JP4904021B2

JP4904021B2 - コラーゲンペプチド含有化粧料組成物とその製造方法

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Publication number: JP4904021B2
Application number: JP2005169833A
Authority: JP
Inventors: 聖子小泉; 圭造谷坂; 正治山東
Original assignee: Nitta Gelatin Inc
Current assignee: Nitta Gelatin Inc
Priority date: 2005-06-09
Filing date: 2005-06-09
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2025-06-09
Also published as: JP2006342107A

Description

本発明は、コラーゲンペプチド含有化粧料組成物とその製造方法とに関し、詳しくは、コラーゲンペプチドを含有することで各種の生理的な活性機能が付与された化粧料組成物と、このような化粧料組成物を製造する方法とを対象にしている。

コラーゲンペプチドが化粧料組成物の機能向上に有用であることは既に知られている。
例えば、特許文献１には、コラーゲン成分をシステインプロテアーゼにより分解してペプチド組成物を得る技術が示され、化粧品などに有用であるとされている。
本願の特許出願人は先に、特願２００４−３４２６４４号（以下、先行出願１と呼ぶ）を特許出願し、特定の分子量分布を有するコラーゲンペプチド組成物が、化粧料としての種々の機能に優れていることを明らかにしている。このような化粧料組成物に適したコラーゲンペプチド組成物が、特定のコラーゲン成分含有原料にアルカリ処理や酵素処理を行うことで得られることを明らかにしている。

特許文献２には、不溶性コラーゲンを亜臨界処理して、数万付近に分子量分布を持ったコラーゲンポリペプチドを得る技術が示されている。加水分解を促進するための触媒として酢酸を添加する技術も示されている。
特開２００４−２４４３６９号公報特開２００５−３４８０８号公報

コラーゲンペプチド組成物は、その製造方法、製造条件、得られたコラーゲンペプチドの組成配合などによって、その活性機能に大きな違いが生じる。また、生産性や製造コストにも大きな違いが生じる。
特許文献１に示されたコラーゲンを酵素分解する技術は、処理時間が非常に長くかかるという問題がある。通常、数時間〜数日間をかけないと目的のコラーゲンペプチドが得られない。また、酵素処理のみでは、化粧料組成物としての各種活性機能に優れたコラーゲンペプチドが得られ難い。
前記先行出願１は、コラーゲン原料をアルカリ処理したあとで酵素処理を行なうことで、分子量４００〜３０００程度のコラーゲンペプチドが効率的に得られ、化粧料組成物としての各種活性機能にも優れたものとなる。しかし、アルカリ処理および酵素処理に時間がかかるという問題が残っている。

特許文献２に示された不溶性コラーゲンを亜臨界処理する技術は、処理温度が２００℃程度では、分子量１０万程度のゼラチンに近い高分子量のコラーゲンペプチドが得られ、化粧料組成物としての活性機能が発揮できる比較的に低分子量のコラーゲンペプチドは得られ難い。処理温度を２８５℃に上げたり、酢酸触媒を使用したりして、分子量１万程度に分布するコラーゲンペプチドを得た具体例も示されているが、それでも、化粧料組成物としての活性機能に劣るものしか得られ難い。しかも、処理温度を上げたり触媒を使用したりするので、製造作業が難しくなり、製造コストも高くつく。
本発明の課題は、前記した従来におけるコラーゲンペプチド含有化粧料組成物の製造技術が有する問題点を解消し、化粧料組成物としての各種活性機能が非常に高いコラーゲンペプチドを短い時間で効率的に得ることである。

本発明にかかるコラーゲンペプチド含有化粧料組成物は、コラーゲン成分含有原料を処理温度１８０〜２２０℃、処理圧力１０〜２４ＭＰａ、処理時間３０〜１２０分の処理条件で亜臨界処理して得られた平均分子量２００〜１５００のコラーゲンペプチドを化粧有効成分として含有し、チロシナーゼ阻害活性が固形分換算で０．００１〜１０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕であり、メラニン合成阻害活性が固形分換算で０．００１〜０．２０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕であり、・ＯＨ消去能活性が固形分換算で０．００１〜２．０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕であり、ＳＯＤ様活性が固形分換算で１５００〜１００００〔ＳＯＤunits／ｇ〕であり、コラーゲン合成促進活性が２〜４倍（終濃度５０μｇ／ｍｌ添加、対ブランク）である。
〔コラーゲン成分含有原料〕
通常のコラーゲンペプチド製造に利用され、十分な量のコラーゲン成分を含有する天然材料あるいは天然材料からの抽出材料が使用できる。
コラーゲン成分は、動物の骨、皮などの結合組織に豊富に含まれる。コラーゲン成分を抽出する動物原料としては、特に限定されず、牛や豚、羊などの哺乳類、鶏やダチョウなどの鳥類、サメやエイ、鯛、アコヤ貝などの魚介類、カエル、イモリなどの両性類、ワニ、カメなどの爬虫類が挙げられる。これらの原料から、通常の抽出技術を適用して抽出されたコラーゲンが使用できる。市販のコラーゲン製品を使用することもできる。コラーゲン成分含有原料あるいはコラーゲンを分解して得られるゼラチンやコラーゲン分解物にもコラーゲンペプチドとなるコラーゲン成分が含まれている。市販のゼラチン製品やコラーゲン分解物製品を使用することもできる。

コラーゲンには、水に溶けない不溶性コラーゲンと、水に溶ける水溶性コラーゲンとが知られている。何れのコラーゲンも使用できる。水溶性コラーゲンのほうが、亜臨界水処理が行ない易く、高品質のコラーゲンペプチドが得られ易い。水溶性コラーゲンは、通常、分子量３０万程度である。
コラーゲン成分含有原料は、不溶性コラーゲンあるいは水溶性コラーゲンなどを粉体などの固体状態で含有するものであってもよし、水溶性コラーゲンなどを水に溶解させた水溶液の状態であってもよいし、水以外の溶媒にコラーゲンなどを溶解させたものであってもよい。固体で供給されたコラーゲン成分含有原料が、亜臨界水処理によって亜臨界水に溶解する場合もある。

