JP4733015B2 - グリコサミノグリカンを物理的に解重合する方法およびそれから得られる生成物 - Google Patents

Description

グリコサミノグリカンは、薬剤として大きな関心を持たれている天然産物である。最も広く使用されているものとして、とりわけヘパリン、デルマタン、ヘパラン硫酸およびコンドロイチンを挙げることができる。

これらの天然産物の分子量は、ものによって大幅に異なるが、通常は5〜40kDaの範囲である。しかし、特定用途には、比較的低い分子量のほうが高い薬理活性をもたらすことが知られている。これらの化合物は、分子量が高いとしばしば経口投与ができなくなる。さらに、グリコサミノグリカンに特有の諸活性は、比較的短い糖配列に関係していることが知られている。したがって、グリコサミノグリカンを解重合して、その分子中に存在する活性サイトは失わずに分子量を低下させれば大いに有利なはずである。

グリコサミノグリカンの化学的解重合は、当技術分野において周知であり、より低分子量ではあるがS含有量もより低いグリコサミノグリカンをもたらす。

欧州特許第394971号は、酵素的または化学的に解重合する方法を開示している。得られるヘパリンオリゴマーの硫黄含有量は9%未満である。

国際特許公開第90/04607号は、H₂O₂およびCu²⁺の使用によるヘパリンおよびデルマタン硫酸の解重合を開示している。SO₃ ^-/COO^-比は、出発原料ヘパリン中よりもわずかに低い。

米国特許第4987222号は、γ線の使用によってヘパリンを解重合する方法を開示している。その実施例は、分子量が約5,000Daで、S含有量の高いヘパリンの調製を開示している。しかし、この方法によって生成したヘパリンは、制御されない副反応の結果としてある量の分解生成物の存在を示す。
欧州特許第394971号 国際特許公開第90/04607号 米国特許第4987222号 国際特許公開第03/076474号(LDO) 国際特許公開第2004/000886号(LDO) Khanら、Polymer Photochemistry 6 (1985年) 465〜474頁 欧州薬局方4版:クロマトグラフィー技術2.2.30項および2.2.46項、方法01/2002:0828、1297頁) 欧州薬局方4版:2.7.5項、168頁

したがって、グリコサミノグリカンの化学構造を大幅に変更せずに、その分子量を低下させることが望ましい。

グリコサミノグリカンにUVを照射すると分解されることは、当技術分野において知られている。たとえば、Polymer Photochemistry 6巻 (1985年) 465〜474頁で、KhanらはヘパリンCa塩水溶液に対するUV放射の効果を研究した。解重合は検出されたが、それは1つの分解過程と見なされたにすぎず、ヘパリンの制御された解重合のための潜在的に可能な工業的方法とは見なされなかった。

本発明は、245nm〜260nmの範囲にピークを有するUVC放射の使用によって、グリコサミノグリカンを解重合する物理的方法に関する。本発明はまた、この方法によって得られるグリコサミノグリカンにも関する。

本発明は、グリコサミノグリカンの化学構造を実質的に変更せずに、その分子量を低下させる物理的解重合方法を提供する。

この目的は、UVC放射の使用によって達成される。出発原料としてヘパリンを使用する場合には、この方法は、高いS含有量を特徴とする低分子量ないしは超低分子量のヘパリンをもたらす。

本発明による方法で使用される出発原料は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン、コンドロイチンなど天然のグリコサミノグリカンである。他の適当な出発原料は、知られている方法によって得られるグリコサミノグリカン誘導体である。したがって、たとえばヘキソサミン残基のN-アセチル基またはN-硫酸基を、N-脱硫酸化反応またはN-脱アセチル化反応によってアミノ基に転換することができ、またウロン酸の硫酸基は、脱硫酸化反応によってエポキシ基を生じることができる。

他の実施形態においては、すでに化学的、物理的または酵素的のいずれかの解重合方法で処理されたグリコサミノグリカンを、本発明の方法の出発原料として使用することが可能である。本発明の方法と組み合わせて使用できる物理的解重合方法の例は、国際特許公開第03/076474号(LDO)および国際特許公開第2004/000886号(LDO)に記載されており、これらを参照により本明細書に援用する。部分的に解重合されたグリコサミノグリカンの使用は、たとえば部分的解重合を副次的効果として有する酸前処理を施したヘパリンの場合、あるいは官能化されたグリコサミノグリカンを解重合する場合に該当する。官能基を導入するために使用される諸条件も、ときには多糖類の分子量低下をもたらす。

したがって、両方のステップをUVC放射の使用によって行うことが可能であるだけではなく、最初の解重合ステップはUVC放射の使用によって行い、続いて化学的-酵素的解重合を使用して第2ステップを行うこと、あるいは化学的-酵素的解重合の第1のステップに続いてUVC放射解重合を行うことも可能である。本発明の方法は、グリコサミノグリカンの化学構造は顕著に変更しないで、この多糖の分子量を低下させることを可能にする。照射後のグリコサミノグリカンの分子量は、照射前のグリコサミノグリカンの分子量の50%以下である。

