JP5375609B2 - バイオセンサ - Google Patents

Description

本発明は、細胞電気生理センサ等のバイオセンサに関するものである。

近年、MEMS（Micro Electro Mechanical Systems）技術を応用した微小なバイオセンサが注目されている。バイオセンサとしては、例えば細胞電気生理センサがある。この細胞電気生理センサは、細胞の電気的活動を指標にして細胞膜に存在するイオンチャネルの機能を解明したり、薬品をスクリーニング（検査）したりするパッチクランプ法の自動化システムである。

図１４を用いて、特許文献１に記載された従来のバイオセンサ（細胞電気生理センサ）について説明する。図１４において、従来のバイオセンサ３１は、ダイアフラム３２と、このダイアフラム３２の上面に形成された凹部３３とを備えている。さらに、凹部３３の下部からダイアフラム３２の下面まで連結する貫通孔３４と、ダイアフラム３２の上方に配置された参照電極３５と、貫通孔３４の内部に配置された測定電極３６とを備えている。この測定電極３６は配線３７を経て信号検出部に連結されている。ダイアフラム３２はウエル３８の内部に配置されている。

バイオセンサ３１は、まず、ウエル３８の内部に細胞および電解液４０が注入され、細胞が凹部３３によってトラップ（捕捉）されて、貫通孔３４の開口部に保持される。この凹部３３に保持された細胞を、以下被検体細胞３９という。なお、この従来のバイオセンサ３１では、凹部３３や貫通孔３４が被検体細胞３９の保持部を構成する。

測定の際には、被検体細胞３９は貫通孔３４の下方から吸引ポンプなどで吸引され、貫通孔３４の開口部に密着した状態で保持される。すなわち、この貫通孔３４がガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たしている。そして、被検体細胞３９のイオンチャネルの機能性や薬理反応などは、参照電極３５と測定電極３６との間における反応前後の電圧あるいは電流を測定し、細胞内外の電位差を求めることによって分析している。

しかしながら、このような従来のバイオセンサ３１は、参照電極３５と測定電極３６との間における電位差の測定値に誤差が生じ、バイオセンサ３１の測定に対する信頼性が低下するという問題があった。

その理由は、被検体細胞３９の保持部の周辺に気泡が存在するからである。すなわち気泡の抵抗値は非常に大きい為、この気泡の有無によって測定値が変動し、結果としてバイオセンサ３１の測定に対する信頼性が低下するのである。

国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット

本発明は、測定誤差を低減し、測定に対する信頼性を向上させたバイオセンサを提供するものである。

本発明のバイオセンサは、被検体保持部を有したダイアフラムと、ダイアフラムを支持するとともにキャビティを有したフレームと、フレームの内壁面側であってダイアフラム表面に形成されたピラーとを備えたものである。

この構成によれば、被検体保持部周辺における気泡の発生を抑制するとともに、残留した気泡を効率良く除去することができるので、バイオセンサの測定上の信頼性を向上させることが出来る。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図 同細胞電気生理センサの上面図 図２の３−３線における断面図 同実施の形態の細胞電気生理センサを用いた細胞電位測定装置の断面図 本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図 本発明の実施の形態３における細胞電気生理センサの断面図 本発明の実施の形態４における細胞電気生理センサの斜視図 同細胞電気生理センサの断面図 同実施の形態の細胞電気生理センサを用いた細胞電位測定装置の断面図 本発明の実施の形態５における細胞電気生理センサの断面図 本発明の実施の形態６における細胞電気生理センサの断面図 本発明の実施の形態７における細胞電気生理センサの上面図 本発明の実施の形態８における細胞電気生理センサの断面図 従来の細胞外電位測定センサの断面図

以下、本発明のバイオセンサについて、細胞電気生理センサを例に挙げて図面を参照しながら詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図であり、図２は図１の上面図である。図３は、図２の３−３線における断面図である。図４は、細胞の電気生理現象を測定する方法を説明するための細胞電位測定装置の断面図である。