コラーゲン成分含有原料には、コラーゲン成分以外にも、化粧料組成物の各種機能にとって有用な成分が含まれていてもよい。これらの有用成分もコラーゲンペプチドとともに、亜臨界水処理によってコラーゲンペプチド含有化粧料組成物に含まれた状態で取り出すことができる。
〔コラーゲンペプチド〕
コラーゲンペプチド含有化粧料組成物における主要な有効成分である。
コラーゲンペプチドは、通常、コラーゲンを構成するアミノ酸がペプチド結合で複数個つながった構造を有する。ペプチド結合の数によって、ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチドなどと呼ばれる。

コラーゲンペプチド含有化粧料組成物に含まれるコラーゲンペプチドは、平均分子量２００〜１５００である。ゼラチンのような高分子量成分は実質的に含まれない。ジペプチドのような低分子量成分は一部に含まれていても構わない。より好ましくは、平均分子量２００〜１０００である。分子量が大き過ぎると、目的とする各種機能が劣るとともに、化粧品に使用したときに、伸びが悪くなったりする。分子量が小さ過ぎても、目的の機能が劣るものになる。
コラーゲンペプチドの分子量分布によって、化粧料組成物の各種活性機能が変わる。分子量２００〜１５００の範囲のコラーゲンペプチドが多く含まれることが望ましい。具体的には、分子量２００以上、１５００未満のペプチドを７０〜１００重量％と、分子量２００未満のペプチドを３０重量％未満と、分子量１５００以上のペプチドを３０重量％未満とからなるものが好ましい。より好ましくは、分子量２００以上、１５００未満のペプチドを８５〜１００重量％と、分子量２００未満のペプチドを１５重量％未満と、分子量１５００以上のペプチドを１５重量％未満とからなるものである。

ペプチド組成物の分子量分布は、常法により測定できる。例えば、ＨＰＬＣ法（High Performance Liquid Chromatography）が採用される。
〔コラーゲンペプチド含有化粧料組成物の活性機能〕
コラーゲンペプチド含有化粧料組成物は、化粧料組成物に要求される各種の活性機能に優れたものが望ましい。具体的な活性機能として、チロシナーゼ阻害活性、メラニン合成阻害活性、ＯＨ消去能活性、ＳＯＤ様活性、コラーゲン合成促進活性などが挙げられる。
＜チロシナーゼ阻害活性＞
体内において、肌の美白に有害なメラニンは、アミノ酸の１種であるチロシンを基質としてチロシナーゼによってＤＯＰＡ、ＤＯＰＡキノンへと代謝されて合成される。この最初の反応がメラニン合成の律速段階となる。このように、チロシナーゼは、チロシンが酸化されメラニンへと合成される過程で作用する。チロシナーゼが活性化すると、肌にシミや色素沈着などの問題を引き起こす。チロシナーゼの活性作用を阻害できれば、肌の美白などに有効である。

チロシナーゼ阻害活性は、酵素活性を５０％阻害するのに必要な濃度の値：ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）で評価できる。この値が小さいほど、チロシナーゼ阻害活性が優れ、チロシナーゼを原因とするメラニン色素の合成が抑制され、美白効果が優れていると評価される。
具体的には、チロシナーゼ阻害活性が、固形分換算で１０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕以下であれば有効である。０．００１〜１０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕が望ましい。６〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕以下がより望ましい。
＜メラニン合成阻害活性＞
メラニン色素合成は、複数の要素が複合的に合わさって発生する。その要素として、前記したチロシナーゼのほか、メラニン色素細胞を刺激する活性酸素などがある。メラニン色素の合成に関わる全ての要素を総合的に評価することが有効である。

したがって、メラニン合成阻害活性は、前項のチロシナーゼ阻害活性とも関連するが、チロシナーゼ以外の原因によるメラニン色素の合成も含めて評価される。
メラニン合成阻害活性も、活性を５０％阻害するのに必要な濃度の値：ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）で評価できる。この値が小さいほど、メラニン合成阻害活性が高く、肌の美白効果に優れていると評価される。
具体的には、メラニン合成阻害活性が、固形分換算で０．２０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕以下であれば有効である。０．００１〜０．２０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕が望ましい。０．１５〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕以下がより望ましい。

＜・ＯＨ消去能活性＞
体内あるいは体表では、活性酸素と呼ばれる老化、発ガン作用のある物質が常に発生している。・ＯＨ（ヒドロキシラジカル）は、体内で発生する活性酸素のうち、肌にとって非常に有害であることが知られている活性酸素である。・ＯＨを消去できれば、体内酸化が防止できる。肌の老化を抑制することができる。
・ＯＨ消去能活性も、・ＯＨの活性を５０％阻害するのに必要な濃度の値：ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）で評価できる。この値が小さいほど、・ＯＨが消去されることになり、・ＯＨ消去能活性が高く、肌の老化防止や保護改善に有効であることを示す。

具体的には、・ＯＨ消去能活性が、固形分換算で２．０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕以下であれば有効である。０．００１〜２．０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕が望ましい。
＜ＳＯＤ様活性＞
活性酸素の一つにスーパーオキシドがある。このスーパーオキシドは、さらに強力な活性酸素である前記・ＯＨを発生させる原因になる。ＳＯＤ（スーパーオキシドディスムダーゼ）は、スーパーオキシドを消去する機能を有する酵素である。
但し、ＳＯＤそのものを人工的に生産するのは難しい。熱的に不安定で失活し易く精製が困難であり、高価である。ＳＯＤ様活性試験は、各種の物質に対して、同等の活性機能を示すＳＯＤ単位の量〔ＳＯＤunits／ｇ〕で評価する。この値が大きいほど、ＳＯＤ様活性が高く、活性酸素を無害化して、肌の酸化による老化などを抑制できる。