分子によるスペクトルの紫外(200〜400nm)あるいは可視(400〜800nm)領域の吸収は、吸収されるエネルギーの大きさが有機分子に関連する結合解離エネルギーにほぼ等しいほど、エネルギーの高い励起状態をもたらす。吸収が250nmで起こる場合、この遷移に関連するエネルギー(E=480kJmol^-1)は、それぞれ多原子分子での平均値である、炭素-炭素σ結合 (D≒347kJmol^-1)、炭素-酸素σ結合(D≒330kJmol^-1)および炭素-水素結合(D≒414kJmol^-1)の結合解離エネルギーよりも大きい。したがって、紫外線を用いる励起によって化学反応が誘起されうることは驚くべきことではない。一般的に言うと、有機分子中の共有結合の均一開裂は、UV放射によって誘起させることができ、2個の中間体ラジカルが形成される。

水銀蒸気入りのアークランプは、現在では溶液相での光化学反応の大部分で選択される光源である。これらの光源は、光スペクトルの紫外部および可視部で放射を提供し、その範囲は200nm〜750nmに及び、実用上あらゆる目的に有用である。水銀ランプには主に低圧、中圧、高圧の3種類があり、それぞれ異なる特性を有する。低圧ランプは、室温で動作し、主に253.27および184.9nmで放射する。中圧ランプは、弱い連続スペクトルを出し、それには複数のスペクトル線の重なりがあり、加えて253.27および184.9nmで強度が弱くなる。高圧ランプでは、圧力の大幅な増大によりさらに多くの線が導入される。280nm未満での放射は非常に弱い。189.4nmの放射(遠紫外)は、溶媒、水に吸収される。吸収が184.9nmで起こる場合は、この遷移に関連するエネルギーはE=649kJmol^-1である。それぞれ多原子分子の平均値である、酸素-水素結合の解離エネルギーは約455kJmol^-1であるので、この放射は、水からH^-およびOH^-を発生させることができる。194.2nm(遠紫外)および253.27nmは、ヘパリン分子によって吸収される。300nmを超えると、ヘパリンは吸収しない。

本発明は、好ましくは水銀ランプ、最も好ましくは低圧および中圧ランプからの245nm〜260nmの範囲に発光ピークを有するUV放射の使用に関する。

他の実施形態において、本発明は、主に波長約253nmにおけるUV放射の使用を対象とする。実際に、他の波長における放射を吸収し253nmの放射だけを透過させるフィルターを使用することが可能である。このようにして、前述したような副反応を最小限に抑え、解重合反応において高い選択性を得ることが可能となる。

本発明の範囲を限定するものではないが、253nmでの放射はグリコシド結合の解離を起こすと考えられており、またこれが解重合における重要なステップであると考えられている。励起された分子は、2個の中間体ラジカルを形成することによってエネルギーを放出し、これらのラジカルは、何らかの経緯でより分子量の低い安定な構造になる。

解重合の機序はまだ明らかになっていないが、本発明者らは以下のように考えている、すなわち、形成されたフリーラジカルは、水の中の酸素によって捕捉されることができ、生じた酸素-酸素結合は、大気中の酸素と太陽光によって誘起される一般的な自動酸化に似た機序で開裂されることができる(酸素-酸素σ結合、D≒137kJmol^-1)。この解重合経路進行C-O-C→C-OH+C-OHは、グリコシド結合の自動酸化であると説明できる。

しかし、この方法は、酸素が存在しなくても実施することができ、酸素との反応を必要としない他のフリーラジカル生成機序の存在を示唆している。

本発明の方法は、通常グリコサミノグリカンの水溶液に対して実施される。

溶液中のグリコサミノグリカン濃度は、広い範囲で変わり得る。グリコサミノグリカンは、好ましくは2〜25重量/容積%、より好ましくは4〜15%含まれる。水溶液のpHは、好ましくは3.0〜7.0の範囲、最も好ましくは4.0〜6.0の範囲に保たれる。実際に、溶液が塩基性である場合、グリコサミノグリカンのアニオン性解重合が起こる。

pHを所望の値に調節するには、酢酸、クエン酸などの弱酸を使用することが可能である。

照射後、溶液は非常に透明であり、着色物質を除去するための処理を全く必要としない。

中間的に解重合されたグリコサミノグリカンを、ゲル浸透クロマトグラフィーによって分別することも可能である。所望の分子量を含む画分を集め、限外ろ過によって濃縮し、凍結乾燥する。

本発明の方法は、好ましくはダイナミック照射法を使用して行う。

「ダイナミック照射法」という用語は、照射がされる溶液を薄い層としてランプジャケット中を循環させ、次に、好ましくは温度調節されている貯蔵タンク（reservoir）に戻す方法を意味する。液は、1つのランプあるいは直列又は並列に接続できる2つ以上のランプ中を循環することができる。

