JP2830107B2

JP2830107B2 - 陰イオン交換樹脂

Info

Publication number: JP2830107B2
Application number: JP1185397A
Authority: JP
Inventors: 嘉則井上; 浩樹熊谷
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 1989-07-18
Filing date: 1989-07-18
Publication date: 1998-12-02
Anticipated expiration: 2013-12-02
Also published as: JPH0352648A

Description

【発明の詳細な説明】＜産業上の利用分野＞本発明は、クロマト管に充填されタンパク質が共存し
ている試料中の陰イオンを液体クロマトグラフィー手法
（イオンクロマトグラフィー手法も含む）を用いて定量
分析するのに用いて好適な陰イオン交換樹脂（充填剤）
に関する。

＜従来の技術＞一般に、タンパク質が共存している試料中の陰イオン
を液体クロマトグラフィー手法（イオンクロマトグラフ
ィー手法も含む）を用いて定量分析すると次のような問
題が生じていた。即ち、分離カラム内に充填された陰イ
オン交換樹脂の表面若しくはイオン交換基に試料中のタ
ンパク質などが吸着し、みかけ上のイオン交換容量が低
下して陰イオンの分離性能が低下したり定量性が低下す
ることが多かった。また、このようにして吸着したタン
パク質が蓄積することにより上記分離カラムの圧力が上
昇することも多く、このような圧力上昇が生ずると上記
分離カラムの再生は実際上不可能となっていた。このよ
うな問題を解決する方法としては、試料からあらかじめ
タンパク質を除去する方法，上記分離カラムを頻繁に洗
浄して吸着したタンパク質を除去する方法，及びタンパ
ク質を吸着するプレカラムを備えた切換弁を分離カラム
の前に設置してタンパク質を除去する方法などが行なわ
れていた。

＜発明が解決しようとする問題点＞然しながら、試料からあらかじめタンパク質を除去す
る方法の場合、第１に試料の前処理に時間がかかるこ
と、第２の除タンパク剤が測定対象イオンの分離に悪影
響を及ぼす可能性があること、第３に沈澱などで除去さ
れるタンパク質の中に目的成分が取りこまれてしまうこ
となどの欠点があった。また、分離カラムを頻繁に洗浄
して吸着したタンパク質を除去する方法の場合は、第１
に分析を一旦停止しカラムに移動相と異なる溶媒を流さ
なければならず、分析の連続性を維持したりメンテナン
スの効率確保などの面から好ましいことではないこと、
第２に一旦吸着したタンパク質は簡単に洗い流すことが
できず結果的にカラムの消耗が早いという欠点があっ
た。タンパク質を吸着するプレカラムを分離カラムの前
に設置してタンパク質を除去する方法は、上述のような
欠点がなく現在では最も優れた方法であるが、装置が複
雑なうえプレカラム（吸着カラム）のメンテナンスが必
要となるという新たな欠点があった。

本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、
その目的は、クロマト管に充填されタンパク質が共存し
ている試料中の陰イオンを液体クロマトグラフィー手法
（イオンクロマトグラフィー手法も含む）を用いて定量
分析するのに用いて好適な陰イオン交換樹脂を提供する
ことにある。

＜問題点を解決するための手段＞このような目的を達成するために、本発明は、タンパク質が共存している水溶液中の陰イオンを分
離、定量する球状体の陰イオン交換樹脂において、前記球状体は、表面に結合されていて、前記タンパク質が帯電する電
荷に反発する負の電荷を有するポリマーと、構造のいたるところにあって、前記タンパク質の分子
径より小さな径の微細孔と、この微細孔の内部表面に結合されていて、前記微細孔
に入った前記陰イオンをイオン交換する陰イオン交換基
と、を具備し、前記タンパク質が負電荷を有するpH領域で
前記陰イオンを定量分析することを特徴としている。

＜実施例＞以下、本発明について図を用いて詳細に説明する。

第１図は、本発明の陰イオン交換樹脂の構成図で、一
部を拡大して示したものである。

陰イオン交換樹脂は、球状体をしていて、その表面に
はpH値が約10のとき弱い負電荷を有しているポリマーＢ
（例えば、カルボキシル基など）が多数結合している。
また、陰イオン交換樹脂Ａの表面の一部には微細孔（図
中では、楔状に示した部分、以下、細孔Ｄという）があ
り、この細孔Ｄには陰イオン交換基Ｃが多数結合してい
る。このような構造の陰イオン交換樹脂において、試料
中のタンパク質Ｐは分子半径が大きいため細孔Ｄに入れ
ず、しかも負の電荷を有しているため上記ポリマーＢに
よってイオン排除される。また、試料中の陰イオンS^-は
細孔Ｄ内の陰イオン交換基Ｃと陰イオン交換し、試料中
の陽イオンS⁺は上記ポリマーＢと極めて弱い陽イオン交
換するようになっている。

