ前記基材の細孔内部には浸透できないよう
な分子半径を持ち使用する移動相中で負の電荷を示すよ
うな等電点を持つタンパク質でなければならない。

更に、上記細孔内部のイオン交換基は、基材細孔内部
に充分浸透できタンパク質と未反応の官能基（必ずしも
タンパク質を結合させた官能基と同じでなくとも良い）
と反応して陽イオン交換基となる物質でなければならな
い。具体的にはヒドロキシアルキルスルホン酸類，ヒド
ロキシアルキルカルボン酸類，ヒドロキシアルキルホス
ホン酸類，ハロゲン化アルキルスルホン酸類，ハロゲン
化アルキルカルボン酸類，ハロゲン化アルキルホスホン
酸類，アミノアルキルスルホン酸類，アミノアルキルカ
ルボン酸類，アミノアルキルホスホン酸類，亜硫酸ナト
リウムなどが該当する。

本発明の第２実施例の場合、第２図において、最初、
反応方法に合わせて一定の官能基をもつ高分子ゲルを用
意する。これは、基材となるものであり、具体的には、
エポキシ基が350μmol/g導入された粒子径12μｍのヒド
ロキシアルキルメタクリレート系架橋高分子ゲルなどが
該当する。尚、反応方法に合わせて一定の官能基を導入
した樹脂を作っても良い。次に、上記高分子ゲルをタン
パク質が固定化されやすい緩衝液中に分散させる。具体
的には、上記ヒドロキシアルキルメタクリレート系架橋
高分子ゲルの5g（乾燥重量）を、20mlの１％キトサンを
含む0.5％酢酸水溶液中に分散させ45％ホウフッ化亜鉛
水溶液0.05gを加える。その後、該分散溶液（スラリ
ー）中に、結合させるタンパク質を混合し固定化させ、
反応終了後、上記緩衝液で充分洗浄する。具体的には、
50℃のインキュベータの中で４時間反応させ、反応終了
後、純水で充分洗浄する。次に、イオン交換基となる化
合物を混合し、一定温度（タンパク質の変性を避けるた
め室温以下が好ましい）の下で一定時間反応させる。具
体的には、γ−ヒドロキシプロピルスルホン酸溶液中に
分散させ、20℃で８時間反応させ、該反応によって生じ
た樹脂を純水で洗浄し0.1Mの硫酸水溶液中に分散させ30
℃で２時間反応させる。次に、反応によって生じた樹脂
を緩衝液で洗浄してのち充分に水洗し、その後、目的の
対イオンに交換する。具体的には、反応によって生じた
樹脂を純水100mlで洗浄したのち0.5Mの塩化ナトリウム
水溶液50mlで洗浄した後、純水で充分に洗浄し、0.1Mの
塩化ナトリウム水溶液中に分散し１晩放置する。上述の
ようにして得られた陽イオン交換樹脂は、35μEq/mlの
イオン交換容量を持っていた。また、この陽イオン交換
樹脂は、例えば、内径5.0mm、長さ100mmのステンレス製
クロマト管に高圧スラリー充填法を用いて充填し、イオ
ンクロマトグラフや液体クロマトグラフ用分離カラム等
として使用される。

ところで、上記基材としては、比較的親水性の多孔性
架橋高分子ゲルでその表面に多糖類及び反応性基を有す
る多糖類が結合できる官能基を有しているか、その表面
に多糖類及び反応性基を有する多糖類が結合できるよう
な官能基を導入できる樹脂でなければならない。尚、多
糖類とは、特に説明がない限り、本明細書では反応性の
官能基（例えばエポキシ基など）を導入した多糖類も含
むものとする。更に、このような樹脂の持つ細孔は、結
合したり試料中に存在するタンパク質が浸透できないか
若しくは僅かしか浸透できない程度に小さくなければな
らない。具体的には、下記（イ）又は（ロ）のような樹
脂が望ましい。