具体的には、ＳＯＤ様活性が、固形分換算で１０００〔ＳＯＤunits／ｇ〕以上であれば有効である。１５００〜１００００〔ＳＯＤunits／ｇ〕が望ましい。３０００〔ＳＯＤunits／ｇ〕以上がより望ましい。
＜コラーゲン合成促進活性＞
コラーゲンの合成は、皮膚の再生機能にとって重要である。
コラーゲン合成促進活性は、コラーゲンの合成を、試験組成物を添加した培地と非添加の培地（ブランク）とで行ない、非添加培地に対する添加培地におけるコラーゲン合成量の促進程度で評価することができる。具体的には、コラーゲン合成量を測定し、非添加培地を１．０としたときの倍率を算出する。この倍率が高いほど、コラーゲン合成促進活性が高く、皮膚の再生効果に優れていると評価される
具体的には、コラーゲン合成促進活性が、後述する試験において終濃度５０μｇ／ｍｌ添加時に、ブランクに対する倍率として１．５倍以上あれば有効である。本発明では、２〜４倍が達成できる。

〔コラーゲンペプチドの製造〕
コラーゲン成分含有原料に亜臨界水処理を行なうことで、コラーゲン成分含有原料のコラーゲンが加水分解され、コラーゲンペプチドが生成する。
＜亜臨界水＞
亜臨界水とは、通常の環境における水蒸気や液体の水とは大きく異なる性状を示す状態の水である。具体的には、気体と液体とが共存できる限界の温度および圧力の状態を臨界点と呼び、この臨界点を超えた温度および圧力の状態を超臨界と呼ぶ。亜臨界水は、水の沸騰点よりも高い温度、圧力であるが、臨界点を超えずに液体の状態である水を意味する。亜臨界水も、通常の水蒸気や液体の水とは大きく異なる性状を示す。加水分解の機能が非常に高く、強い反応溶媒として作用したり、強い抽出、精製作用を発揮したりする。

＜コラーゲン成分含有原料の亜臨界水処理＞
このような亜臨界水でコラーゲン成分含有原料を処理することによって、コラーゲン成分含有原料に亜臨界水が有する前記加水分解などの作用が加えられ、コラーゲンペプチドが生成する。
コラーゲンに対する亜臨界水の作用は理論的に明確に解明されているわけではない。コラーゲン分子が加水分解により切断されて、少ない数のペプチド結合からなるコラーゲンペプチドが生成されるものと思われる。コラーゲン分子の分解あるいは切断の位置や、生成されたコラーゲンペプチドの末端構造などで、コラーゲンペプチドの性状や機能が変わる。亜臨界水に特有の作用によって、化粧料組成物として有用なペプチド構造を有するコラーゲンペプチドが効率的に生成されるものと推測できる。

亜臨界水処理の処理条件によって、生成するコラーゲンペプチドの分子量とその分布、コラーゲンペプチドの特性、機能が変わる。
コラーゲンペプチド含有化粧料組成物として有用なコラーゲンペプチドを効率的に得るには、亜臨界水処理の処理条件を、処理温度１８０〜２２０℃、処理圧力１０〜２４ＭＰａ、処理時間３０〜１２０分に設定できる。好ましい処理条件は、亜臨界水処理の具体的方法によっても異なり、使用するコラーゲン成分含有原料の種類や状態によっても異なる。例えば、コラーゲン成分含有原料として水溶性コラーゲンを用いた場合、処理温度を２００±１０℃、処理時間を６０±３０分、処理圧力を１６±４ＭＰａに設定するのが、好ましい条件となる。

＜亜臨界水処理の装置および方法＞
基本的には、通常の亜臨界水処理において利用されている処理装置および処理技術が適用できる。亜臨界水を生成する高温および高圧状態が作り出せ、コラーゲン成分含有原料に亜臨界水を作用させて所定の時間を維持できればよい。
例えば、コラーゲン成分含有原料と水とを収容し高圧環境で高温に加熱する装置や方法が採用できる。容器にコラーゲン成分含有原料と水を密閉封入して高温に加熱すれば加熱に伴って容器内に加圧状態を作り出すことができる。水溶性コラーゲンの水溶液が収容された耐圧容器を、容器の外部から加熱すれば、容器内を、所定の温度、圧力に維持することができる。加熱炉などで水を加熱して高温高圧の亜臨界状態の水を生成させ、生成した亜臨界水を、別の処理室や処理容器に収容されたコラーゲン成分含有原料と接触させる装置あるいは方法も採用できる。これらの処理方法は、バッチ処理で行なえる。亜臨界水と液状のコラーゲン成分含有原料とを反応管や反応室に連続的に供給して接触させれば、亜臨界水処理を連続的に行なう連続処理も可能である。

〔コラーゲンペプチド含有化粧料組成物〕
コラーゲン成分含有原料に亜臨界水処理を行なって得られたコラーゲンペプチド含有化粧料組成物は、通常のコラーゲンペプチドと同様にして、各種化粧品の製造に供給することができる。
化粧品の製造に供給する前に、通常のコラーゲンペプチド含有化粧料組成物の製造技術において採用されている各種の処理を施すこともできる。具体的には、濾過処理、濃縮処理、活性炭などによる脱臭処理や脱色処理を含む精製処理などが挙げられる。
コラーゲンペプチド含有化粧料組成物は、水溶液の状態で供給することもできるし、乾燥処理を行って粉体などの固体の形態で供給することもできる。

