JP3569414B2

JP3569414B2 - Actin-binding protein neurabin

Info

Publication number: JP3569414B2
Application number: JP09261597A
Authority: JP
Inventors: 義美高井; 宏之中西
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1997-04-10
Publication date: 2004-09-22
Anticipated expiration: 2017-04-10
Also published as: JPH10276784A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、動物の脳に特異的に存在し、神経シナプス結合の形成等に重要な役割を果たしている新規なアクチン結合蛋白に関するものであり、この蛋白質は、神経系の発生、分化の分子機構の解明、あるいは、神経疾患等の診断または予防、治療薬の開発などに有用である。
【０００２】
【従来の技術】
脳における信号伝達では、神経細胞同士のシナプス結合が極めて重要な役割を果たしている。この神経シナプス結合が形成される過程では、神経細胞は軸索突起の伸張を行い、その先端に成長円錐が形成されるが、この成長円錐には豊富なアクチン線維が存在しており、外界からの刺激に応じてアクチンの重合、脱重合を反復することによって成長円錐が活発な運動を行い、これによって軸索突起の伸張が促されることが知られている。最近、ＲｈｏファミリーのＧ蛋白質である
Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ、Ｒｈｏがそれぞれアクチン系細胞骨格を介してｆｉｌｏｐｏｄｉａの形成、ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａの形成・接着とストレス線維の形成を制御することが報告されている（Ｃｅｌｌｖｏｌ．８１，ｐ５３−６２，１９９５）。これらの個々の細胞機能が時間的秩序を保って発現されることによって、成長円錐の運動が効率的に引き起こされる。しかしながら、個々のＧ蛋白質が制御するアクチン系細胞骨格蛋白質（アクチン結合蛋白質）は未だ同定されておらず、この成長円錐の運動を制御する分子機構の解明、すなわち神経シナプス結合の形成過程を制御する機構を解明するためには、個々の細胞機能に関与するアクチン結合蛋白質を同定することが重要であると考えられる。
【０００３】
またアクチン結合蛋白質の同定は、神経シナプス結合部の分子構造を理解するためにも重要である。すなわち、伸張した軸索突起は、最終的に他の細胞と結合して神経シナプス結合を形成させるが、シナプス結合前部と後部は２０−３０ｎｍの間隔を保って相接し、前部から後部へ情報伝達を行っている。このシナプス結合間の情報伝達において最も特徴的なことは、一般の分泌細胞における分泌の時間的経過が分オーダーであるのに対し、シナプス結合前部からの情報伝達物質の放出がミリ秒オーダーときわめて早いことである。これは一つには、シナプス前部の細胞膜近傍における特徴的なシナプス小胞の貯留形式によると考えられている（Ｃｅｌｌｖｏｌ．８３，ｐ１８７−１９４，１９９５）。シナプス小胞はシナプス前部の細胞質に均一に存在するのではなく、大部分のシナプス小胞はシナプス前部の細胞膜より０．５ μｍ以下の部位にクラスターしている。このクラスター中の大部分のシナプス小胞はシナプス前部の細胞骨格系と連結しており、アクチン結合蛋白質であるｓｙｎａｐ−ｓｉｎがこの連結に重要な役割を果たしていると推測されている。また、クラスター中の一群のシナプス小胞はシナプス前部の細胞膜にｄｏｃｋｉｎｇしており、シナプス小胞とシナプス小胞と細胞膜は融合した状態になっている。このｄｏｃｋｉｎｇしたシナプス小胞電子顕微鏡上アクティブゾーンとして観察される密度の高い構造物に並列しており、このアクティブゾーンには、Ｃａ^２＋の流入をつかさどるチャネルと、Ｃａ^２＋の濃度変化に応じて神経伝達物質の放出をトリガーする機構が濃縮されていると考えられている。しかしながら、アクティブゾーンを含めて神経シナプス前部の細胞膜周辺の基本的な構造蛋白質は全く不明である。
【０００４】
これまでに、神経シナプス前部細胞膜にアクチン結合蛋白質であるｆｏｄｒｉｎが存在し、クラスターしたシナプス小胞間にアクチンが存在するという報告があり、またアクチンとそのモーター蛋白質であるｍｙｏｓｉｎがシナプス小胞の細胞膜への融合化に影響を及ぼすとの報告もなされている。従って、アクチン結合蛋白質がアクティブゾーンを含めた神経シナプス前部の細胞膜周辺の構造形式に重要であることは十分に推測されている。
【０００５】
以上のとおり、神経軸索突起の伸張とそれに続く神経シナプス前部の特徴的な構造形成を理解する上で、アクチン結合蛋白質のさらなる同定は必須である。また、このような蛋白質は、例えば脳内情報伝達の機能的、構造的障害に起因する神経疾患等の診断または予防もしくは治療のための新しい方法や材料を提供するものと期待される。
【０００６】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、脳内に特異的に存在する新規なアクチン結合蛋白質を、その構造（アミノ酸配列）および性状を明らかにして提供することを目的としている。
また、この発明は、このアクチン結合蛋白質の遺伝子工学的操作のための材料を提供することを目的としもている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列を有し、脳に特異的に存在するアクチン結合蛋白質を提供する。
またこの発明は、配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有する動物性蛋白質を提供する。
【０００８】