（イ）カルボニル基，アミノ基，トシル基，水酸基，又
はエポキシ基などを有するポリメタクリレート樹脂，ポ
リビニルアルコール樹脂，若しくはポリエーテル樹脂な
ど。

（ロ）ハロゲン基または水酸基を有し、且つ、上記官能
基および多糖類が化学的に結合できる官能基の導入が可
能なポリメタクリレート樹脂，ポリビニルアルコール樹
脂，若しくはポリエーテル樹脂など。

また、上記アミノ基を有する表面結合多糖類は、前記
基材の官能基と反応し且つ前記基材の細孔内部には浸透
できないような分子量をもつものでなければならない。

更に、上記細孔内部のイオン交換基は、基材細孔内部
に充分浸透できるような低分子量物質で、アミノ基を有
する多糖類と未反応の細孔内部官能基（必ずしもアミノ
基を有する多糖類を結合させた官能基と同じでなくとも
良い）と反応して陽イオン交換基となる物質でなければ
ならない。具体的にはヒドロキシアルキルスルホン酸
類，ヒドロキシアルキルスルホン酸類，ヒドロキシアル
キルカルボン酸類，ヒドロキシアルキルホスホン酸類，
ハロゲン化アルキルスルホン酸類，ハロゲン化アルキル
カルボン酸類，ハロゲン化アルキルホスホン酸類，アミ
ノアルキルスルホン酸類，アミノアルキルカルボン酸
類，アミノアルキルホスホン酸類，亜硫酸ナトリウムな
どが該当する。

一方、第３図は一般的なイオンクロマトグラフ装置の
構成説明図であり、送液ポンプ２が駆動すると、溶離液
槽1a内の溶離液が、送液ポンプ２→インジェクタ３→プ
レカラム４→分離カラム５→検出器６を経由し、廃液槽
1bへと流れる。尚、プレカラム4,分離カラム5,および検
出器６は、恒温槽７内に収納されて一定温度（例えば40
℃）に保たれると共に、送液ポンプ2,インジェクタ3,プ
レカラム4,分離カラム5,および検出器６が分析装置の筐
体９内に収納されていることが多い。このような構成か
らなるイオンクロマトグラフ装置において、インジェク
タ３に一定量注入された試料に含まれている陽イオン
は、分離カラム５で分離されてのち検出器６で検出され
た信号は、表示装置８（例えば記録計）に導かれたクロ
マトグラムを描くようになっている。

前述のようにして製造した陽イオン交換樹脂を分離カ
ラム５内に充填すると共に、2mMエチレンジアミン/4mM
酒石酸（pHは3.6）を移動相としてアルカリ土類金属イ
オンを分析したところ、Mg²⁺イオンとCa²⁺イオンを良好
に分離することができた。また、同一の条件で、0.2％
のアルブミンを含む試料中のアルカリ土類金属イオンを
分析したところ、この場合もMg²⁺イオンとCa²⁺イオンを
良好に分離することができた。一方、前述のようにして
製造した陽イオン交換樹脂を、内径5.0mm、長さ100mmの
ステンレス製クロマト管に高圧スラリー充填法を用いて
充填し、リン酸緩衝液中でタンパク質の回収率を測定し
たところアルブミンで約95％の値が得られた。また、2m
Mエチレンジアミン/4mM酒石酸（pHは3.6）中での回収率
は約90％であった。これらのことから、前述のようにし
て製造した陽イオン交換樹脂を使用すれば、タンパク質
が共存する試料中の低分子陽イオンをタンパク質の影響
を受けること無く分析できることが分かる。