〔化粧品〕
コラーゲンペプチド含有化粧料組成物は、その活性機能や化粧料としての機能が発揮できる各種の化粧品に配合して使用することができる。
特に、皮膚用の化粧品に有効である。例えば、美容液、コールドクリームや乳液、化粧水などの肌に付ける基礎化粧品のほか、口紅などの皮膚用化粧品、整髪料などの髪用化粧品、洗顔料、アフターシェーブローション、その他、皮膚と接触する形態で使用される化粧品に有効である。
コラーゲンペプチド含有化粧料組成物とともに化粧品に配合する成分は、特に限定されず、通常の化粧品と同様の成分を組み合わせることができる。例えば、ペプチドよりも分子量が大きな水溶性コラーゲンやゼラチン、コラーゲンなどを組み合わせることができる。複数のコラーゲン成分を組み合わせることで、コラーゲンペプチドだけでは得られない機能や特性を発揮できる場合がある。

その他の配合成分としては、使用目的や要求機能によって任意に設計することができる。例えば、ヒアルロン酸などのムコ多糖類やその塩などを配合することで、コラーゲンペプチド組成物による保湿機能などをより高めることができる。その他、一般的な化粧料の添加材料として、各種油脂類やアルコール類、植物生薬類、動物性成分、顔料、紫外線吸収／遮断剤、香料、安定剤などが挙げられる。
化粧品の具体的処方は、通常のコラーゲン利用化粧品と共通する技術が適用できる。各種文献に記載された化粧品処方において、そこで使用されているコラーゲンあるいはコラーゲンペプチドの代わりに、本発明のコラーゲンペプチド含有化粧料組成物を使用することができる。具体例として、特開２００３−３２７５９９号公報に開示された化粧品処方を適用することができる。

狭義の化粧品には含まれないが、皮膚用軟膏やクリーム、皮膚創傷回復塗剤などの医薬部外品あるいは医薬品において、皮膚の保護や再生、回復を図る有効成分として、コラーゲンペプチド含有化粧料組成物を配合しておくことができる。

本発明にかかるコラーゲンペプチド含有化粧料組成物は、コラーゲン成分含有原料を亜臨界水処理して得られた特定の分子量条件を有するコラーゲンペプチドを化粧有効成分として含有することで、コラーゲンペプチドの優れた活性機能を有効に発揮させることができる。
特に、チロシナーゼ阻害活性、メラニン合成阻害活性、・ＯＨ消去能活性、ＳＯＤ様活性、コラーゲン合成促進活性などの何れに対しても高い機能を発揮する。皮膚用の化粧品に配合したときに、肌の美白効果、保湿効果、抗老化効果などを大幅に向上させることができる。

亜臨界水処理は、酵素処理などに比べて、簡単に短時間で効率的に目的のコラーゲンペプチド含有化粧料組成物が得られるので、生産能率を向上させ、製造コストを削減することが可能になる。

〔亜臨界水処理装置〕
図１〜３は、それぞれ構造の異なる亜臨界水処理装置を示している。何れの処理装置も、コラーゲンペプチド含有化粧料組成物の製造に利用できる。
＜原料液の間接加熱＞
図１に示すように、処理室１０の内部に、バイアルとも呼ばれる比較的に小さな耐圧容器１２に収容された原料液１４を配置する。原料液１４は、コラーゲン成分含有原料の水溶液または水分散液である。
処理室１０には、高温蒸気などの加熱媒体１６が導入される。加熱媒体１６は、耐圧容器１２を介して、内部の原料液１４を加熱する。原料液１４に含まれる水が沸騰し膨張することによって内部の圧力が上昇する。その結果、水は亜臨界状態になって原料液１４に含まれるコラーゲン成分含有原料に分解作用を及ぼし、コラーゲンペプチドが生成する。

耐圧容器１２の内部圧力および内部温度が所定の亜臨界条件を満足するように、処理室１０への加熱媒体の供給を調整する。耐圧容器１２の内部が亜臨界状態で所定の時間を経過すれば、処理室１０への加熱媒体の供給を停止し、必要に応じて冷却したあと、処理室１０から耐圧容器１２を取りだし、耐圧容器１２から、コラーゲンペプチドが生成した原料液１４を取り出す。この段階では、原料液１４に含まれる水は、亜臨界状態ではなく通常の液体状の水に戻っている。
原料液１４から、必要に応じて、目的のコラーゲンペプチドだけを分離したり、原料に含まれていた不要物を除去したり、色や臭いを除去したりすることで、コラーゲンペプチド含有化粧料組成物が得られる。

＜原料液と亜臨界水との接触＞
図２に示すように、処理室２０に、別の装置で所定の温度および圧力条件を加えて生成された亜臨界水２２と、別に用意された原料液２４とを、別々に供給する。処理室２０は、耐圧性のある管材などからなる反応管が使用され、亜臨界水２２の供給配管と原料液２４の供給配管とが配管接続されていればよい。スタティックミキサーなどの、亜臨界水２２と原料液２４との混合および均一化を促進する機構を備えていてもよい。
処理室２０の内部で、亜臨界水２２と原料液２４とが混合され、原料液２４に含まれるコラーゲン成分含有原料が亜臨界水２２と接触して分解処理され、処理室２０の末端からコラーゲンペプチド含有液２６が取り出される。

処理室２０は一定の長さを有するので、亜臨界水２２と原料液２４が混合され末端から取り出されるまでの移動時間が、処理時間となる。亜臨界水２２および原料液２４の供給量や処理室２０の長さを調整することで、処理時間を変更することができる。
＜固体原料と亜臨界水との接触＞
図３に示すように、密閉状態の処理室３０に、粒塊状など固体のコラーゲン成分含有原料３２を収容しておく。この処理室３０に、前記同様に別の装置で生成された亜臨界水３４を供給する。処理室３０の内部で、亜臨界水３４と原料３２とが接触して、コラーゲンが分解され、コラーゲンペプチドが生成する。原料３２のコラーゲンが分解されたコラーゲンペプチドと亜臨界水３４との混合液であるコラーゲンペプチド含有液３６が取り出される。

