JP2883173B2 - セファロスポリンｃのグルタリル―７―アミノ―セファロスポラン酸への酵素酸化の改良法 - Google Patents
セファロスポリンｃのグルタリル―７―アミノ―セファロスポラン酸への酵素酸化の改良法Info
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Description
本発明は、セファロスポリンＣをグルタリル−７−ア
ミノセファロスポラン酸に酵素酸化する方法の改良法、
さらに詳しくは反応系中に存在するカタラーゼおよびエ
ステラーゼ酵素を不活性化する方法に関する。
ミノセファロスポラン酸に酵素酸化する方法の改良法、
さらに詳しくは反応系中に存在するカタラーゼおよびエ
ステラーゼ酵素を不活性化する方法に関する。
【従来の技術】 セファロスポリンＣ（Ceph C）のグルタリル−７−ア
ミノセファロスポラン酸（グルタリル−7-ACA）への酵
素酸化は、研究室スケールでは可能であることが示され
ていた［例えば、アーノルド等（Arnold et al.）、米
国特許No.3,821,209、およびフィルデス等（Fildes et
al.）、米国特許No.3,821,209を参照；これらは本明細
書中の一部を構成する］。しかし、工業スケール生産へ
の成功裏の、かつ、経済的に実現可能なスケールアップ
はこれまで問題を含んでいた。 グルタリル−7-ACAを7-ACAに変える酵素が知られてい
るので、上記の変換によってセファロスポリンＣから７
−アミノセファロスポラン酸（7-ACA）までの完全な酵
素法ルートの可能性が開かれ、従って上記の変換は商業
的な重要性が大きい［例えば、シブヤ等（Shibuya et a
l.,Agric.Biol.Chem.,45（７）,1561-1567,1981）、
「７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポ
ラン酸アシラーゼ産生細菌の単離および性質」を参
照］。さらに、7-ACAへの酵素法ルートの他の利点は、
水性の製造混合物を利用することによって、製造工程で
生じる危険な溶媒廃棄物を最少限にし得ることである。
ミノセファロスポラン酸（グルタリル−7-ACA）への酵
素酸化は、研究室スケールでは可能であることが示され
ていた［例えば、アーノルド等（Arnold et al.）、米
国特許No.3,821,209、およびフィルデス等（Fildes et
al.）、米国特許No.3,821,209を参照；これらは本明細
書中の一部を構成する］。しかし、工業スケール生産へ
の成功裏の、かつ、経済的に実現可能なスケールアップ
はこれまで問題を含んでいた。 グルタリル−7-ACAを7-ACAに変える酵素が知られてい
るので、上記の変換によってセファロスポリンＣから７
−アミノセファロスポラン酸（7-ACA）までの完全な酵
素法ルートの可能性が開かれ、従って上記の変換は商業
的な重要性が大きい［例えば、シブヤ等（Shibuya et a
l.,Agric.Biol.Chem.,45（７）,1561-1567,1981）、
「７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポ
ラン酸アシラーゼ産生細菌の単離および性質」を参
照］。さらに、7-ACAへの酵素法ルートの他の利点は、
水性の製造混合物を利用することによって、製造工程で
生じる危険な溶媒廃棄物を最少限にし得ることである。
グルタリル−7-ACAを良好な収率で得るためには、カ
タラーゼ活性の全てがＤ−アミノ酸オキシダーゼを含む
反応混合物から除去されることが必須であることが知ら
れていた。上記の転換において、セファロスポリンＣは
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと反応して熱的に不安定なα
−ケト アジポイル 7-ACA中間体を生成し、これが同
時に生成した過酸化水素によってその場で酸化されて所
望のグルタリル−7-ACAを与える。しかし、天然のカタ
ラーゼ酵素は過酸化水素を破壊するように作用する。従
って、酸化前にカタラーゼを不活性化する手段を講じな
いと、α−ケト アジポイル中間体は分解し、それによ
って所望のグルタリル−7-ACAの収量が減少することが
わかっていた。この汚染物質をクロマトグラフィーによ
って除去することは可能であるが、工業スケールでの生
産においては、この規模のクロマトグラフィーは実用的
なものではない。従って、唯一の実際的な解決法はカタ
ラーゼを何等かの方法によって選択的に不活性化するこ
とである。 他では、アスコルビン酸、３−アミノ−1,2,4−トリ
アゾール、シアン化ナトリウム、酢酸ナトリウム、ギ酸
ナトリウム、フッ化ナトリウム、またはアジ化ナトリウ
ムなどのカタラーゼ阻害物質を使用することの可能性が
報告されていた。これらの阻害物質の中では、アジ化ナ
トリウムが実際に使用されたときに十分に作用する唯一