次に、本発明の陽イオン交換樹脂を用いてイオン交換
クロマトグラフィーを行うとき、試料成分が充填剤へ保
持される挙動について第１図を用いて説明する。まず、
タンパク質は両性電解質で、そのおかれる環境（例えば
溶液中）のpH値によって正の電荷になったり負の電荷に
なったりする。例えば、充填剤に結合されたタンパク質
の等電点が５であるとpH値４の緩衝液中では正の電荷を
帯びてくる。また、充填剤に結合された多糖類中のアミ
ノ基も、pH値４の緩衝液中では正の電荷を帯びている。
このとき、充填剤細孔内部のイオン交換基がスルホン酸
型（スルホン基）であれば、この緩衝液中でも解離して
おり負の電荷を帯びている。このような充填剤は低分子
陽イオンが近づくと、上記陽イオン交換樹脂の表面のタ
ンパク質や多糖類の正の電荷によりイオン排除される
が、細孔内部の陽イオン交換基の負電荷のほうが強いた
め細孔内部の陽イオン交換基の負電荷のほうが強いため
細孔内部に低分子陽イオンが入りイオン交換吸着され
る。また、この充填剤に等電点が緩衝液よりも大きいタ
ンパク質が近づくと、試料タンパク質もまた正の電荷を
帯びているため、上記陽イオン交換樹脂の表面の正の電
荷によりイオン排除を受ける。しかし、タンパク質は分
子量が大きく細孔内部には浸透できず、細孔内のイオン
交換基とイオン交換吸着できずに溶出されてしまう。実
際には、若干の疎水的吸着があるため、充填剤には若干
保持される。低分子陰イオンの場合は、樹脂表面のタン
パク質や多糖類の正の電荷にイオン交換吸着するが、表
面の正電荷は極微量であるため濃度の小さい移動相でも
簡単に樹脂から脱離してしまう。試料中にタンパク質と
低分子陽イオンが共存している場合は、上記２つの現象
が同時におこり、低分子陽イオンだけが充填剤に保持さ
れて分離されるようになる。

＜発明の効果＞以上詳しく説明したように本発明の実施例によれば、
クロマト管に充填されたタンパク質が共存している試料
中の陽イオンを液体クロマトグラフィー手法（イオンク
ロマトグラフィー手法も含む）を用いて定量分析するの
に用いて好適な陽イオン交換樹脂（充填剤）を実現する
ことができる。また、このようにして製造された陽イオ
ン交換樹脂は、タンパク質や多糖類で基材の表面を被覆
したことで、タンパク質などを含む試料中の低分子陽イ
オンをタンパク質の影響なしに測定できるという利点が
ある。更に、タンパク質などを含む試料を直接注入でき
洗浄などの余分な操作を必要としないため、分析条件が
簡単で測定時間が大幅に減少するという利点もある。ま
た、試料中のタンパク質などがカラム充填剤へ吸着する
ことによって引起こされるイオン交換容量の見掛け上の
減少に起因する保持時間の短縮という問題も無くなり、
結果的に再現姓の良いクロマトグラムが得られるという
利点もある。更に、試料中のタンパク質などがカラム充
填剤へ吸着することなどによるカラム圧力の上昇などに
起因するカラム性能の劣化がなくなりカラムの延命化が
図れるという利点もある。また、前記第２実施例の場合
は、多糖類を結合させたことにより基材自身が多糖類に
覆われ、基材の疎水性が抑えられ、充填剤がより親水性
の樹脂になるという副次的効果が得られる利点もある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の陽イオン交換樹脂の構成図、第２図は
本発明の陽イオン交換樹脂の製造方法を説明するための
工程説明図、第３図は一般的なイオンクロマトグラフ装
置の構成説明図である。Ａ……基材、Ｂ……タンパク質またはアミノ基をもつ多
糖類、Ｃ……陽イオン交換基、Ｄ……クサビ形にモデル
化される細孔、ｐ……試料中のタンパク質、S⁺……試料
中の陽イオン、S^-……試料中の陰イオン

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質が共存している水溶液中の陽イ
オンを分離、定量する球状体の陽イオン交換樹脂におい
て、前記球状体は、表面に結合されていて、前記タンパク質が帯電する電荷
に反発する正の電荷を有する固定タンパク質と、構造のいたるところにあって、前記タンパク質の分子径
より小さな径の微細孔と、この微細孔の内部表面に結合されていて、前記微細孔に
入った前記陽イオンをイオン交換する陽イオン交換基
と、を具備し、前記タンパク質が正電荷を有するpH領域で前
記陽イオンを定量分析することを特徴とした陽イオン交
換樹脂。
【請求項２】前記固定タンパク質はアルブミン（牛血
清）若しくはアミノ基をもつ多糖類であることを特徴と
した請求項１記載の陽イオン交換樹脂。