さらにこの発明は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列と、このｃＤＮＡ配列またはその一部配列がハイブリダイズするゲノムＤＮＡ配列をも提供する。
すなわち、この発明の蛋白質は、成長ラット脳シナプトゾーム画分より分離精製した分子量１８０ＫＤａの蛋白質であり、アクチン線維（Ｆ−アクチン）との結合性によってアクチン結合蛋白質であることが確認された蛋白質である。そして、この精製蛋白質の一部アミノ酸配列をプローブとしてラットｃＤＮＡライブラリーよりｃＤＮＡクローンを取得し、このｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列の解析の結果、この蛋白質は配列番号１のアミノ酸配列を有する新規なアクチン蛋白質であることも確認されている。
【０００９】
この発明のアクチン結合蛋白質は、従って、上記のｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、大腸菌等で発現させて取得することができる。また、上記の
ｃＤＮＡまたはその一部をプローブとして用いることにより、ラット以外の動物のｃＤＮＡライブラリーから該当するｃＤＮＡを単離し、これを適当な宿主−ベクター系で発現させることにより、動物種に固有の蛋白質として取得することもできる。このようなラット以外の動物由来の蛋白質も配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質である。
【００１０】
この発明のｃＤＮＡ配列は、上記のとおりのラットｃＤＮＡおよびその他の動物由来のｃＤＮＡを含むものである。また、この発明のゲノムＤＮＡ配列は、全ての動物種のＤＮＡ配列を含むものである。
以下、実施例を示して、この発明のアクチン結合蛋白質の取得並びにその性状等についてさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１１】
【実施例】
実施例１：アクチン結合蛋白質の同定と精製
ラットの様々な臓器（脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、骨格筋、精巣）のホモジュネートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、ニトロセルロース膜に転写した後、^１２５Ｉで標識したＦ−アクチンとの結合性を指標としてアクチン結合蛋白質を同定した（図１参照）。その結果、脳に特異的な分子量１８０ＫＤａおよび１４０ＫＤａのバンドが得られた。これらの蛋白質の^１２５Ｉ標識Ｆ−アクチンとの結合性は標識しているＦ−アクチンによって競合阻害された。従って、１８０ＫＤａおよび１４０ＫＤａの蛋白質は共に、実際にＦ−アクチンに結合すると示唆される。また、これらの蛋白質は^１２５Ｉで標識したＧ−アクチンには結合しないことから、脳特異的なＦ−アクチン結合蛋白質であることが確認された。
【００１２】
次に、これらの蛋白質の脳での分布を調べたところ、シナプトゾーム可溶画分に濃縮されていることが判明した。そこで、シナプトゾーム可溶画分より各種のカラムクロマトグラフィーを用いて、１８０ＫＤａ蛋白質を高度に精製した。この精製蛋白質をポリアクリルアミドゲルから切り出し、分解酵素（ｌｙｓｉｌｅｎｄｏ− ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）によって限定分解した後、ペプチドマッピングを行い、９つのペプチドを単離し、それらの部分アミノ酸配列を決定した。そして、配列データベースによる相同性検索の結果、１８０ＫＤａ蛋白質は新規な蛋白質であることが確認された。一方、１４０ＫＤａ蛋白質は、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによって３つのピークとして溶出された。最初に溶出されたピークをさらに精製した結果、この１４０ＫＤａ蛋白質は神経細胞特異的な既知のアクチン結合蛋白であるＤｒｅｂｒｉｎであることが判明した。
実施例２：アクチン結合蛋白質の性状解析
実施例１で得た１８０ＫＤａ蛋白質のアクチン結合様式をｂｌｏｔｏｖｅｒｌａｙ法を用いて検討した結果、１８０ＫＤａ蛋白質とアクチンとの結合はｍｙｏｓｉｎｓｕｂｆｒａｇ− ｍｅｎｔ１によって特異的に阻害されたが、ｇｅｌｓｏｌｉｎでは阻害されなかった。これらのことにより、１８０ＫＤａ蛋白質はアクチン線維の側面に結合することが示唆された。
【００１３】
次に、この１８０ＫＤａ蛋白質が重合、脱重合などのアクチンのダイナミックな動態に関与しているかを検討した。ｐｙｒｅｎｅ−アクチンを用いた実験の結果、１８０ＫＤａ蛋白質はアクチンの重合、脱重合に作用しなかった。また、ｆａｌｌｉｎｇｂａｌｌ法を用いて１８０ＫＤａ蛋白質アクチン線維の架橋作用を検討した実験では、この蛋白質はアクチン線維の粘度を増強した（図２）。
【００１４】
以上の結果から、１８０ＫＤａ蛋白質はアクチン線維の側面に結合し、アクチン線維を架橋させることが確認された。
実施例３：アクチン結合蛋白質の遺伝子クローニング
実施例１で得た１８０ＫＤａ蛋白質の部分アミノ酸配列に基づいて６種類のオリゴヌクレオチドプローブを作成し、ラットの脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、約３．７ｋｂｐの遺伝子を有するクローンが得られた。配列を決定したところ、このクローンは配列番号１に示したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしており、実施例１で単離した１８０ＫＤａ蛋白質の９個のペプチドを全て含んでいた。
【００１５】
次に、このクローン遺伝子を発現ベクターに組み込み、このベクターをＣＯＳ７細胞に導入して、細胞の発現産物について^１２５Ｉ標識Ｆ−アクチンを用いたｂｌｏｔｏｖｅｒｌａｙ法を行ったところ、確かに１８０ＫＤａの分子量の位置にバンドが認められたことから、このクローンはラット脳より精製した１８０ＫＤａ蛋白質の遺伝子全長をコードしていることが確認された。