のものである。しかし、アジ化ナトリウムを用いたとき
の重大な欠点の１つは、最終産物に持ち越され得る３−
アジドメチル−３−セフェム副産物の生成である。極め
て毒性の高いアジドイオンが恐らくは患者に投与したと
きに放出されるので、このアジド不純物は医薬製剤に受
け入れられるものでは決してない。
タラーゼ活性の全てがＤ−アミノ酸オキシダーゼを含む
反応混合物から除去されることが必須であることが知ら
れていた。上記の転換において、セファロスポリンＣは
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼと反応して熱的に不安定なα
−ケト アジポイル 7-ACA中間体を生成し、これが同
時に生成した過酸化水素によってその場で酸化されて所
望のグルタリル−7-ACAを与える。しかし、天然のカタ
ラーゼ酵素は過酸化水素を破壊するように作用する。従
って、酸化前にカタラーゼを不活性化する手段を講じな
いと、α−ケト アジポイル中間体は分解し、それによ
って所望のグルタリル−7-ACAの収量が減少することが
わかっていた。この汚染物質をクロマトグラフィーによ
って除去することは可能であるが、工業スケールでの生
産においては、この規模のクロマトグラフィーは実用的
なものではない。従って、唯一の実際的な解決法はカタ
ラーゼを何等かの方法によって選択的に不活性化するこ
とである。 他では、アスコルビン酸、３−アミノ−1,2,4−トリ
アゾール、シアン化ナトリウム、酢酸ナトリウム、ギ酸
ナトリウム、フッ化ナトリウム、またはアジ化ナトリウ
ムなどのカタラーゼ阻害物質を使用することの可能性が
報告されていた。これらの阻害物質の中では、アジ化ナ
トリウムが実際に使用されたときに十分に作用する唯一
のものである。しかし、アジ化ナトリウムを用いたとき
の重大な欠点の１つは、最終産物に持ち越され得る３−
アジドメチル−３−セフェム副産物の生成である。極め
て毒性の高いアジドイオンが恐らくは患者に投与したと
きに放出されるので、このアジド不純物は医薬製剤に受
け入れられるものでは決してない。
本発明は、セファロスポリンＣを酵素酸化してグルタ
リル−7-ACAを得る際の、カタラーゼ活性の減少化とい
う長い間の問題の解決法を提供するものである。本発明
によれば、水中、室温で、Trigonopsis variabilisの透
過性にした全細胞または細胞不含の抽出物を塩基で処理
してpH約11〜約12とすることによって、Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼ酵素の存在下でカタラーゼ活性を不可逆的に
不活性化することができる。最も重要なことは、この処
理が所望のオキシダーゼ酵素に全く影響を及ぼさないこ
とである。 さらに、これまで記載されたことのないエステラーゼ
酵素を、Trigonopsis variabilisの全細胞をアセトン／
水で処理することによって不活性化することもできる
（細胞を透過性にするようにも作用する）。エステラー
ゼ酵素は、そこに生成したα−ケト アジポイル 7-AC
A中間体ならびにセファロスポリンＣおよびグルタリル
−7-ACAを３−デスアセチル形（対応する量のデスアセ
チル グルタリル−7-ACAに導く）に変換するので、こ
のエステラーゼ酵素の不活性化は重要である。 本発明の１つの態様によれば、Ceph Cをグルタリル−
7-ACAに酵素酸化する際に使用する前に、Trigonopsis v
ariabilisの全細胞をアセトン／水の混合液でスラリー
化することからなる、デスアセチル グルタリル−7-AC
Aを実質的に含まないグルタリル−7-ACAの製造方法が提
供される。即ち、Trigonopsis variabilisの全細胞また
は細胞不含の抽出物をアセトン／水で処理することから
なる、エステラーゼ酵素の不活性化方法が提供される。 また、本発明は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとカタラ
ーゼの水性混合液のpHを約11〜約12のpHまで高めること
からなる、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵素の存在下にカ
タラーゼ酵素を不活性化する方法を提供するものであ
る。 さらに、本発明は、Ceph Cをグルタリル−7-ACAに酵
素酸化する際にTrigonopsis variabilisの透過性にした
全細胞を利用する前に、Trigonopsis variabilisの透過
性にした全細胞または細胞不含の抽出物を塩基で処理し
てpH約11〜約12にすることからなる、セファロスポリン
Ｃをグルタリル−7-ACAに酵素変換する方法を提供する
ものである。 これとは別に、本発明のこの態様を、オキシダーゼお
よびカタラーゼを含有するTrigonopsis variabilisの細
胞不含の抽出物によるセファロスポリンＣのグルタリル