具体的に、コラーゲン成分含有原料を亜臨界水処理してコラーゲンペプチド含有化粧料組成物を製造し、その特性や性能を評価した。
〔実施例１〕
＜コラーゲン成分含有原料の製造＞
製造原料として、湿重量１０ｋｇの新鮮な鯛の鱗を用いた。鯛鱗１０ｋｇを常法により脱脂および脱灰した。脱脂・脱灰処理を終えた乾燥重量２ｋｇの原料を、ｐＨ２．２の塩酸溶液１００Ｌに３時間浸漬し、膨潤させた。膨潤した原料を、高速ホモジナイザーを用いて、７０００ｒｐｍ×６０分間の処理条件で破砕したあと、酵素ペプシン（天野エンザイム社製）２０ｇを加え、撹拌機で撹拌しながら、２４時間、酵素反応を行なわせて、第１段階の酵素処理を終えた。この酵素処理で得られた溶液に、６０００ｒｐｍ×２Ｌ／分の処理条件で連続遠心処理を行なった。遠心処理のあと、可溶性コラーゲンが含まれる上澄液を回収した。回収された上澄液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７．４に調整した。さらに、６０００ｒｐｍ×２Ｌ／分の処理条件による遠心処理操作を３回繰り返した。その結果、精製コラーゲン繊維１．３８ｋｇが得られた。収率６９．０％であった。

得られた精製コラーゲン繊維を用いて濃度０．６％の水溶液を調製した。
＜亜臨界水処理＞
亜臨界水処理装置として、図１に示す構造を備えた高温高圧処理装置（日阪製作所社製、高熱湿熱処理装置）を用いた。
耐圧性のあるバイアル容器に、前項で得られた水溶液状のコラーゲン成分含有原料を収容して蓋を閉め、密封状態にした。このバイアル容器を、高温高圧処理装置の処理室に配置し、処理室に加熱蒸気を供給することで、バイアル容器の内部を間接的に加熱し、温度１８０℃、圧力１０ＭＰａの亜臨界状態に６０分間維持した。なお、亜臨界状態にするまでの予備加熱に３０分かけた。バイアル容器の内部においては、生成された亜臨界水がコラーゲン成分含有原料と接触することで、亜臨界水処理が行なわれ、コラーゲンペプチドが生成した。

処理室の加熱を停止し、バイアル容器を冷却し、内部で生成したコラーゲンペプチドを含む水溶液を回収した。この段階では、亜臨界水は通常の液体状の水に戻っている。
〔実施例２〕
実施例１において、亜臨界水処理の処理条件を、温度２００℃、圧力１５．９ＭＰａに変更した以外は、実施例１と同様の処理工程を経て、コラーゲンペプチドの水溶液を得た。
〔実施例３〕
実施例１において、亜臨界水処理の処理条件を、温度２２０℃、圧力２３．７ＭＰａに変更した以外は、実施例１と同様の処理工程を経て、コラーゲンペプチドの水溶液を得た。

〔実施例４〕
実施例２において、亜臨界水処理の処理条件を、処理時間１２０分に変更した以外は、実施例２と同様の処理工程を経て、コラーゲンペプチドの水溶液を得た。
〔参考例１〕
実施例２において、亜臨界水処理の処理条件を、処理時間１０分に変更した以外は、実施例２と同様の処理工程を経て、コラーゲンペプチドの水溶液を得た。
〔比較例１〕
従来、美白効果や保湿効果に優れる化粧料組成物として知られている豚プラセンタを製造した。

具体的には、豚の胎盤４０ｇを常法により脱脂・脱灰した。包丁などを用いて予備的に細断したあと、等量の水を加えて、細断装置により更に細かく細断した。得られた細断原料の分散液に酢酸を加えて、ｐＨ５．０に調整した。ｐＨ調整された原料分散液に対し、８０℃で２時間かけて加熱抽出処理を行った。処理後に得られた抽出液を、水酸化ナトリウムを加えてｐＨ６．９に調整した。ｐＨ調整された抽出液を、段階濾過した。最終的に濾過寸法０．４５μｍで濾過して、濾過液に含まれる胎盤抽出組成物４５ｍｌ（固形分２．５％）を得た。
豚プラセンタは、豚の出産時に排出されるプラセンタ（胎盤）からの抽出物であり、様々な成分が複合されているものと推測される。コラーゲンペプチドも含まれている可能性があるが、主要な成分ではない。

〔比較例２〕
実施例１と同じ鯛鱗を製造原料にし、アルカリ処理および酵素処理によって、コラーゲンペプチド組成物を得た。亜臨界水処理は行なわない。
実施例１と同じ脱脂・脱灰処理で得られた乾燥重量３．２ｋｇの原料を、２０％硫酸ナトリウムを含む１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０Ｌに浸漬し、２０℃で１０日間保持して、アルカリ処理を行った。アルカリ処理を終えた原料を精製水約１００Ｌで水洗して、アルカリ分を除去した。
アルカリ処理済の原料を、裁断機で１ｃｍ以下に粉砕したあと、湿重量の２倍の精製水を加えた。さらに、酵素パパイン（天野エンザイム社製）２０ｇを加え、５０℃に保温し、撹拌機で撹拌しながら、２４時間かけて酵素反応を行なわせ、コラーゲンを分解させてコラーゲンペプチドを得た。酵素反応が十分に行なわれたあと、８０℃で６０分間維持して、酵素を失活させた。