実施例４：アクチン結合蛋白質の構造解析
実施例１で得た１８０ＫＤａ蛋白質のアミノ酸１次構造を解析したところ、中央部にＰＤＺドメインが、そのＣ末端側にコイルド・コイル構造と予想させる部位が認められた。また、ノーザンブロット分析の結果からは、図３に示したように脳での特異的発現が認められ、上記ｂｌｏｔｏｖｅｒｌａｙ法の結果とよく一致した。
【００１６】
さらに、１８０ＫＤａ蛋白質のアクチン結合ドメインを決定するために、この蛋白質を４分割し、各断片をｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）と融合させ、^１２５Ｉ標識Ｆ−アクチンを用いたｂｌｏｔｏｖｅｒｌａｙ法を行った。その結果、１８０
ＫＤａ蛋白質のＮ末端から１４４番目のアミノ酸部位にアクチン結合ドメインが存在することが確認された。
【００１７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、脳で特異的に発現する新規なアクチン結合蛋白質と、この蛋白質を産業上利用するための遺伝子材料が提供される。これらの蛋白質および遺伝子材料は、脳内情報伝達に重要な役割を果たしている神経シナプス結合の発生や形成過程を解明するために有用であるばかりか、脳内情報伝達系の機能的および／または構造的障害等を原因とする各種神経疾患の診断または予防もしくは治療法の開発にも大きく貢献する。
【００１８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】アクチン結合蛋白質の同定のために行った^１２５Ｉ標識Ｆ−アクチンによるｏｖｅｒｌａｙ法の原理を示した模式図である。
【図２】この発明のアクチン結合蛋白質のアクチンの重合への影響を調べるために行ったＦａｌｌｉｎｇＢａｌｌ法の結果である。
【図３】この発明のアクチン結合蛋白質の発現分布をしら調べるために行ったノーザンブロットの結果である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel actin-binding protein that is specifically present in the brain of animals and plays an important role in the formation of nerve synaptic connections and the like, and this protein is a molecular mechanism of development and differentiation of the nervous system. It is useful for elucidation of, or diagnosis or prevention of, for example, neurological diseases, and development of therapeutic drugs.
[0002]
[Prior art]
In signal transmission in the brain, synaptic connections between nerve cells play an extremely important role. In the process of forming these nerve synaptic connections, nerve cells extend axons and form growth cones at their tips.Abundant actin fibers are present in these growth cones, and from the outside world, It is known that by repeating polymerization and depolymerization of actin in response to the stimulus, growth cones perform active movements, which promotes axonal outgrowth. Recently, it has been reported that the Rho family G proteins Cdc42, Rac, and Rho regulate the formation of filopodia, the formation and adhesion of lamellipodia, and the formation of stress fibers via the actin-based cytoskeleton (Cell vol. 81, p53-62, 1995). The expression of these individual cell functions in a temporally ordered manner causes efficient movement of the growth cone. However, the actin-based cytoskeletal protein (actin-binding protein) controlled by each G protein has not yet been identified, and elucidation of the molecular mechanism controlling the movement of this growth cone, that is, controlling the process of forming neural synaptic connections. To elucidate the mechanism, it is considered important to identify actin-binding proteins involved in individual cell functions.