7-ACAへの変換に適用することができる。そのような細
胞不含の抽出物は、通常の方法、例えば溶解または細胞
の水性懸濁液の音波処理によって得られる。次いで、細
胞不含の抽出液を、全細胞について上記したように処理
する。 次いで、上記の全細胞のpHを硫酸などの希釈した酸に
よって約７に調節し、Ceph Cのグルタリル−7-ACAへの
酵素酸化に直接使用することができる。 上記の方法において使用するのに適当なTrigonopsis
variabilisの全細胞は、従来技術の方法を用いて得るこ
とができる。また、Trigonopsis variabilis、培養物番
号CBS 4095のもと、Central Bureau voor schimmelcult
ur,Baarn,Hollandから入手することができる。 上記の方法においては、Trigonopsis variabilisの全
細胞ペーストを90％〜50％の水／アセトン（好ましくは
2:1、v:v）混合液でスラリー化し、Dow Antifoam ATMな
どの消泡剤で処理する。通常、この混合物を20〜25℃で
約２時間撹拌する。この方法によって、エステラーゼ活
性の90％以上が除かれ、見かけのオキシダーゼ活性が約
10倍に増加する。アセトンを、蒸発によって、またはセ
ラミックス上の透濾過またはあらゆる種類の交差フロー
フィルターによって除去することができる。また、この
方法は細胞を透過性にするように働く（あるいは、他で
記載されているように、細胞を「活性化する」よう
に）。従来技術の方法は、特にアセトンによって透過性
にすることを教示しているが、エステラーゼの存在およ
びその３−デスアセチル−7-ACA不純物の同時生産への
寄与はここで初めて認識されたものである。即ち、全細
胞を透過性にするこの従来技術の方法は、今では、これ
まで認識されていなかったエステラーゼ不活性化という
側面をも有しているのである。 次に、細胞／水のスラリーをアルカリ金属水酸化物
（水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、または他
の普通の塩基でpHが約11〜12になるまで処理し、この混
合物を20〜25℃で２時間撹拌する。水酸化ナトリウムは
約２規定の濃度で用いるのが好ましい。この方法によっ
て、オキシダーゼ活性に影響を及ぼすことなく、検出可
能なカタラーゼ活性の全てが除去される。次いで、この
反応混合物を20％硫酸などの希釈酸によって約７に調節
する。 次いで、この細胞／水のスラリーをCeph Cのグルタリ
ル−7-ACAへの酵素酸化に直接使用することができる。
通常は、Trigonopsis variabilisのエステラーゼ／カタ
ラーゼ−不活性化した全細胞を使用するパイロットプラ
ントのスケールで90％±２％の収率を得ることができ
る。 実験の部 実施例１ 一般的方法 Trigonopsis variabilisの全細胞を用いるCeph Cの酸
化 湿ったTrigonopsis細胞ペースト（1.4kg;乾燥重量0.4
2kg）、水（2.1）、アセトン（1.08l）、およびDow A
ntifoam ATM（2ml）の混合物を20〜25℃で２時間撹拌し
た。通常、この処理によって、セステラーゼ活性の＞90
％が除去され、見かけのオキシダーゼ活性が10倍に増加
する。アセトンは、真空下の蒸発によって、または交差
フローフィルターによる透濾過によって除去することが
できる。 次いで、細胞／水スラリーのpHを2N水酸化ナトリウム
で11.0に調節し、この反応混合物を20〜25℃で２時間撹
拌した。この処理によって検出可能なカタラーゼ活性の
全てを除去した。２時間後に20％硫酸によってpHを７に
調節した。1.4kgのナトリウムCeph C（Ceph Cならびに
他の塩を用いることもできる）、およびDow Antifoam A
TMと上記の細胞／水スラリーの混合物を純酸素の吹き込
みによって処理して反応混合物を酸素で飽和させた。温
度は23℃に、pHは7.1に保った。通常、反応は酵母細胞
の比活性に依存して60〜120分で完結する。反応が完結
したら、反応混合物をセラミック交叉フローフィルター
で元の容量の1/3まで濃縮し、次いで１容量の水で透濾
過した。濃縮中は反応混合物に窒素を吹き込んで酵素活
性の保存を助けた。透過物は生成物として保存し、一
方、濃縮した細胞スラリーは再使用のために再利用し
た。 実施例２ 上で用いた方法と同様の方法によってアセトン／水で
透過性にしておいたTrigonopsis variabilisの湿ったペ
ースト（12g試料）を水（50ml）でスラリー化した。次
いで、2N NaOHでpHを11に調節し、反応混合物を室温で
１時間45分撹拌した。次に、反応混合物のpHを1N HClで
6.5に調節し、全細胞をCeph Cのグルタリル−7-ACAへの
酵素変換に用いた。 次いで、反応混合物中に純粋な酸素を吹き込みなが
ら、全細胞を水（300ml）およびナトリウムCeph C（14.