まず、本実施の形態の細胞電気生理センサの構造について説明する。図１〜図３において、本実施の形態における細胞電気生理センサ２０は、少なくとも一つの貫通孔１を有する薄板状のダイアフラム２と、ダイアフラム２を固定支持するとともに測定装置などへの固定配置を容易にするためのフレーム３を有している。貫通孔１は、被検体である細胞を捕捉し保持するためのものであり、被検体保持部として機能する。

なお、貫通孔１は少なくとも一つあれば良く、複数の細胞９（図４参照）を同時に測定したいときには、複数の貫通孔１を形成することも可能である。これによって、複数の細胞９を同時に測定し、Ｓ／Ｎ比を高めることができる。

フレーム３の内部には、細胞などを含んだ液体などを貯留することができるキャビティ４が形成されている。また、フレーム３の内壁面３ａに接するように、ダイアフラム２表面には断面円形状のピラー６がフレーム３と一体的に設けられている。フレーム３の内壁面３ａとピラーの外壁面６ａとで鋭角を形成し、凹部７を形成している。

このフレーム３の内壁面３ａとピラーの外壁面６ａとで形成した凹部７を設けた構成とすることによって、後述するように、従来のように分注器などを用いて液滴状の液体をキャビティ４の内部へ注入したときの気泡の発生の抑制と残留した気泡の除去を効率よく行うことができる。このとき、ピラー６の断面形状を円あるいは楕円形状とすることによって容易にピラーの外壁面６ａとフレームの内壁面３ａとで鋭角を成す凹部７を形成することができる。

また、ピラー６の高さとフレーム３の端面５の高さを同じ高さとすることによって、加工性と取り扱いが容易な細胞電気生理センサとすることができる。

また、ダイアフラム２の厚みは１０〜３００μｍとすることが加工性、機械的強度等の観点から好ましく、キャビティ４の内径は１００μｍ〜１．０ｍｍとすることが生産性の観点から好ましい。キャビティ４の内径が１００μｍより小さくなると細胞の分注などが困難となるとともに、気泡の残留が多く発生するようになる。また、キャビティ４の内径が１ｍｍを越えるとセンサの生産性が低下するとともに、少量の細胞９を含んだ液体等の測定の場合、底面が広すぎて細胞９が貫通孔１に捕捉される確率が低くなり、好ましくない。

本実施の形態では、シリコンなどの入手性、加工性に優れたウエハーを準備し、フォトリソ技術を用いた一般的なエッチング加工などによって、複数個の細胞電気生理センサ２０を一括して作製している。これによって、高寸法精度で微小な形状を有する細胞電気生理センサを効率よく作製することができる。

すなわち、本実施の形態のダイアフラム２、フレーム３、ピラー６は単結晶シリコン基板をドライエッチングによって一体成形したものである。これによりピラー６はフレームの内壁面３ａと一体化されるため、微細なピラー６を安定して形成することができる。

また本実施の形態では、被検体保持部が貫通孔１であるため、この貫通孔１もドライエッチング工程で形成できる。したがって、貫通孔１、ダイアフラム２、フレーム３、ピラー６を同一工程で形成することができ、生産性に優れる。

なお、本実施の形態では、単結晶シリコン基板を用いたが、ＳｉＯ_２層の上下をそれぞれシリコン層で挟みこんだ、いわゆるＳＯＩ（Silicon on Insulator）基板を用いても良い。この場合は、ＳｉＯ_２層が露出するまで一方のシリコン層をエッチングしてフレーム３を構成し、ＳｉＯ_２層と他方のシリコン層との積層体をダイアフラム２として用いることができる。そしてＳｉＯ_２層の表面に貫通孔１の開口部を形成すれば、親水性の高いＳｉＯ_２層の表面が細胞保持面となり、細胞を密着して保持することができる。

上記の構成からなる本実施の形態の細胞電気生理センサ２０を用いた、細胞の電気生理活動を測定する細胞電位測定装置の構成について説明する。

図４は本実施の形態の細胞電気生理センサ２０を用いた細胞電位測定装置を示す要部断面図である。

図４において、プラスチックなどの絶縁体からなる容器１７には、容器１７内を、細胞外液１０が供給される上部と細胞内液１１が供給される下部とに仕切る仕切り板１４が設置されている。仕切り板１４には、マトリックス状に複数の開口部１４ａが形成されており、各開口部１４ａ内部には上記で説明した細胞電気生理センサ２０がセットされている。仕切り板１４の上層部には、各開口部１４ａに対応して、液体を貯留するためのウエル１５ａをウエル層１５設けている。

