JP3561519B2

JP3561519B2 - 新規ペプチドおよび免疫賦活剤

Info

Publication number: JP3561519B2
Application number: JP2003295576A
Authority: JP
Inventors: 功博川崎; 俊一堂迫; 恵子志水; 泰裕古賀
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 2003-08-19
Filing date: 2003-08-19
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2019-09-02
Also published as: JP2004002471A

Description

本発明は、新規ペプチドおよびこのペプチドを有効成分とする免疫賦活剤に関する。

ラクトフェリン（ＬＦ）は、乳中に存在する鉄結合性の蛋白質として知られている。乳以外の種々の分泌液中にも存在し、関節腔内や血清などにも存在し、鉄と結合して溶液中の鉄イオンを奪うことで抗菌作用を示す。また、ラクトフェリンは抗菌活性の他に、ウイルスに対する結合性や老化防止効果を有するなどの活性が知られている。また、ラクトフェリンのアミノ酸配列の一部分に、鉄結合性と異なる抗菌活性があることが確認されている（例えば、特許文献１及び２参照）。このようにラクトフェリンには種々の活性が存在している。ラクトフェリンは、牛乳から大量に調製する方法が開発されている。例えば、ラクトフェリンに対して親和性を有する架橋型ポリサッカライドの硫酸エステルを用いて乳からラクトフェリンを回収する方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。このようにして得たラクトフェリンを用いることによって幾つかの新しい生理作用や詳細な構造が判明している。このようなラクトフェリンの構造と生理活性については島崎らが総説で説明している（例えば、非特許文献１参照)。また、ラクトフェリンが末梢血、特に好中球の貪食能を活性化し、免疫を向上させることが開示されている（例えば、特許文献４参照）。しかし、ラクトフェリン由来のペプチドがリンパ球のマイトージェン活性を誘導し免疫機能を賦活化することは知られていない。

本発明者らはラクトフェリンを酵素分解処理に付すことにより、ラクトフェリンの構造中に存在するペプチドの生理活性を検討してきた。ラクトフェリンの構造中に存在する特定のペプチドが、抗ＨＩＶ活性や、抗ＨＴＬＶに対して作用し感染を抑制することを確認し、特許出願を行った（例えば、特許文献５及び６参照）。さらに、ラクトフェリンの酵素分解物について詳細に検討を行った結果、ラクトフェリンのアミノ酸配列中に存在する特定のペプチド構造を含むペプチドが、強いリンパ球のマイトージェン活性を有していることを見いだし、その作用について検討を行った結果、本発明を完成するに至った。
特開平５−７８３９２号公報特開平５−１４８２９６号公報特開昭６３−２５５３００号公報特開平５−１７８７５９号公報特開平７−６９９１５号公報特開平７−２０６７０１号公報島崎敬一他、バイオサイエンスとインダストリー，Vol.51, 25-27,1993

本発明はウシラクトフェリンのアミノ酸配列中に存在し、マイトージェン活性を有する新規ペプチドを提供することを課題とする。またこのようなペプチドを有効成分とする免疫賦活剤を提供することを課題とする。さらにはこのペプチドを有効成分とするサイトメガロウイルス感染防御剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、ラクトフェリンの生理活性について検討を行った結果、ラクトフェリンの酵素分解物中に、強いマイトージェン活性と、強い抗腫瘍活性を有することを見いだした。

ラクトフェリンをペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン（いずれもシグマ社製）を用いてラクトフェリン／酵素＝１００／１で３７℃、１時間インキュベートした。インキュベート後、ペプシン分解物の反応液を中性に戻し、その他は８０℃で５分間加熱することで反応を停止させた。生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を凍結乾燥してラクトフェリンの酵素分解物の粉末を得た。この酵素分解物を試料として以下の実施例に記載した方法でリンパ球の幼若化および抗腫瘍活性を測定したところ、これまで報告のない強い活性を有することを見いだした。この活性測定結果を下記の表１及び表２に示した。

このようにラクトフェリンの酵素分解物には強い免疫賦活作用とこれによると推測される強い抗腫瘍効果が存在することが確認できた。
本発明者らは、さらにラクトフェリンのアミノ酸配列中に存在するペプチド構造に関して検討を行った結果、マイトージェン活性を発揮するに必須の構造を初めて解明した。