得られたコラーゲンペプチドを含む水溶液を、活性炭処理したあと、濾紙による濾過処理を行って、活性炭を除去した。その結果、コラーゲンペプチド溶液４０Ｌ（濃度７．１％）が得られた。
〔比較例３〕
実施例１で得られた濃度０．６％の精製コラーゲン繊維を含む水溶性コラーゲン溶液に、さらに酵素プロテアーゼによる酵素処理を行って、コラーゲンペプチド組成物を得た。
具体的には、水溶性コラーゲン溶液にプロテアーゼ２０ｇを加え、５０℃で３時間かけて酵素反応を行なわせて、コラーゲンペプチド含有溶液を得た。

得られたコラーゲンペプチド含有溶液には、コラーゲンペプチドとして、平均分子量９００のペプチドが６０％以上含まれていた。
〔評価試験〕
基本的には、当該技術分野において一般的に知られている測定装置や測定方法、手順を採用した。以下に説明する試験方法とは異なっていても、同等の評価ができる試験技術であれば採用することが可能である。
＜分子量分布＞
各実施例で得られたコラーゲンペプチド含有液に対して、ＨＰＬＣによる分子量分布および平均分子量の測定を行った。

ＨＰＬＣの測定条件は、カラム：トーソー社製ＴｓｋＧＥＬ、Ｇ２５００ＰＷＸＬ（カラム温度２５℃）、溶離液：４５％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）、流速０．５ｍＬ／min、検出器：ＵＶ２１８ｎｍであった。
平均分子量の測定は、トーソー社製、ＧＰＣ−８０２０を用いた。
＜活性機能評価試験＞
（チロシナーゼ阻害活性）
メラニン合成過程に関与するチロシナーゼの活性に対する阻害機能を評価する。
測定試料１ｍｌを試験管にとり、３ｍＭＬ−ＤＯＰＡ（０．２Ｍリン酸バッファー：ｐＨ６．５にて溶解）１ｍｌと０．２Ｍリン酸バッファー０．５ｍｌとを加え、撹拌したあと、３７℃で２０分間、加温する。

これとは別に、チロシナーゼ（マッシュルーム由来）を０．２Ｍリン酸バッファーにて３００units／ｍｌに混合して、３７℃で２０分間、加温する。このチロシナーゼ溶液０．５ｍｌを、前記測定試料溶液に添加し、撹拌したあと、カイネティックソフトを使用して、吸光値を直ちに測定する。測定条件は、測定波長４７５ｎｍ、計算区間０〜１５秒である。コントロールとして、測定試料の代わりに０．２Ｍリン酸バッファーを加えて、同様の測定を行なう。
チロシナーゼ阻害活性率を、下式で算出する。
チロシナーゼ阻害活性率（％）＝
〔１−測定試料の初速度（OD/min）／コントロールの初速度（OD/min）〕×１００
その結果から、測定試料の固形分換算で、チロシナーゼの活性を５０％阻害するのに必要な濃度〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕を算出する。

（メラニン合成阻害活性）
６ウェルプレートに、メラニン産生を行なうマウス由来のB16melanoma細胞を、１×１０^５cells／ｍｌの濃度で３ｍｌ撒き、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１日培養した。培地を除去したあと、０．２μｍフィルターで濾過滅菌した測定試料を終濃度６、２４、５０μｇ／ｍｌで含む培地を加えて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で３日培養する。培地を除去したあと、ＥＧＴＡ−トリプシン溶液（ＰＢＳ）で細胞を剥がし、１．５ｍｌマイクロテストチューブに細胞を集め、１２０００ｒｐｍで２〜５分間、遠心分離処理を行なう。上清を除去し、１Ｎ水酸化ナトリウムを１ｍｌ加え、１００℃で２〜３時間加熱処理して、メラニン色素を抽出する。分光光度計でメラニン色素の測定を行なう（４０５ｎｍ）。コントロールとして、測定試料を含まない培地だけで同様の培養を行なう。細胞のタンパク濃度を、〔DC-Protein Assay（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）〕で測定する。

メラニン合成阻害率を、総タンパク量当たりのメラニン量から、下式で算出する。
メラニン合成阻害率（％）＝
〔１−メラニン量（測定試料）／メラニン量（コントロール）〕×１００
このメラニン合成阻害率から、測定試料の固形分換算で、メラニンの合成を５０％阻害するのに必要な濃度〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕を算出する。
（・ＯＨ消去能活性）
１５０ｍＭ−ＮａＣｌを０．５ｍｌ、および、５ｍＭデオキシリボースを０．２ｍｌに、測定試料０．１５ｍｌを加えて撹拌する。ここに、２ｍＭ硫酸アンモニウム鉄（II）を加え、続いて、０．０３％Ｈ_２Ｏ_２を０．０５ｍｌ加える。さらに、１％チオバルビツール酸を０．５ｍｌ加え、２．８％トリクロロ酢酸を０．５ｍｌ加えて撹拌する。ついで、水浴にて１００℃で１５分間加熱したあと、直後に氷冷し、分光光度計（５３５ｎｍ）で測定する。コントロールとして、測定試料の代わりに蒸留水を加えて、同様の測定を行なう。

下式で、・ＯＨ消去率（％）を算出する。
・ＯＨ消去率（％）＝
〔１−ＯＤ５３５ｎｍ（測定試料）／ＯＤ５３５ｎｍ（コントロール）〕×１００
この・ＯＨ消去率から、測定試料の固形分換算で、・ＯＨの活性を５０％阻害するのに必要な濃度〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕を算出する。
（ＳＯＤ様活性）
同仁化学研究所社製〔SOD Assay Kit-WST〕を用い、９６ウェルプレートにて測定する。試薬は、キット付属のものを用いる。各ウェルに、試料液を２０μｌずつ加えたあと、〔WST working solution〕を２００μｌずつ加え、プレートミキサーでよく撹拌する。ブランクのウェルには、〔Dilution buffer〕を２０μｌずつ加える。試料液を入れたウェルとブランクのウェルとにそれぞれ、〔Enzyme working solution〕を２０μｌずつ加える。その後、３７℃で２０分間インキュベートし、プレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光値を測定する。