仕切り板１４とウエル層１５は樹脂などで構成することが生産性、加工性および寸法精度などの観点から好ましい。

細胞電気生理センサ２０は、開口部１４ａの内部に、ダイアフラム２を下面側として、開口部１４ａに液漏れが発生しないように隙間無く接合している。これによって、容器１７の内部の空間は、ダイアフラム２および仕切り板１４を境に上下２つの領域に仕切られる。仕切り板１４によって仕切られた上下の領域内には、細胞外液１０または培養液などの液体と細胞内液１１または薬液などの液体とがそれぞれ貯留される。細胞外液１０として、細胞９などを含んだ液体が用いられる。吸引ポンプなどの吸引機構によって、仕切り板１４の下方から吸引して、細胞外液１０の中に浮遊している複数の細胞９の中から、貫通孔１を塞ぐように細胞９を固定して被検体細胞９ａとする。また、これによって、これらの被検体細胞９ａの上下の液体の移動は貫通孔１を介してのみ行われることになる。本実施の形態では、吸引機構による吸引力は、２ｋPa〜１０ｋPaが適切であったが、貫通孔１の長さによって異なる大きさに設定する。

また、本実施の形態の容器１７は、上記のように流路１６が形成されたプレート１７ａと、このプレート１７ａ上に接合された仕切り板１４と、この仕切り板１４上に接合されたウエル層１５の三層構造となっている。容器１７は、上記三つの部材を接着して形成してもよいし、射出成形などで一体成形してもよい。また例えば、ウエル層１５と仕切り板１４のみ一体成形で形成し、流路１６が形成されたプレート１７ａと接着させてもよい。

そしてこの流路１６の内部に、マイクロポンプなどの送液機構を用いて、細胞内液１１あるいは薬液などの液体を充填、除去する。

さらに、仕切り板１４の上側には細胞外液１０中に、銀、塩化銀などで構成した参照電極１２を配置している。仕切り板１４の下側には細胞内液１１中に、同じく銀、塩化銀などで構成した測定電極１３を配置している。

なお、これらの参照電極１２と測定電極１３が入れ替わっていても良い。また、参照電極１２および測定電極１３は、クロム、チタン、銅、金、白金、銀および塩化銀からなる材料から選択することも可能である。さらに、参照電極１２及び測定電極１３は針状の微小電極プローブを用いてもよい。

次に、以上の構成からなる細胞電位測定装置を用いて細胞電位を測定する方法について図４を用いて説明する。

まず、細胞９を分散させた液体である細胞外液１０を、例えば自動分注器などを用いてキャビティ４の中へ所定量注入する。通常、この場合、液体は表面張力によって球面状の外観形状を形成しており、その形状のままキャビティ４の中へ分注することになる。

このとき、安定に精度良く被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定するためには、ダイアフラム２上、特に貫通孔１の近傍に気泡の残留していない状態で液体を充填しておくことが重要である。

ここで、細胞電気生理センサ２０のフレーム３の端面５（図１参照）をピラー６のない円筒状の同一平面で構成した場合、すなわち凹部７を有しない構成の場合、分注器から分注されたマイクロピペットの先端にある液滴が、フレーム３の端面５を完全に塞いでしまうことがある。このことによって、キャビティ４の内部が気密状態となる。したがって、キャビティ４の内部に存在していた空気などの気体の抜け道が無くなり、測定時に気泡となって残存する。また、気体の抜け道が無くなることにより、液滴のキャビティ４への注入がスムーズに行われなくなる。

このように、気泡がダイアフラム２の表面上、特に被検体保持部である貫通孔１の近傍に残存していると、吸引機構を用いて貫通孔１の上方に固定させた被検体細胞９ａの電気化学的変化である電流あるいは電圧の微小変化を高精度に測定することが困難であった。