本発明により、マイトージェン活性を有する新規ペプチド、及びその製造法、更に、このペプチドを有効成分とする免疫賦活剤、サイトメガロウイルス感染防御剤が提供される。

本発明のマイトージェン活性を有するペプチドはペプチド配列中に、次のアミノ酸配列を有することが必要である。
すなわち、ウシラクトフェリン由来のペプチドの場合、次の配列〔Ｉ〕を含むペプチドである。
Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr-Ile-Ser-Gln-Pro-Asp-Ser-Phe-Lys〔Ｉ〕

ウシラクトフェリンの全アミノ酸配列はすでに決定されている（P.E. Mead et al.,Nucleic Acid Res., Vol.18, 7167, 1990)。このペプチドはウシラクトフェリンのアミノ酸配列の１−１８番目のアミノ酸配列に相当しており、この配列からなるペプチドは、本発明に包含されるものである。以下、ウシラクトフェリン由来のペプチドのアミノ酸配列はこの文献に従い、Ala を１番目として、アミノ酸配列の番号で記載する。
このアミノ酸配列を含むペプチドの例として次の配列〔II〕のペプチドが例示出来る。

このペプチドはウシラクトフェリンの１−５１番目に相当している。またこのペプチドのＳＳ結合は還元状態のＳＨ基となっていてもよい。
配列〔Ｉ〕および配列〔II〕は、Ｎ末端アミノ酸１〜３残基が欠失していてもよい。すなわち、ウシラクトフェリン２−１８番目、３−１８番目、４−１８番目、またはウシラクトフェリン２−５１番目、３−５１番目、４−５１番目のアミノ酸配列に相当するものであっても良い。
これらのペプチドはもとの蛋白質と比べて低分子であり、投与にあたって抗原性は低くなっているという利点がある。

本発明のペプチドを調製するには、通常のペプチド合成方法が採用できる。ペプチド合成方法としては固相合成方法が一般的であるが、この固相合成方法は「泉谷他著、ペプチド合成の基礎と実験（１９８５年丸善刊）１９４〜２３３頁」などに開示された方法を挙げることができる。またこれ以外の方法であっても良い。
また、ウシラクトフェリンをプロテアーゼによって酵素分解し、クロマトグラフィーにより分取することもできる。また酵素分解に付するためのラクトフェリンは、ウシの乳から容易に回収することができる。例えば上述した特開昭６３−２５５３００号公報に開示されたラクトフェリンに対して親和性を有する架橋型ポリサッカライドの硫酸エステルを用いて、乳から回収することができる。
ラクトフェリンの酵素分解に用いる酵素としては、蛋白質の酵素分解に通常用いる酵素であれば、いずれも使用可能である。このような酵素としてはペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパインなどを例示することができる。またこれ以外の酵素であっても使用することが可能である。
このようにして得られた酵素分解物から常法によりクロマト処理することによってこれらのペプチドを採取することができる。
また、他の通常のペプチド製造法に従って製造してもよい。

本発明のペプチドはリンパ球の幼若化を誘導し、抗ウイルス作用、特にサイトメガロウイルスに対して感染防御効果を示す。
本発明のペプチドは単独で投与することができるし、または、安定剤、賦形剤などの製剤化に通常用いる添加剤を使用して製剤化することもできる。
本発明のペプチドは、食品や家畜飼料に添加して投与することができるし、医薬品、化粧品などの用途に使用することもできる。医薬品として用いる場合には経口、注射、座剤などの投与形態で用いることができ、通常成人１日当たり０．１〜５ｇ程度を投与することで、免疫賦活作用や、ウイルス感染防御効果を期待できるものである。
また本発明ペプチドは、経口投与においては毒性を示さないし、また経静脈投与においても、物理的に投与可能最大投与において死亡動物が出現しない安全な物質である。
以下に実施例を示し、さらに本発明を詳細に説明する。

（ラクトフェリン（以下ＬＦと記す）の酵素分解物の調製とマイトージェン活性ペプチドの単離）
特開昭６３−２５５３００号公報に記載の方法で牛乳から調製したＬＦを原料としてペプシン（シグマ社製）酵素分解処理を行った。ＬＦ／酵素＝１００／１の比率で、3７℃、１時間インキュベートした。インキュベート後ペプシン分解物は反応液を中性に戻し、その他は８０℃で５分間加熱することで反応を停止させた。生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を凍結乾燥してＬＦの酵素分解物の粉末を得た。この分解組成物をＴＳＫゲルＧ３００ＳＷカラム（２１．５ｍｍ×３００ｍｍ：東ソー製）２本を直列につないだカラムを装着したＨＰＬＣに付し、分離を行った。溶出は０．０１５ＭのＮａＣｌを含む１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を溶出液とし、２１４ｎｍの吸収を測定した。このゲル濾過パターンを図１に示した。