04g;約84％の純度）と共にでスラリー化した。72分後に
後処理すると、92.8％（その場での収率）のグルタリル
−7-ACAがこの実験によって得られた。
リル−7-ACAを得る際の、カタラーゼ活性の減少化とい
う長い間の問題の解決法を提供するものである。本発明
によれば、水中、室温で、Trigonopsis variabilisの透
過性にした全細胞または細胞不含の抽出物を塩基で処理
してpH約11〜約12とすることによって、Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼ酵素の存在下でカタラーゼ活性を不可逆的に
不活性化することができる。最も重要なことは、この処
理が所望のオキシダーゼ酵素に全く影響を及ぼさないこ
とである。 さらに、これまで記載されたことのないエステラーゼ
酵素を、Trigonopsis variabilisの全細胞をアセトン／
水で処理することによって不活性化することもできる
（細胞を透過性にするようにも作用する）。エステラー
ゼ酵素は、そこに生成したα−ケト アジポイル 7-AC
A中間体ならびにセファロスポリンＣおよびグルタリル
−7-ACAを３−デスアセチル形（対応する量のデスアセ
チル グルタリル−7-ACAに導く）に変換するので、こ
のエステラーゼ酵素の不活性化は重要である。 本発明の１つの態様によれば、Ceph Cをグルタリル−
7-ACAに酵素酸化する際に使用する前に、Trigonopsis v
ariabilisの全細胞をアセトン／水の混合液でスラリー
化することからなる、デスアセチル グルタリル−7-AC
Aを実質的に含まないグルタリル−7-ACAの製造方法が提
供される。即ち、Trigonopsis variabilisの全細胞また
は細胞不含の抽出物をアセトン／水で処理することから
なる、エステラーゼ酵素の不活性化方法が提供される。 また、本発明は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとカタラ
ーゼの水性混合液のpHを約11〜約12のpHまで高めること
からなる、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵素の存在下にカ
タラーゼ酵素を不活性化する方法を提供するものであ
る。 さらに、本発明は、Ceph Cをグルタリル−7-ACAに酵
素酸化する際にTrigonopsis variabilisの透過性にした
全細胞を利用する前に、Trigonopsis variabilisの透過
性にした全細胞または細胞不含の抽出物を塩基で処理し
てpH約11〜約12にすることからなる、セファロスポリン
Ｃをグルタリル−7-ACAに酵素変換する方法を提供する
ものである。 これとは別に、本発明のこの態様を、オキシダーゼお
よびカタラーゼを含有するTrigonopsis variabilisの細
胞不含の抽出物によるセファロスポリンＣのグルタリル
7-ACAへの変換に適用することができる。そのような細
胞不含の抽出物は、通常の方法、例えば溶解または細胞
の水性懸濁液の音波処理によって得られる。次いで、細
胞不含の抽出液を、全細胞について上記したように処理
する。 次いで、上記の全細胞のpHを硫酸などの希釈した酸に
よって約７に調節し、Ceph Cのグルタリル−7-ACAへの
酵素酸化に直接使用することができる。 上記の方法において使用するのに適当なTrigonopsis
variabilisの全細胞は、従来技術の方法を用いて得るこ
とができる。また、Trigonopsis variabilis、培養物番
号CBS 4095のもと、Central Bureau voor schimmelcult
ur,Baarn,Hollandから入手することができる。 上記の方法においては、Trigonopsis variabilisの全
細胞ペーストを90％〜50％の水／アセトン（好ましくは
2:1、v:v）混合液でスラリー化し、Dow Antifoam ATMな
どの消泡剤で処理する。通常、この混合物を20〜25℃で
約２時間撹拌する。この方法によって、エステラーゼ活
性の90％以上が除かれ、見かけのオキシダーゼ活性が約
10倍に増加する。アセトンを、蒸発によって、またはセ
ラミックス上の透濾過またはあらゆる種類の交差フロー
フィルターによって除去することができる。また、この
方法は細胞を透過性にするように働く（あるいは、他で
記載されているように、細胞を「活性化する」よう
に）。従来技術の方法は、特にアセトンによって透過性
にすることを教示しているが、エステラーゼの存在およ
びその３−デスアセチル−7-ACA不純物の同時生産への
寄与はここで初めて認識されたものである。即ち、全細
胞を透過性にするこの従来技術の方法は、今では、これ
まで認識されていなかったエステラーゼ不活性化という
側面をも有しているのである。 次に、細胞／水のスラリーをアルカリ金属水酸化物
（水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、または他