これに対して、本実施の形態によれば、図１に示すように、フレーム３の内壁面３ａに接するようにダイアフラム２表面にピラー６を設け、フレーム３の内壁面３ａとピラー６の外壁面６ａとで鋭角を形成する凹部７を形成している。このことによって、フレーム３の端面５に球面状の液滴が接触すると、液滴の表面張力によって、液滴の先端がピラー６の先端に触れる。これに伴って、液滴は、ピラーの外壁面６ａと凹部７を濡らしながら、キャビティ４の内部に細胞外液１０よりなる液体を、細胞９とともに気泡の発生しない状態で、速やかに充填することができる。そして、残留した気泡は凹部７から押出されるように上方から除去することができる。

これらの作用を有するピラー６の断面形状としては１００μｍ以上の直径を有していることが好ましい。１００μｍより細いと折れやすく、また表面積も小さいことから、液滴を効率よく充填することができないからである。１００μｍ以上より大きい直径は、キャビティ４の大きさにより制限される。また、このような作用を、より効果的とするためには、ピラー６は複数本形成することが好ましい。これによって、表面張力による液体の浸透をより効率的に行うことができるとともに、残留した気泡の除去を効率よく行うことができる。

さらに、貫通孔１を中心として放射状に均等に凹部７を複数本設けることによって、上記の作用をより高めることができる。すなわち、これによってマイクロピペットなどの分注器の先端が傾いたとき、あるいは液滴の形状の対称性が少なくなった場合であっても、確実に液滴の一部をピラー６の一部に接触させ、液滴の流れを凹部７へと誘導できる。このことから、凹部７を複数本設けることにより、確実にダイアフラム２の面上に設けたピラーの外壁面６ａおよび凹部７から細胞外液１０などの液体を、気泡の発生を抑制しながら充填することができる。

また、上記のような構造とすることによって、ピラー６が補強の梁としても作用することから、フレーム３の厚みを薄くすることが可能となり、小型の細胞電気生理センサ２０を実現することができる。

また、ピラーの外壁面６ａに親水性を付与することによって、ピラーの外壁面６ａと液体との濡れ性をさらに高め、速やかに液体をキャビティ４の内部へ充填することができる。これとともに、ダイアフラム２の面上に残留した気泡のより少ない状態で液体を充填することができる。

この場合、ピラーの外壁面６ａを親水性とするためには、表面に付着した炭素分子を除去した清浄な表面としておくことが好ましい。その後、速やかに純水を充填した容器の内部に保管しておくことによって、表面の清浄度を保持することができる。また、このときの親水性は接触角で１０°以下であることが好ましい。この接触角は測定対象の表面にイオン除去された純水の水滴を塗布して測定することができる。

さらに、親水性を高める別の手段として、ピラーの外壁面６ａの表面を二酸化珪素などの絶縁膜によって被覆しておくことも効果的である。

このように、本実施の形態の細胞電気生理センサによれば、フレームの内壁面３ａに接するようにピラー６を設けて、フレームの内壁面３ａとピラーの外壁面６ａとで鋭角を形成する凹部７を形成してある。これによって、ピラーの外壁面６ａと凹部７を濡らしながら、速やかに液体をキャビティ４の内部へ充填することができる。これとともに、キャビティ４の内部に残留していた空気などの気体を容易に外部へ放出することができる。したがって、ダイアフラム２の面上に気泡の無い状態で液体を充填することができる。

以上のようにして、本実施の形態によれば、図４に示したように、細胞電気生理センサ２０に気泡が残留しない状態で液体を充填することができる。

その後、吸引ポンプなどの吸引機構を用いて仕切り板１４の下側が低圧になるように仕切り板１４の上下間に所定の圧力差を発生させる。このとき、一個の細胞９が貫通孔１の開口部に引き寄せられて、貫通孔１の上にトラップされる。この貫通孔１の上にトラップされた細胞９を被検体細胞９ａとする。そして、この圧力差が維持されていると十分な密着性が確保されることとなり、細胞外液１０と流路１６の内部にある細胞内液１１との間で電気的抵抗値を持つようになる。