下式により、スーパーオキシドの阻害率を算出する。
スーパーオキシド阻害率（％）
＝〔｛（Ｅ[BL]−Ｅ[BL-BL]）−（Ｅ[S]−Ｅ[S-BL]）｝
／（Ｅ[BL]−Ｅ[BL-BL]）〕×１００
上式の各記号は、以下の測定条件で測定された吸光値である。

測定試料のスーパーオキシド阻害率（％）と、あらかじめ求められたＳＯＤ（unit)のスーパーオキシド阻害率（％）による検量線とから、測定試料の固形分換算で、測定試料と同等の活性機能を示すＳＯＤ単位の量すなわちＳＯＤ様活性値〔ＳＯＤunits／ｇ〕を算出する。
（コラーゲン合成促進活性）
測定試料の調製：
(1) ６ウェルプレートにヒト正常皮膚繊維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢを５×１０^４cells/wellの濃度でまき、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で１日培養を行なう。

(2) 培地を捨て、５０μｇ／ｍｌの測定試料を含むＭＥＭ培地を加えて試験検体を得る。対照検体として、１μＭのアスコルビン酸を含むものを用意する。
(3) 試験検体および対照検体を、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で３日培養する。
(4) 各検体の上清を測定試料とする。
(5) TaKaRa社製の〔Cell CountingKit〕を用いて、デッシュ内の細胞数をカウントする。
測定：
測定装置〔Procollagen type I C-peptide(PIP)E1A Kit(TaKaRa社製）〕を用いる。

(1) それぞれの測定試料を適宜に希釈する。
(2) 標準抗体液を、付属の９６ウェルプレートにそれぞれ１００μｌずつ分注する。
(3) ＰＩＰ標準液をとり、試料を２０μｌずつ添加する。
(4) ３７℃で３時間反応させる。
(5) 反応液を捨て、ＰＢＳで４回洗浄したあと、基質液（ＴＭＢＺ）を１００μｌずつ添加し、室温で１５分間反応させる。
(6) 停止液を１００μｌずつ、基質液を加えた順に添加し、反応を停止させる。
(7) マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光値を測定する。

(8) ＰＩＰ濃度と吸光値とから検量線を作成する。
計算：
細胞当たりのＰＩＰ量を、下式で算出する。
ＰＩＰ（ｎｇ／cells）＝ＰＩＰ（ｎｇ／ｍｌ）／細胞数（cells／ｍｌ）
測定試料のＰＩＰ値を、測定試料を添加しないブランクのＰＩＰ値で割って、ブランクに対するコラーゲン合成促進活性の倍率を算出する。この値は、測定試料を終濃度５０μｇ／ｍｌで添加したときのコラーゲン合成促進活性を、ブランクに対する倍率で表したものである。

＜色および臭い＞
コラーゲンペプチド溶液を、目視観察して、色と臭いを以下の基準で評価した。
色〔透明：○、少し黄色に着色：△、黄色が目立つ：×〕
臭い〔無臭：○、少し臭う：△、臭いが強い：×〕
〔試験結果〕
試験結果を下表に示す。

＜評価＞
(1) 活性機能試験：
亜臨界水処理で得られた実施例１〜４、参考例１のペプチドコラーゲン組成物は何れも、従来技術で得られた比較例１〜３に対して、チロシナーゼ阻害活性は明らかに向上しており、メラニン合成阻害活性は同等であるかかなり向上している。・ＯＨ消去能活性は、少し劣るもの（参考例１）から顕著に優れているもの（実施例３）まである。ＳＯＤ様活性は、格段に向上している。コラーゲン合成促進活性は、少し劣るもの（参考例１）から同等程度のもの（実施例３）まである。色および臭いは、ほぼ同等である。

総合的に評価すれば、各実施例の技術は、比較例の技術に比べて、化粧料組成物として、同等以上の優れた活性機能を発揮できることが裏付けられた。
しかも、比較例では、胎盤など非常に高価で入手が難しい原料を使用しなければならなかったり、酵素処理などに長い時間がかかったりするのに対し、実施例では特別な原料を使用しなくても比較的に短い時間で十分に性能の高い化粧料組成物が得られる。工業的生産性あるいは商品価値の上では、はるかに優れたものとなる。
(2) 色および臭い：
既に化粧料組成物として知られている各比較例と同様に、各実施例のペプチドコラーゲン組成物も、化粧料組成物として十分に実用的に使用できる特性を有することが判る。

なお、化粧品の用途や他の成分との組み合わせによっては、わずかな色や臭いは問題なく使用できる場合がある。
(3) 亜臨界水処理の処理条件：
実施例１〜４、参考例１における処理条件の違いと性能とを対比すると、以下の評価ができる。
実施例２（温度２００℃、圧力１５．９ＭＰａ、時間６０分）が、総合的に最も活性機能が高くなっている。各比較例と比べても、明確に優れた性能を発揮できる。その他の実施例と比べると、実施例２の処理条件を中心にして一定の範囲内であれば、十分に良好な性能が発揮できることが判る。

実施例１は、実施例２よりも少し活性機能が劣る項目もあるが、温度および圧力が低く設定できるので、作業性や経済性の点では優れている。工業的生産や商品性の点では、実施例１の処理条件のほうが好適な場合もある。
処理時間の短い参考例１でも、比較例に比べて優れた性能が発揮できる項目がかなりある。比較例に対して、参考例１は格段に生産性が向上することから、十分に産業上の利点がある。
化粧品の種類や用途によって、何れの活性機能が特に必要とされるのかが判れば、それに合わせて、亜臨界水処理の処理条件を適切に設定することで、商品価値の高い化粧料組成物を経済的に提供することが可能になる。