分離した各フラクションのリンパ球幼若化活性を以下の方法により測定した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス脾臓細胞を採取し洗浄した後、牛胎児血清１０％を含むＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させた。脾臓細胞を５×１０^５／ウエルになるよう９６穴マイクロプレートに分注し、これに試料を最終濃度がそれぞれ１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌとなるよう添加した。対照ウエルにはコンカナバリンＡ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）、リポポリサッカライド（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃ ４８時間５％ＣＯ_２条件下で培養した。培養後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロマイド（以下ＭＴＴと略記）液１０μl を添加し、更に３時間培養後、生じたＭＴＴフォルマザンをＥＬＩＳＡリーダーを用い、５６２−５９５ｎｍで吸光度を測定した（以上の方法はMed. Immunol, 12, 411 (1986)に開示された方法に準じた）。結果は１０ウエルの平均値とし、マイトージェン活性比（Ｓ．Ｉ．）は、次の式に基づいて計算した。

Ｓ．Ｉ．＝（試料ウエルの平均吸光度）／（対照ウエルの平均吸光度）×１００

各フラクションのＳ．Ｉ．値を表３に示した。

各フラクションの内、特に活性の高かったフラクション７について再度ＨＰＬＣによりその溶出位置を測定し、以下に示した合成ペプチドと比較した結果、このフラクションの溶出時間はウシＬＦ１−１８と一致した。またこのフラクションのアミノ酸配列を分析したところウシＬＦ１−１８の配列を有することが確認できた。

（活性ペプチドの化学合成）
実施例１で確認したペプチドおよびそのアミノ酸配列を含むペプチドの合成を行った。本実施例ではウシＬＦ１−１８、ウシＬＦ１−５１の合成例を示した。本明細書に記載したこれ以外のペプチドの合成も、本実施例に準じて合成した。

（１）ウシＬＦ１−１８の合成
ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基として０．２５ｍｍｏｌスケールで直鎖保護ペプチドを合成した。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチド１４５５ｍｇをフェノール、１，２−エタンジチオール、チオアニソール存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドのＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し凍結乾燥を行った。得られた直鎖粗ペプチド５００ｍｇは、ＨＰＬＣ〔カラム：オクタデシル４ＰＷ（２１．５×１５０ｍｍ，東ソー社），溶出：０．１％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルにてグラジエント溶出〕により精製し、直鎖精製ペプチド３６５ｍｇを得た。得られた精製ペプチドの純度は、ＨＰＬＣによる分析の結果９８％であった。

（２）ウシＬＦ（１−５１）、〔^１９Cys(Acm),^３６Cys(Acm) 〕ウシＬＦ（１−５１）および〔^９CysSH,^１９Cys(Acm),^３６Cys(Acm),^４５CysSH 〕ウシＬＦ（１−５１）の合成
ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基とし、^２０Cys および^３７Cys のＳＨ基をアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基で保護して０．２５ｍｍｏｌスケールで直鎖保護ペプチドを合成した。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチド２３３７ｍｇをフェノール、１，２−エタンジチオール、チオアニソール存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドのＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し凍結乾燥を行った。得られた直鎖粗ペプチド９７０ｍｇは、ＨＰＬＣ（カラム：オクタデシル４ＰＷ（２１．５×１５０ｍｍ，東ソー社），溶出：０．１％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルにてグラジエント溶出）により精製し直鎖精製ペプチド〔^９CysSH,^１９Cys(Acm),^３６Cys(Acm),^４５CysSH 〕ウシＬＦ（１−５１）を得た。得られた精製ペプチドの純度は、ＨＰＬＣによる分析の結果８２％であった。このペプチドをフェリシアン化カリウム存在下、空気酸化により^９Cys,^４５Cys にＳ−Ｓ結合を形成させ、さらにＨＰＬＣにて精製することで、純度９０％の〔^１９Cys(Acm),^３６Cys(Acm) 〕ウシＬＦ（１−５１）３９０ｍｇを得た。さらにこのペプチドをヨウ素処理し、Ａｃｍ基の除去とＳ−Ｓ結合の形成を同時に行い、ＨＰＬＣで精製することでウシＬＦ（１−５１）５７６ｍｇを得た。ＨＰＬＣによる分析の結果、このペプチドの純度は８８％であった。