具体的には、例えば流路１６の一方を封止し、他方から減圧することで、細胞９は貫通孔１へ引き付けられ、ついにはこの貫通孔１を塞ぐことによって被検体細胞９ａがトラップされる。これにより、細胞外液１０を充填したキャビティ４と細胞内液１１などの液体を充填した流路１６との電気抵抗は十分に高くなる。

なお、充填する液体は特に限定するものではなく、細胞外液１０の他に、細胞９を培養する培養液あるいはその他の薬液などであっても良い。

次に、吸引機構による吸引力を制御することによって減圧を続け、被検体細胞９ａの皮膜の一部を破る。さらに被検体細胞９ａの貫通孔１の下面側より、細胞内液１１を被検体細胞９ａに注入する。これによって、被検体細胞９ａの一部を細胞内液１１と接触させることができ、被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定できる状態となる。

もしくは、被検体細胞９ａを貫通孔１に確実にトラップした状態で、ナイスタチンのように被検体細胞９ａの外壁を溶解する作用のある薬液を流路１６の内部に導入する。これによって、被検体細胞９ａに微細小孔を形成し、被検体細胞９ａの一部を細胞内液１１と接触させることができる。したがって、上記と同様に、被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定できる状態となる。

ここで、細胞外液１０とは、例えば、哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ^＋イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ^＋イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ⁻イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。細胞内液１１とは、例えば、哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ^＋イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ^＋イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ⁻イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。

ところで、ウエル１５ａ、開口部１４ａに細胞外液１０を充填した状態（被検体細胞９ａが貫通孔１にトラップされていない状態）で、ウエル１５ａの内部に設置された参照電極１２と流路１６の内部に設置された測定電極１３との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の抵抗値を観察することができる。これは細胞電気生理センサ２０に設けられた貫通孔１に電解液が浸透し、参照電極１２と測定電極１３との間で電気回路が形成されるからである。すなわち、これにより貫通孔１が適切に形成され、この貫通孔１の上下間は、電気的に導通していることが分かる。

次に、参照電極１２と測定電極１３との間で電流あるいは電圧変化を測定することによって被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定検出する。測定検出を安定に行うには、被検体細胞９ａを貫通孔１に確実にトラップした状態を安定して維持する必要がある。そのためには、貫通孔１の大きさは被検体細胞９ａの大きさよりも少し小さな形状とし、この貫通孔１を塞ぐように被検体細胞９ａを吸引機構などによって被検体細胞９ａを固定しておける形状とすることが好ましい。そのために、本実施の形態では、貫通孔１の直径は３μｍとした。

このように、細胞９の大きさが５〜５０μｍ程度である場合、細胞９と貫通孔１とを高い密着性を持って保持するには、貫通孔１の直径を３μｍ以下とすることが望ましい。しかし、貫通孔１の最適な大きさは、測定する細胞９の形状、性質によって決定することができる。

次に、被検体細胞９ａに薬品などの化学化合物などの刺激を被検体細胞９ａに加える。このような刺激が加わると、被検体細胞９ａは電気生理的応答を示す。その結果、参照電極１２と測定電極１３との間において、例えば電圧、電流などの電気的応答として、電気化学的変化を観測することができる。

上記化学的刺激としては、化学薬品、毒物が挙げられ、これ以外に、物理的刺激としては機械的変異、光、熱、電気、電磁波などが挙げられる。

被検体細胞９ａがこれらの刺激に対して活発に反応する場合、被検体細胞９ａはその細胞膜にあるイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。そうすると、被検体細胞９ａを通るイオン電流が発生し、この被検体細胞９ａの内外の電位勾配が変化する。すなわち、この変化を、反応前後の参照電極１２と測定電極１３との間の電圧あるいは電流を測定することによって検出することができる。

なお、本実施の形態においては、細胞電位測定装置の細胞電気生理センサ２０は、ダイアフラム２を下面側に配置して測定する例について説明してきたが、ダイアフラム２を上面に配置して測定することも可能である。この場合、細胞内液１１の気泡の発生と残留を抑制することが可能となり、被検体細胞９ａは上記と反対側の貫通孔１の開口部に密着することになる。このような構成は、被検体細胞９ａが平らな面に形成した穴に密着する方が都合の良い場合などに用いることができる。どちらを使用するかは、被検体細胞９ａの性質によって適宜決めることが好ましい。