図２は、本発明に係わる陰イオン交換樹脂の製造方法
を説明するための工程説明図である。この図において、
最初、反応方法に合わせて一定の官能基をもつ高分子ゲ
ルを用意するか反応方法に合わせて一定の官能基を導入
した樹脂を作る。これは、基材となるものである。例示
するならば、エポキシ基が350μmol/g導入された粒子径
12μｍのヒドロキシアルキルメタクリレート系架橋高分
子ゲルなどが挙げられる。

次に、上記高分子ゲルを負電荷をもつ合成高分子物質
が固定化されやすい緩衝液中に分散させる。例示するな
らば、上記ヒドロキシアルキルメタクリレート系架橋高
分子ゲルの5g（乾燥重量）を、１％の２−ヒドロキシメ
タクリレート・メタクリル酸（メタクリル酸の含量；重
量比20％）コポリマー水溶液中に分散させ、45％ホウフ
ッ化亜鉛水溶液0.05gを加えて、50℃のインキュベータ
中で６時間反応させた。反応後、上記樹脂を純水で十分
洗浄した後、イオン交換基となる化合物を混合し、一定
温度の下で一定時間反応させる。例示するならば、10％
のトリメチルアミン溶液中に分散させ、30℃で10時間反
応させ、反応終了後、樹脂を純水で十分に洗浄する。

その後、0.1M硫酸水溶液中に分散させ、30℃で２時間
反応させる。

次に、反応によって生じた樹脂を緩衝液で洗浄しての
ち充分に水洗し、その後、目的の対イオンに交換する。
例示するならば、反応によって生じた樹脂を100mlの純
水で充分に洗浄し、その後、0.5Mの塩化ナトリウム水溶
液中に分散させ過し、更に、0.5Mの塩化ナトリウム水
溶液50mlで洗浄した後、純水で充分に洗浄し、0.1Mの塩
化ナトリウム水溶液中に分散し１晩放置する。例示した
ようにして得られた陰イオン交換樹脂は、45μEq/mlの
イオン交換容量を持っていた。また、この陰イオン交換
樹脂は、例えば、内径5.0mm、長さ100mmのステンレス製
クロマト管に高圧スラリー充填法を用いて充填し、イオ
ンクロマトグラフや液体クロマトグラフ用分離カラム等
として使用される。

ところで、上記基材としては、比較的親水性の多孔性
架橋高分子ゲルでその表面に負電荷をもつ合成高分子物
質が供給できるような官能基を有しているか、その表面
に負電荷をもつ合成高分子物質が結合できるような官能
基を導入できる樹脂でなければならない。また、負電荷
をもつ合成高分子物質が、基材と結合を形成する反応性
の官能基例えばエポキシ基などをもっていても良い。更
に、このような樹脂の持つ細孔は、表面に結合する負電
荷をもつ合成高分子物質あるいは試料中に存在するタン
パク質などが浸透できないか若しくは僅かしか浸透でき
ない程度に小さくなければならない。具体的には、下記
（イ）又は（ロ）のような樹脂が望ましい。

（イ）カルボキシル基，アミノ基，水酸基，又はエポキ
シ基などを有するポリメタクリレート樹脂，ポリビニル
アルコール樹脂，若しくはポリエーテル樹脂など。

（ロ）ハロゲン基または水酸基を有し、且つ、上記官能
基および負電荷をもつ合成高分子物質が化学的に結合で
きる官能基の導入が可能なポリメタクリレート樹脂，ポ
リビニルアルコール樹脂，若しくはポリエーテル樹脂な
ど。

また、負電荷をもつ合成高分子物質は、前記基材の官
能基と反応し且つ基材の細孔内部には浸透できないよう
な分子量をもつものでなければならない。負電荷をもつ
合成高分子物質は、その高分子鎖中に使用する移動相中
で電荷をもたない親水性基（例えば水酸基）を十分に有
し同時に負電荷をもつ基（例えばカルボキシル基，スル
ホン基など）を部分的に有していなければならない。こ
のとき、その高分子鎖中において親水性基と負電荷をも
つ基とのモル率は、負電荷をもつ基について0.05〜0.
5、好ましくは0.1〜0.3でなければならない。このよう
な合成高分子の例として、２−ヒドロキシエチルメタク
リレート−メタクリル酸コポリマーなどが挙げられる。
この場合、２−ヒドロキシエチルメタクリレートの水酸
基が親水性基であり、同時に基材と反応する官能基とな
っている。また、親水性基の代わりに合成高分子を基材
表面に結合後、化学処理によって親水性基に交換できる
官能基（例えばエポキシ基など）を有していても良い。
このとき、その高分子鎖中において親水性基と負電荷を
もつ基とのモル分率は、負電荷をもつ基について0.05〜
0.7、好ましくは0.1〜0.5でなければならない。このよ
うな合成高分子の例として、２−ヒドロキシエチルメタ
クリレート−メタクリル酸コポリマーなどが挙げられ
る。