[0003]
Identification of actin-binding proteins is also important for understanding the molecular structure of neuronal synaptic junctions. In other words, the extended axons ultimately bind to other cells to form neural synaptic connections, but the front and rear portions of the synaptic connections are in contact at a distance of 20-30 nm, and the front to the rear are connected. Information is communicated to The most characteristic feature of this signal transmission between synaptic junctions is that the secretory time course of general secretory cells is on the order of minutes, whereas the release of signaling substances from the presynaptic junction is on the order of milliseconds. It is very fast. This is thought to be due in part to the characteristic form of synaptic vesicle storage near the presynaptic cell membrane (Cell vol. 83, p187-194, 1995). Synaptic vesicles are not uniformly present in the presynaptic cytoplasm, but most synaptic vesicles are clustered at sites less than 0.5 μm below the presynaptic cell membrane. Most of the synaptic vesicles in this cluster are linked to the presynaptic cytoskeletal system, and it is speculated that synap-sin, an actin-binding protein, plays an important role in this connection. In addition, a group of synaptic vesicles in the cluster is docking to the cell membrane at the presynaptic, and the synaptic vesicle, the synaptic vesicle, and the cell membrane are in a fused state. And in parallel to the high structural density that is observed as the docking synaptic small胞電Ko microscope on the active zone, this active zone, a channel responsible for influx of Ca ^2+, in response to changes in the concentration of Ca ²⁺ nerve It is believed that the mechanisms that trigger transmitter release are concentrated. However, the basic structural proteins around the cell membrane at the presynaptic nerve, including the active zone, are completely unknown.
[0004]
So far, it has been reported that the actin-binding protein fodrin is present in the presynaptic cell membrane and actin is present between clustered synaptic vesicles, and that actin and its motor protein myosin are involved in synaptic vesicles. It has also been reported to affect fusion to cell membranes. Therefore, it is sufficiently speculated that the actin-binding protein is important for the structural form around the cell membrane at the presynaptic nerve including the active zone.
[0005]
As described above, further identification of actin-binding proteins is essential for understanding the elongation of neurites and the subsequent characteristic structure formation of the presynaptic nerve. In addition, such proteins are expected to provide new methods and materials for diagnosing, preventing, or treating neurological diseases and the like caused by, for example, functional and structural disorders of information transmission in the brain.
[0006]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a novel actin-binding protein that specifically exists in the brain by clarifying its structure (amino acid sequence) and properties. The purpose is.
Another object of the present invention is to provide a material for genetically engineering the actin-binding protein.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides an actin-binding protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and specifically present in the brain to solve the above-mentioned problems.
The present invention also provides an animal protein having an amino acid sequence substantially identical to SEQ ID NO: 1.
[0008]
The present invention further provides a cDNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence substantially identical to SEQ ID NO: 1, and a genomic DNA sequence to which the cDNA sequence or a partial sequence thereof hybridizes.
That is, the protein of the present invention is a protein having a molecular weight of 180 KDa separated and purified from a synaptosome fraction of a growing rat brain, and confirmed to be an actin-binding protein by binding to actin fibers (F-actin). . Then, a cDNA clone was obtained from a rat cDNA library using a partial amino acid sequence of this purified protein as a probe, and as a result of analysis of the amino acid sequence deduced from this cDNA, this protein had a novel amino acid sequence having SEQ ID NO: 1. It has also been confirmed that it is an actin protein.
[0009]
Therefore, the actin-binding protein of the present invention can be obtained by inserting the above cDNA into an appropriate expression vector and expressing it in E. coli or the like. In addition, by using the above-mentioned cDNA or a part thereof as a probe, the relevant cDNA is isolated from a cDNA library of an animal other than rat, and expressed in an appropriate host-vector system, whereby the specific cDNA can be obtained. Can also be obtained as a protein. Such proteins derived from animals other than rats are also proteins having substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1.
[0010]
The cDNA sequences of the present invention include rat cDNAs as described above and cDNAs derived from other animals. The genomic DNA sequence of the present invention includes DNA sequences of all animal species.