（合成ペプチドのリンパ球幼若化活性の測定）
実施例２で得られた合成ペプチドのリンパ球幼若化作用を測定した。
測定は実施例１に示した方法に従った。測定結果を下記の表４に示した。
各合成ペプチドはいずれも強いＳ．Ｉ．活性を有していた。

（合成ペプチドの抗腫瘍効果の測定）
実施例２で得られた合成ペプチドの免疫賦活効果を確認するため、腹水型腫瘍の増殖抑制効果を指標として実験を行い、免疫マーカーの変化を観察した。
ＢＡＬＢ／ｃ雄マウス（１群１０匹）に１０^５〜１０^６個の腹水型腫瘍細胞（Meth A 細胞）を腹腔内に移植した。腫瘍移植当日より、隔日に５回にわたり合成ペプチドを腹腔内に投与した。またポジティブコントロールとしてムラミルジペプチド（ＭＤＰ）３ｍｇ／ｋｇを同様に投与し、さらにネガティブコントロールとしてカラギーナンを同様に投与した。
腫瘍移植から２０日後のマウスの生存率を表５に示した。サンプルについては０．００５ｇ／体重ｋｇ以上の投与量で腫瘍増殖抑制効果が認められ、特に合成ペプチド投与群では０．０５ｇ／体重ｋｇの投与でマウスの死亡は全く認められなかった。またペプチド投与動物のＮＫ細胞が活性化されていることが確認された。ＮＫ細胞活性化の測定は、マウスの脾臓細胞をエフェクター細胞として、標的細胞に^５１Ｃｒをラベルした腫瘍細胞（ＹＡＣ−１）を用い、１００：１の割合で混合し、遊離した^５１Ｃｒの量からＮＫ活性値を測定した。本発明物質投与動物のＮＫ活性値は、コントロールと比べて有意に高値を示していた。

（合成ペプチドによるサイトメガロウイルス感染防御効果）
ウシＬＦの各種合成ペプチドを調製し、このペプチドのサイトメガロウイルス感染防御効果を確認した。
実験動物として、ＳＰＦ−ＢＡＬＢ／ｃＡ雄、４週齢を１群５匹として用いた。このマウスに、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）Ｓｍｉｔｈ株のマウス唾液腺を１０回以上通過したものを感染させて、その延命率を求めて判定を行った。
ウイルスの感染は１×１０^６ＰＦＵ／マウスの濃度で腹腔内に接種して行い、感染と同時に各ペプチドのＰＢＳ溶液を腹腔内に０．２５、０．１２５、０．０２５、０．００５ｇ／k ｇ（体重）で投与した。また生存動物は解剖を行い、脾臓を摘出し、脾臓細胞のＮＫ細胞活性を測定した。
結果を表６に示した。

本発明のペプチドはウシＬＦのＮ末端側に活性が存在することが確認できた。またこの活性はＮ末端から３残基まで削除しても、影響がないことが確認できた。さらに本発明ペプチドを投与した動物はいずれもＮＫ細胞活性が上昇していた。この活性もサイトメガロウイルスの感染防御活性と一致していた。

本実施例は、本発明ペプチドを製剤化した例を示す。
（１）錠剤
乳糖１７０ｇ、馬鈴薯澱粉５ｇ、実施例２で合成したウシＬＦ１−１８２０ｇ、ステアリン酸タルク５ｇを混合し、常法により打錠し、ペプチド１００ｍｇを含有する１ｇの錠剤を２００個製造した。
（２）注射剤
１００ｍｌ中にマンニトール５ｇ、実施例２で合成したウシＬＦ１−１８１００ｍｇ、ヒト血清アルブミン１００ｍｇ、カプリル酸ナトリウム２ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封した。

ウシラクトフェリンのペプシンによる酵素分解物のＨＰＬＣパターンを示す。図中の↓印のピークに本発明のペプチドが存在する。

Claims

次のアミノ酸配列〔Ｉ〕で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr-Ile-Ser-Gln-Pro-Asp-Ser-Phe-Lys 〔Ｉ〕
アミノ酸配列〔Ｉ〕のＮ末端のアミノ酸残基が１〜３残基欠失したものである請求項１記載のペプチド。
次のアミノ酸配列〔II〕で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。

但しＳ−Ｓ結合は還元状態のＳＨ基となっていてもよい。
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする免疫賦活剤。
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするサイトメガロウイルス感染防御剤。
ウシラクトフェリンを、プロテアーゼにより酵素分解し、酵素分解物から請求項１〜３記載のいずれかのペプチドを採取することを特徴とするペプチドの製造法。