基材細孔内部のイオン交換基は、基材細孔内部に充分
浸透できるような低分子料物質で、負電荷をもつ合成高
分子物質と未反応の細孔内部官能基（必ずしも負電荷を
もつ合成高分子物質を結合させた官能基と同じでなくと
も良い）と反応して陰イオン交換基となる物質でなけれ
ばならない。具体的には一般的なアルキルミン類，エタ
ノールアミンなどのアルカノールアミン類，アジミン
類，ヒドロキシアルキルアンモニウムなどが該当する。

第３図は一般的なサプレスト型イオンクロマトグラフ
装置の構成説明図であり、送液ポンプ2aが駆動すると、
溶離液槽1a内の溶離液が、送液ポンプ2a→インジェクタ
３→分離カラム４→サプレッサ５の内室5c→検出器６を
経由し、廃液槽7aへと流れる。また、送液ポンプ2bが駆
動すると、除去液槽1b内の除去液が、送液ポンプ2b→サ
プレッサ５の外室5bを経由し、廃液槽7bへと流れる。こ
のため、サプレッサ５の内室5cに存在する陽イオンが陽
イオン交換膜5aを介してサプレッサ５の外室5bとイオン
交換するようになり、結果的にサプレッサ５の内室5cに
存在する流体の導電率バックグランドが除去される。
尚、分離カラム4,サプレッサ5,および検出器６は、恒温
槽９内に収納されて一定温度（例えば40℃）に保たれる
と共に、送液ポンプ2,インジェクタ3,分離カラム4,サプ
レッサ5,および検出器６が分析装置の筐体10に収納され
ていることが多い。このような構成からなるイオンクロ
マトグラフ装置において、インジェクタ３に一定量注入
された試料に含まれている陰イオンは、分離カラム４で
分離され、その後、サプレッサ５で上述のようにして導
電率のバックグランドが除去されてのち検出器６で検出
される。このようにして検出器６で検出された信号は、
表示装置８（例えば記録計）に導かれクロマトグラムを
描くようになっている。

前述のようにして製造した陰イオン交換樹脂を分離カ
ラム４内に充填すると共に次のような実験条件で後述の
試料を回収したり分析したりしたところ次のような実験
結果が得られた。即ち、（イ）陰イオン交換樹脂を、内径5.0mm、長さ100mmのス
テンレス製クロマト管に高圧スラリー充填法を用いて充
填し、リン酸緩衝液中でタンパク室の回収率を測定した
ところ、約95％（アルブミン）であった。また、4.0mMN
a₂CO₃/4.0mMNaHCO₃（pHは10.0）での回収率は約88％で
あった。

（ロ）4.0mMNa₂CO₃/4.0mMNaHCO₃（pHは10.0）の移動相
を使用（流量は2.0ml/min.）し、恒温槽９の温度40℃，
試料注入量50μ，検出器６の種類は紫外吸収検出器と
し、Cl^-イオン、NO₂ ^-イオン、Br^-イオン、NO₃ ^-イオン、
SO₄ ^2-イオンを良好に分離できた。

（ハ）上記（ロ）と同一条件下で、0.2％のアルブミン
を含む試料の測定を行ったが、この場合も、Cl^-イオ
ン、NO₂ ^-イオン、Br^-イオン、NO₃ ^-イオン、SO₄ ^2-イオン
を良好に分離できた。