参照電極１２と測定電極１３の間で電気的応答を測定する際、貫通孔１の近傍に気泡が存在すれば、抵抗値の増大により測定電極１３で検知する電流・電圧の測定値が変動する。しかし、図１に示したような構成の本実施の形態の細胞電気生理センサ２０を用いることによって、上記したように、残留する気泡の発生を抑制することができるとともに、残留した気泡を速やかに除去することができる。したがって、電流あるいは電圧の微少変化を高精度に測定することができ、測定の信頼性を高めることができる。

ところで、液体を細胞電気生理センサ２０に分注する際に、一部小さな気泡がダイフラム２と凹部７の接合部で残留することがあるが、貫通孔１からの距離が離れていることと、このような小さな気泡の存在による測定への影響は少ないことが分かっている。

なお、フレームの内壁面３ａ、ダイアフラム２の表面および貫通孔１の内壁面など、液体が接触する全ての表面を親水性としておくことがより好ましい。これによって、各種測定のための液体との濡れ性を高めることによって、気泡の発生と残留をより効果的に抑制することができる。

さらに、複数設けた凹部７の形状をそれぞれ異なった寸法形状としておくことによって、液体の粘度、成分等が異なった性質を有する液体の測定であっても、容易に対応できるセンサ構造を実現することが可能である。

なお、細胞外液１０と細胞内液１１とは、本実施の形態のように異なる組成のものを用いてもよく、同じものを用いてもよい。

また、本実施の形態では、ダイアフラム２は円板形状であったが、四角形状など他の形状でも同様の効果が得られる。

以上説明してきたように、本実施の形態によれば、分注器から分注された細胞９を含んだ液滴が最も近いピラー６の一部に接触する。これによって液体は、ピラー６の外壁面６ａとフレーム３の内壁面３ａとで形成する凹部７の方向へ表面張力で流動しながらダイアフラム２の方向へ移動する。その後、液体は、貫通孔１が存在するダイアフラム２の中心部へと液体を誘導される。これによって、気泡の発生の抑制と残留した気泡を効率よく除去することができる。したがって、気泡に影響されることなく、電流あるいは電圧の微少変化を高精度に測定でき、測定の信頼性を高めることができる。

（実施の形態２）
本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサについて、図５を用いて説明する。

図５は本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの上面図である。図５において、本実施の形態の細胞電気生理センサが、実施の形態１で示した細胞電気生理センサの構成と大きく異なっているところは、ピラー６の断面形状を多角形状としていることである。これによって、凹部７の形状パターンの設計幅を大きく拡大させることができる。したがって、マイクロピペットなどの先端の形状に合わせて確実に液滴の表面をピラー６の稜線５１や先端角部６１へ接触させることができ、液体の充填を速やかに効率よく行うことができる。

また、断面形状が多角形状のピラー６の稜線２１が貫通孔１と対向するように配置することによって、稜線２１に沿って、内側から外側へ、あるいは外側から内側へと液体の流れが形成され、導入された液体の攪拌および液体の置換をスムーズにすることができる。したがって、図４に示すウエル層１５あるいは仕切り板１４からキャビティ４の内部に流入してくる液体の攪拌と置換を効率よく行うことができ、気泡の抜けをより効果的とすることができる。

このように本実施の形態によれば、液体が多面形状のピラー６の先端角部６１に接触することになるので、より確実に液体の充填を速やかに行うことができる。

（実施の形態３）
本発明の実施の形態３における細胞電気生理センサについて、図６を用いて説明する。

図６は本発明の実施の形態３における細胞電気生理センサの断面図である。本実施の形態と実施の形態１との主な違いは、図６に示すように、ピラー６の外壁面（表面）６ａに、その側表面に沿って弧状の凹凸１８を複数個形成した点と、ピラー６の長軸方向にほぼ平行な複数の溝１９を形成した点である。