の普通の塩基でpHが約11〜12になるまで処理し、この混
合物を20〜25℃で２時間撹拌する。水酸化ナトリウムは
約２規定の濃度で用いるのが好ましい。この方法によっ
て、オキシダーゼ活性に影響を及ぼすことなく、検出可
能なカタラーゼ活性の全てが除去される。次いで、この
反応混合物を20％硫酸などの希釈酸によって約７に調節
する。 次いで、この細胞／水のスラリーをCeph Cのグルタリ
ル−7-ACAへの酵素酸化に直接使用することができる。
通常は、Trigonopsis variabilisのエステラーゼ／カタ
ラーゼ−不活性化した全細胞を使用するパイロットプラ
ントのスケールで90％±２％の収率を得ることができ
る。 実験の部 実施例１ 一般的方法 Trigonopsis variabilisの全細胞を用いるCeph Cの酸
化 湿ったTrigonopsis細胞ペースト（1.4kg;乾燥重量0.4
2kg）、水（2.1）、アセトン（1.08l）、およびDow A
ntifoam ATM（2ml）の混合物を20〜25℃で２時間撹拌し
た。通常、この処理によって、セステラーゼ活性の＞90
％が除去され、見かけのオキシダーゼ活性が10倍に増加
する。アセトンは、真空下の蒸発によって、または交差
フローフィルターによる透濾過によって除去することが
できる。 次いで、細胞／水スラリーのpHを2N水酸化ナトリウム
で11.0に調節し、この反応混合物を20〜25℃で２時間撹
拌した。この処理によって検出可能なカタラーゼ活性の
全てを除去した。２時間後に20％硫酸によってpHを７に
調節した。1.4kgのナトリウムCeph C（Ceph Cならびに
他の塩を用いることもできる）、およびDow Antifoam A
TMと上記の細胞／水スラリーの混合物を純酸素の吹き込
みによって処理して反応混合物を酸素で飽和させた。温
度は23℃に、pHは7.1に保った。通常、反応は酵母細胞
の比活性に依存して60〜120分で完結する。反応が完結
したら、反応混合物をセラミック交叉フローフィルター
で元の容量の1/3まで濃縮し、次いで１容量の水で透濾
過した。濃縮中は反応混合物に窒素を吹き込んで酵素活
性の保存を助けた。透過物は生成物として保存し、一
方、濃縮した細胞スラリーは再使用のために再利用し
た。 実施例２ 上で用いた方法と同様の方法によってアセトン／水で
透過性にしておいたTrigonopsis variabilisの湿ったペ
ースト（12g試料）を水（50ml）でスラリー化した。次
いで、2N NaOHでpHを11に調節し、反応混合物を室温で
１時間45分撹拌した。次に、反応混合物のpHを1N HClで
6.5に調節し、全細胞をCeph Cのグルタリル−7-ACAへの
酵素変換に用いた。 次いで、反応混合物中に純粋な酸素を吹き込みなが
ら、全細胞を水（300ml）およびナトリウムCeph C（14.
04g;約84％の純度）と共にでスラリー化した。72分後に
後処理すると、92.8％（その場での収率）のグルタリル
−7-ACAがこの実験によって得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 35/06 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (1)
- 【請求項１】セファロスポリンＣをグルタリル−７−AC
Aに酵素変換をする方法であって、セファロスポリンＣ
のグルタリル−７−ACAへの酵素酸化においてTrigonops
is variabilisの透過性にした全細胞または細胞不含の
抽出物を用いる前に、該Trigonopsis variabilisの透過
性にした全細胞または細胞不含の抽出物を塩基で処理し
て約11〜約12のpHとすることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38250589A | 1989-07-19 | 1989-07-19 | |
| US382505 | 1989-07-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0353879A JPH0353879A (ja) | 1991-03-07 |
| JP2883173B2 true JP2883173B2 (ja) | 1999-04-19 |
Family
ID=23509253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2192858A Expired - Lifetime JP2883173B2 (ja) | 1989-07-19 | 1990-07-18 | セファロスポリンｃのグルタリル―７―アミノ―セファロスポラン酸への酵素酸化の改良法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
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