以上のことから、本発明の陰イオン交換樹脂を用いれ
ば、タンパク質を含む試料中の低分子陰イオンをタンパ
ク質の影響なしに分析できることが分かる。

試料成分が充填剤へ保持される挙動は次のようである
と考えられる。即ち、pH値10の緩衝液の中での分析を考
えると、pH値10のときカルボキシル基は解離し負電荷を
しており、充填剤細孔内部に存在する４級アンモニウム
基を解離して正電荷を有している。このような状態の下
で、例えば、等電点が５であるようなタンパク質を含む
試料を注入した場合の保持挙動を説明すると次のように
なる。即ち、充填剤細孔内部のイオン交換基が４級アン
モニウム型であれば、上述のように緩衝液中でも解離し
て正の電荷を帯びている。このような充填剤に低分子陰
イオンが近づくと、上記陰イオン交換樹脂の表面のポリ
マー（合成高分子物質）中のカルボキシル基の負の電荷
によりイオン排除されるが、細孔内部の陰イオン交換基
の正電荷のほうが強いため細孔内部に低分子陰イオンが
入りイオン交換吸着される。また、この充填剤に等電点
が緩衝液よりも小さいタンパク質が近づくと、試料タン
パク質もまた負の電荷を帯びているため、上記陰イオン
交換樹脂の表面の負の電荷によりイオン排除を受ける。
細孔内部の陰イオン交換基の正電荷で引付けられること
も考えらるが、タンパク質は分子量が大きく細孔内部に
は浸透できず、細孔内のイオン交換基とイオン交換吸着
できずに溶出されてしまう。実際には、若干の疎水的吸
着があるため、充填剤には若干保持される。低分子陽イ
オンの場合は、樹脂表面のポリマー中のカルボキシル基
の負の電荷にイオン交換吸着するが、表面の負電荷は極
微量であるため濃度の小さい移動相でも簡単に樹脂から
脱離してしまう。試料中にタンパク質と低分子陰イオン
が共存している場合は、上記２つの現象が同時におこ
り、低分子陰イオンだけが充填剤に保持されて分離され
るようになる。

以上の現象をまとめると次のようになる。即ち。

（イ）タンパク質と酵素が共存している場合は、樹脂表
面のポリマー中のカルボキシル基の負の電荷との間でイ
オン排除が起こる。また、充填剤の細孔には、タンパク
質や酵素のサイズが大であるため、浸透できない。この
ため、表面の負電荷は極微量であることと相まち、濃度
の小さい移動相でも簡単に樹脂から脱離してしまう。従
って、保持力は小さい。

（ロ）低分子陰イオンの場合は、樹脂表面のポリマー中
のカルボキシル基の負の電荷との間でイオン排除する。
また、充填剤の細孔に浸透でき、細孔内部では陰イオン
交換基との間でイオン交換する。従って、保持力は大き
い。

（ハ）低分子陽イオンの場合は、樹脂表面のポリマー中
のカルボキシル基の負の電荷にイオン交換吸着する。ま
た、充填剤の細孔に浸透できるが、細孔内部ではイオン
排除される。このため、表面の負電荷は極微量であるた
め濃度の小さい移動相でも簡単に樹脂から脱離してしま
う。従って、保持力は小さい。

＜発明の効果＞以上詳しく説明したような本発明の実施例によれば、
クロマト管に充填されタンパク質が共存している試料中
の陰イオンを液体クロマトグラフィー手法（イオンクロ
マトグラフィー手法も含む）を用いて定量分析するのに
用いて好適な陰イオン交換樹脂（充填剤）を製造する方
法が実現する。また、このようにして製造された陰イオ
ン交換樹脂は、負電荷をもつ合成高分子で基材の表面を
被覆したことで、タンパク質などを含む試料中の低分子
陰イオンをタンパク質の影響なしに測定できるという利
点がある。更に、タンパク質などを含む試料を直接注入
でき洗浄などの余分な操作を必要としないため、分析条
件が簡単で測定時間が大幅に減少するという利点もあ
る。また、試料中のタンパク質などがカラム充填剤へ吸
着することによって引起こされるイオン交換容量の見掛
け上の減少に起因する保持時間の短縮という問題も無く
なり、結果的に再現性に良いクロマトグラムが得られる
という利点もある。更に、試料中のタンパク質などがカ
ラム充填剤へ吸着することなどによるカラム圧力の上昇
などに起因するカラム性能の劣化がなくなりカラムの延
命化が図れるという利点もある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の陰イオン交換樹脂の構成図、第２図は
本発明の陰イオン交換樹脂の製造方法を説明するための
工程説明図、第３図は一般的なイオンクロマトグラフ装
置の構成説明図である。Ａはイオン交換樹脂、Ｂはポリマー、Ｃは陰イオン交換
基、Ｐはタンパク質、S⁺は陽イオン、S^-は陰イオン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) B01J 41/00 G01N 30/48 C08G 81/02

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】タンパク質が共存している水溶液中の陰イ
オンを分離、定量する球状体の陰イオン交換樹脂におい
て、前記球状体は、表面に結合されていて、前記タンパク質が帯電する電荷
に反発する負の電荷を有するポリマーと、構造のいたるところにあって、前記タンパク質の分子径
より小さな径の微細孔と、この微細孔の内部表面に結合されていて、前記微細孔に
入った前記陰イオンをイオン交換する陰イオン交換基
と、を具備し、前記タンパク質が負電荷を有するpH領域で前
記陰イオンを定量分析することを特徴とした陰イオン交
換樹脂。