Hereinafter, the acquisition of the actin-binding protein of the present invention and the properties thereof will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
[0011]
【Example】
Example 1 Identification and Purification of Actin Binding Protein Homodunates of various organs (brain, lung, heart, liver, spleen, kidney, skeletal muscle, testis) of rats are subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After transfer to a nitrocellulose membrane, an actin-binding protein was identified using the binding to ¹²⁵ I-labeled F-actin as an index (see FIG. 1). As a result, brain-specific bands of 180 KDa and 140 KDa were obtained. The binding of these proteins to ¹²⁵ I-labeled F-actin was competitively inhibited by the labeled F-actin. Thus, it is suggested that both the 180 KDa and 140 KDa proteins actually bind to F-actin. Further, since these proteins did not bind to G-actin labeled with ¹²⁵ I, it was confirmed that they were brain-specific F-actin binding proteins.
[0012]
Next, when the distribution of these proteins in the brain was examined, it was found that they were concentrated in the synaptosome-soluble fraction. Therefore, the 180 KDa protein was highly purified from the synaptosome-soluble fraction using various column chromatography. The purified protein was excised from polyacrylamide gel, and after limited digestion with a degrading enzyme (lysil endo-peptidase), peptide mapping was performed to isolate nine peptides, and their partial amino acid sequences were determined. Then, as a result of homology search using a sequence database, it was confirmed that the 180 KDa protein was a novel protein. On the other hand, the 140 KDa protein was eluted as three peaks by phenyl sepharose column chromatography. Further purification of the first eluted peak revealed that the 140 KDa protein was Drebrin, a known actin-binding protein specific to nerve cells.
Example 2 Analysis of Properties of Actin-Binding Protein As a result of examining the actin-binding mode of the 180 KDa protein obtained in Example 1 using the blot overlay method, the binding between the 180 KDa protein and actin was specifically determined by myosin subfragment 1. Inhibited but not gelsolin. These facts suggested that the 180 KDa protein binds to the side of the actin fiber.
[0013]
Next, it was examined whether the 180 KDa protein is involved in dynamic actin dynamics such as polymerization and depolymerization. As a result of an experiment using pyrene-actin, the 180 KDa protein did not act on polymerization and depolymerization of actin. In an experiment in which the cross-linking action of a 180 KDa protein actin fiber was examined by using the falling ball method, this protein increased the viscosity of actin fiber (FIG. 2).
[0014]
From the above results, it was confirmed that the 180 KDa protein binds to the side surface of the actin fiber and cross-links the actin fiber.
Example 3 Gene Cloning of Actin-Binding Protein Six types of oligonucleotide probes were prepared based on the partial amino acid sequence of the 180 KDa protein obtained in Example 1, and a rat brain cDNA library was screened. As a result, a clone having a gene of about 3.7 kbp was obtained. As a result of sequence determination, this clone encoded a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and contained all nine peptides of the 180 KDa protein isolated in Example 1.
[0015]
Next, this cloned gene was incorporated into an expression vector, this vector was introduced into COS7 cells, and the expression product of the cells was subjected to a blot overlay method using ¹²⁵ I-labeled F-actin. The presence of a band at the position confirmed that this clone encoded the full-length gene of 180 KDa protein purified from rat brain.
Example 4 Structural Analysis of Actin-Binding Protein Analysis of the primary amino acid structure of the 180 KDa protein obtained in Example 1 revealed a PDZ domain in the center and a coiled-coil structure at the C-terminal side. Was done. In addition, from the results of Northern blot analysis, specific expression in the brain was observed as shown in FIG. 3, which was in good agreement with the result of the blot overlay method described above.
[0016]
Further, in order to determine the actin-binding domain of the 180 KDa protein, this protein was divided into four parts, each fragment was fused with glutathione S-transferase (GST), and a blotlay method using ¹²⁵ I-labeled F-actin was performed. As a result, 180
It was confirmed that an actin-binding domain exists at the 144th amino acid site from the N-terminus of the KDa protein.
[0017]
【The invention's effect】
As described in detail above, the present invention provides a novel actin-binding protein specifically expressed in the brain and genetic material for industrially using this protein. These proteins and genetic materials are useful not only for elucidating the generation and formation processes of neural synaptic connections that play an important role in brain signal transmission, but also for the functional and / or structure of the brain signal transmission system. It greatly contributes to the development of diagnosis or prevention or treatment of various neurological diseases caused by mechanical disorders and the like.
[0018]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the principle of the overlay method using ¹²⁵ I-labeled F-actin for identifying an actin-binding protein.
FIG. 2 shows the results of the Falling Ball method performed to investigate the effect of the actin-binding protein of the present invention on actin polymerization.
FIG. 3 shows the results of a Northern blot performed to examine the distribution of the expression of the actin-binding protein of the present invention.

Claims

An actin-binding protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and specifically present in the brain.

CDNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.