循環回路中の溶液の流量は重要ではないが、溶液の過熱を避けるのに十分な流量であることが好ましい。

循環回路中の溶液の温度は、広い範囲で変わり得る。好ましくは0〜70℃、より好ましくは10〜60℃に維持される。

この方法は、バッチ方式または連続方式のいずれでも行える。装置には、好ましくは貯蔵タンクが形成され、そこから液が照射区域へ移動する。次に、液は貯蔵タンクへ戻される。

他の実施形態では、溶液は貯蔵タンクから連続的に抜き出され、所望の目標分子量に従って変わり得るカットオフで膜ろ過される。

たとえば、Mwが2,000〜3,000の間に含まれる解重合ヘパリンを得ようとする場合は、5,000Daのカットオフを使用することが可能である。所望の分子量が2,000Da未満である場合は、3,000Daのカットオフを使用することが可能である。

連続膜ろ過ステップを使用することによって、照射を受ける溶液はより高いMwに維持される。したがって、薬剤活性がより低い非常に小さいヘパリン断片の形成を回避することが可能である。

実験の部
分子質量(分子量)は、サイズ排除クロマトグラフィー(欧州薬局方4版:クロマトグラフィー技術に関しては2.2.30項および2.2.46項、方法に関しては01/2002:0828、1297頁)によって決定した。

260nmにおける吸光度は、欧州薬局方4版01/2002:0828、1297頁に従って決定した。

抗Xa活性は、欧州薬局方4版に記載されている方法に従って決定した。:クロマトグラフィー技術に関しては2.2.30項および2.2.46項、方法に関しては01/2002:0828、1297頁。

抗凝固活性は、欧州薬局方4版:2.7.5項、168頁に記載されている方法に従って決定した。

(実施例1)
Mwが13,000DaであるヘパリンNa塩の10%溶液5lを、貯蔵タンク、ランプ4個(合計460W)の循環回路、液を循環回路中へ循環させる蠕動ポンプ(19L/h)、および溶液を30℃に冷却する小型熱交換器で形成される照射システムに導入する。
液を16時間照射する。
ヘパリンを回収し、噴霧乾燥し、分析する。
Mw=5.000
260nmにおける吸光度(0.4%溶液)=0.080
無機硫酸塩=なし
aXa活性=106U/mg
抗凝固活性=114U/mg
NMR:¹³C-NMRシグナルの積分によって得た値

得られた中間的に解重合されたヘパリンは、ゲル浸透クロマトグラフィーによって分別することができる。所望の分子量を含む画分を集め、限外ろ過によって濃縮し、凍結乾燥する。

(実施例2)
カットオフ値が5.000Daの膜による液の連続ろ過を行いながら、実施例1を繰り返した。膜ろ過によって取り出した液は、出発原料の10%ヘパリンNa塩溶液を加えて連続的に補った。

(実施例3)
10%へパリン溶液に代えて5%デルマタン硫酸(Mw=35,000Da)溶液を使用して、実施例1を繰り返した。
照射後、回収されたデルマタン硫酸は以下のような特徴を有していた。
Mw=15.000Da
260nmにおける吸光度=0.150
無機硫酸塩=なし
得られた中間的に解重合されたデルマタン硫酸は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって分別することができる。所望の分子量を含む画分を集め、限外ろ過によって濃縮し、凍結乾燥する。

(実施例4)
Mwが14,238DaであるヘパリンNa塩の10%溶液2.5lを、貯蔵タンク、115Wのランプ1個を収容した循環回路、液を循環回路中へ循環させる蠕動ポンプ(25L/h)、および溶液を30℃に冷却する小型熱交換器で形成される照射システムに導入した。
溶液を36時間照射し、Mw量測定のため試料を採取した。

(実施例5)
実施例4を56℃で繰り返した。
表1に、30℃および56℃で得られた結果を報告する。

この結果は、温度が30℃から56℃に上昇すると、解重合速度が速くなり、260nmおよび280nmにおける吸光度がわずかに上昇するが、吸光度は非常に小さいままであることを示す。

Claims (7)

1. グリコサミノグリカンを解重合して、Mwが解重合以前の元のMwの50%以下である、解重合されたグリコサミノグリカンを得る方法であって、245nmから260nmまでの範囲内にピークを有するUV放射の使用を特徴とし、前記グリコサミノグリカンが２〜２５重量／容積％のグリコサミノグリカンの水溶液である、方法。
2. UV放射の光源が、中圧または低圧Hgランプである請求項1に記載の方法。
3. UV放射が、253nmに優勢な発光帯を有する請求項1または2に記載の方法。
4. グリコサミノグリカンが、ヘパリンである請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
5. グリコサミノグリカンが、デルマタン硫酸である請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
6. 解重合される溶液が、0℃と70℃の間に含まれる温度に維持される請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
7. 請求項1から6のいずれか一項に記載の方法に従って得られる解重合されたグリコサミノグリカン。