凹凸１８を形成する方法としては、ドライエッチング工程において、プラズマ存在下で、ＳＦ_６などのエッチングを促進するガスと、Ｃ₄Ｆ₈などのエッチングを抑制するガスとを交互に導入することによって形成する方法がある。

このようにピラー６の外壁面６ａに、ピラー６の長軸方向に対してほぼ垂直な凹凸１８を形成することによって、液滴とピラー６の外壁面６ａとの接触面が多面となり液滴間の引力が働き、液滴が大きな塊になろうとする。これによって、液体をダイアフラム２へと効率よく導くことができる。また液体を凹凸１８に沿ってピラー６の外壁面６ａの外周全体に行き渡らせることができる。

また、ピラー６の外壁に対して、斜め上方からエッチングを促進するガスを導入すると、外壁６ａに小さな切欠けが出来る。そして、その後凹凸１８を形成する場合と同様のドライエッチング加工を続けると、その欠け部分を発端にして、ピラー６の長軸方向に溝１９を形成することができる。この溝１９は、欠けを沢山形成することによって、多数形成することができる。

このように本実施の形態では、ピラー６の長軸方向に複数の溝１９を形成したため、上方から注入される液滴を、この溝１９に沿ってダイアフラム２の下方側へと誘導することができる。すなわち、液滴を下方に早く誘導し、隣接するピラー６との隙間を埋めないようにする。これによって、気泡の逃げ道を確保し、気泡の発生を抑制し、測定の信頼性の高い細胞電気生理センサを実現できる。なお、この溝１９は、下側、すなわちダイアフラム２の近くでは、より多く形成したほうが、ダイアフラム２まで液滴を誘導するのに効果的である。

さらに本実施の形態では、複数の凹凸１８間を溝１９が連結する為、液体はピラー６の外周を濡らしながらも、ピラー６の先端側からダイアフラム２側へと効率よく流れていく。

また、本実施の形態では、凹凸１８や溝１９によって表面積が増えるため、注入される液滴とピラー６との接触面も大きくなる。したがって、ピラー６の外壁面６ａを熱酸化等によって親水性にすれば、ピラー６の外壁面６ａが液滴を引張る力も大きくなり、液体をピラー６の外壁面６ａに沿って、貫通孔１が存在するダイアフラム２へと誘導することができる。これによって、気泡の発生を抑制することができ、測定の信頼性の高い細胞電気生理センサを実現できる。

なお、本実施の形態では、貫通孔１、ダイアフラム２、フレーム３、ピラー６と、このピラーの外壁面６ａの凹凸１８及び溝１９を同一工程で形成することができ、生産性に優れる。

なお、凹凸１８は、図６に示すようなピラー６の長軸方向と垂直方向でなくても、液滴をピラー６の外壁面６ａに行き渡らせる程度に、ピラー６の長軸方向と交差する方向あれば良い。また、溝１９は、図６に示すようなピラー６の長軸方向と一致しなくても、液滴を下方に誘導できる程度にピラー６の長軸方向と略平行であればよい。

（実施の形態４）
本発明の実施の形態４における細胞電気生理センサの構成について、図７〜図９を用いて説明する。

図７は本発明の実施の形態４における細胞電気生理センサの斜視図である。図８は図７の８−８線における断面図である。図９は同実施の形態の細胞電気生理センサを用いた細胞電位測定装置の断面図である。

本実施の形態と実施の形態１との主な違いは、ピラー６を、貫通孔１の近傍、すなわち、フレーム３の内壁面３ａ側よりも貫通孔１側であって、ダイアフラム２上の位置に形成していることである。

本実施の形態によれば、貫通孔１の近傍にピラー６を形成することによって、分注器などを用いて液滴状の液体をキャビティ４の内部へ注入したときの貫通孔１近傍における気泡の発生の抑制と気泡の除去を効率よく行うことができる。