〔化粧品の実証試験〕
前記実施例および比較例のコラーゲンペプチド含有液を用いて、具体的な化粧品を製造し、その性能を実証した。
＜化粧品の製造＞
以下の配合で化粧品（美容液）を製造した。
グリセリン１０容量％、ショ糖脂肪酸エステル１．３容量％、カルボキシビルニポリマー水溶液（濃度１重量％）１７．５容量％、アルギン酸ナトリウム水溶液（濃度１重量％）１５．０容量％、モノラウリン酸ポリグルセリル１．０容量％、マカダミアンナッツ油脂肪酸フィトステリル３．０容量％、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸２．０容量％、硬化パーム油２．０容量％、スクワラン１．０容量％、ベヘニルアルコール０．８容量％、ミツロウ１．０容量％、ホホバ油１．０容量％、１，３−ブチレングリコール１０．０容量％、Ｌ−アルギニン水溶液（濃度１０重量％）２．０容量％、コラーゲンペプチド含有液（濃度１重量％）２０容量％、精製水：残部。

コラーゲンペプチド含有液は、各実施例および比較例で得られたものを用いた。無添加区として、コラーゲンペプチド含有液を配合しないものも製造した。
＜化粧品の官能試験＞
製造された化粧品（美容液）の官能試験を、モニター（年齢２０〜５０代の女性各１０名）によって実施し、美白効果、保湿効果、抗老化効果について評価した。抗老化効果の指標として、シワ、ハリ、タルミの改善を評価した。モニターは、２ヶ月間にわたって、毎日、朝と夜との２回、洗顔後に美容液を適量で顔に塗り、以下の基準で判定した。
有効：使用前に比べて改善効果が認められた。

やや有効：使用前に比べて改善効果がやや認められた。
無効：使用前に比べて変化なし。
試験の結果を、下表に示す。

＜評価＞
(1) 各実施例の化粧料組成物が配合された化粧品は、各比較例に比べて、何れの項目においても優れた評価を得ている。
なお、実施例２は比較例１（豚プラセンタ）に比べて、美白効果や保湿機能の点では少し劣るが、シワ、ハリ、タルミの防止機能の点では、格段に優れた評価を得ている。総合的にみれば、はるかに優れた機能を発揮している。この結果は、前記した各活性機能の測定結果とも良く整合している。実施例２の化粧料組成物に、保湿機能などに優れた別の配合成分（例えば、コラーゲン）を組み合わせれば、総合的に極めて高い性能の化粧料組成物が容易に得られることになる。

(2) 実施例２、４以外の実施例については試験を省略したが、前記活性機能試験の結果を参酌すれば、実施例２、４と同等か少し劣る程度の性能が発揮できることは、容易に予測できる。

本発明で得られたコラーゲンペプチド含有化粧料組成物は、例えば、皮膚用の化粧品に配合することで、皮膚に対する種々の活性機能を有効に発揮させることができ、美白効果、抗老化効果、保湿効果、シミなどの改善効果などの点で総合的に優れた性能を有する化粧品を経済的に提供することができる。

本発明の実施形態を表す亜臨界水処理装置の概略構造図別の亜臨界水処理装置の概略構造図別の亜臨界水処理装置の概略構造図

符号の説明

１０、２０、３０処理室
１２耐圧容器
１４、２２原料液
１６加熱媒体
２４、３４亜臨界水
２６、３６コラーゲンペプチド含有液
３２原料（固体）

Claims

コラーゲン成分含有原料を処理温度１８０〜２２０℃、処理圧力１０〜２４ＭＰａ、処理時間３０〜１２０分の処理条件で亜臨界水処理して得られた平均分子量２００〜１５００のコラーゲンペプチドを化粧有効成分として含有し、チロシナーゼ阻害活性が固形分換算で０．００１〜１０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕であり、メラニン合成阻害活性が固形分換算で０．００１〜０．２０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕であり、・ＯＨ消去能活性が固形分換算で０．００１〜２．０〔ＩＣ５０（ｍｇ／ｍｌ）〕であり、ＳＯＤ様活性が固形分換算で１５００〜１００００〔ＳＯＤunits／ｇ〕であり、コラーゲン合成促進活性が２〜４倍（終濃度５０μｇ／ｍｌ添加、対ブランク）である、コラーゲンペプチド含有化粧料組成物。
前記処理温度が２００±１０℃であり、前記処理時間が６０±３０分であり、前記処理圧力が１６±４ＭＰａである、請求項１に記載のコラーゲンペプチド含有化粧料組成物。
前記コラーゲンペプチドが、分子量２００以上、１５００未満のペプチドを７０〜１００重量％と、分子量２００未満のペプチドを３０重量％未満と、分子量１５００以上のペプチドを３０重量％未満とからなる、請求項１または２に記載のコラーゲンペプチド含有化粧料組成物。
請求項１から３までのいずれかに記載のコラーゲンペプチド含有化粧料組成物を製造する方法であって、コラーゲン成分含有原料に、処理温度１８０〜２２０℃、処理圧力１０〜２４ＭＰａ、処理時間３０〜１２０分の亜臨界水処理を行なって、コラーゲンペプチド含有化粧料組成物を抽出する、コラーゲンペプチド含有化粧料組成物の製造方法。
前記処理温度が２００±１０℃であり、前記処理時間が６０±３０分であり、前記処理圧力が１６±４ＭＰａである、請求項４に記載のコラーゲンペプチド含有化粧料組成物の製造方法。
前記亜臨界水処理として、前記コラーゲン成分含有原料が収容された耐圧容器を、容器の外部から加熱して、容器内を前記処理温度、前記処理圧力に前記処理時間維持する、請求項４または５に記載のコラーゲンペプチド含有化粧料組成物の製造方法。