すなわち、本実施の形態によれば、フレーム３の端面５に細胞外液１０よりなる液滴が接触したとしても、液滴を構成する細胞外液１０の表面張力によって、まず液滴の先端がピラー６の先端に触れる。これにともなって、細胞外液１０よりなる液体が、ピラー６の壁面６ａを濡らしながらキャビティ４の内部の貫通孔１に誘導される。この際、気泡はピラー６の外壁面６ａとフレーム３の内壁面３ａの間から上方に逃げ、細胞外液１０よりなる液体を、細胞９とともに気泡の発生しない状態で貫通孔１の近傍へ正確に充填することができる。そして、ピラー６の壁面６ａをつたいながら残留した気体を除去していくことも容易にできる。

また、ピラー６の断面形状としては機械的強度を確保することから１００μｍ以上の大きさを有していることが好ましい。また、隣接するピラー６の間隔を５０〜１００μｍとすることによって表面張力による液体の浸透を効率よく行うことができ、ピラー６の効果を最大限発揮することができる。すなわち、ピラー６の間隔が５０μｍより小さい場合は、ピラー6間に液体が流れ難くなり、ピラー６とフレーム３との間に気泡が残存しやすくなる。また、ピラー６の間隔が１００μｍより大きい場合は、液体の浸透の効率が下がる。

また、ピラー６はフレーム３の内壁面３ａから離れ、貫通孔１側に近づける程、貫通孔1に向けて液体の浸透を効率よく行うことができる。しかし、細胞９を貫通孔１の近傍へ投入するスペースを保つ為、貫通孔１とピラー６との間隔は５０μｍ以上とすることが好ましい。

そして、ピラー６を、貫通孔１の周囲を囲うように、放射状に複数設けることによって、上記の作用をより高めることができる。すなわち、マイクロピペットなどの分注器の先端が傾いたとき、あるいは液滴の形状の対称性が少なくなった場合であっても、確実に液滴の一部をいずれかのピラー６の一部に接触させることができる。これによって、確実に貫通孔１の近傍に設けたピラー６の壁面６ａから気泡の発生を抑制するとともに、気泡の残留を大幅に低減しながら細胞外液１０などの液体を充填することができる。

また、ピラー６の表面を親水性にすることによって、液体との濡れ性をより高めることができ、気泡の発生の抑制と気泡の除去をより効果的に行うことができる。

そして、ピラー６の壁面６ａの表面を親水性とするためには、表面に付着した炭素分子を除去した清浄な表面としておくことが好ましい。その後、速やかに純水を充填した容器の内部に保管しておくことによって、表面の清浄度を保持することができる。また、このときの親水性は接触角で１０°以下であることが好ましい。この接触角は測定対象の表面にイオン除去された純水の水滴を塗布して測定することができる。

さらに、親水性を高める別の手段として、ピラー６の壁面６ａの表面を二酸化珪素などの絶縁膜によって被覆しておくことも効果的である。

なお、キャビティ４の内壁面、ダイアフラム２および貫通孔１の内壁面などの液体が接触する全ての表面を親水性としておくことがより好ましい。これによって、各種測定のための液体との濡れ性を高めることによって、気泡の発生を抑制することができる。

さらに、複数設けたピラー６の間隔をそれぞれ異なった寸法としておくことによって、気泡の抜け易いピラー６と、液体の浸透が容易なピラー６を混在させることができる。

このように、本実施の形態の細胞電気生理センサによれば、貫通孔１の近傍にピラー６を設けることによって、キャビティ４の内部に存在していた空気などの気体をピラー６から容易に外部へ放出することができる。これとともに、ピラー６の壁面６ａを濡らしながら、速やかに液体をキャビティ４の内部へ充填し、貫通孔１の近傍に気泡の無い状態で充填することができる。そしてその結果、測定の信頼性を高めた細胞電気生理センサを実現することができる。さらに壁面６ａに親水性を付与することによって、ピラー６と液体との濡れ性をさらに高め、速やかに液体をキャビティ４の内部へ充填することができる。これとともに、貫通孔１の近傍に気泡の無い状態で液体を充填することができる。

本実施の形態の細胞電気生理センサを用いた細胞電位測定装置によれば、図９に示すように、気泡が残留しない状態で液体を充填し、被検体細胞に化学的刺激などを与えて、参照電極と測定電極の間の電流または電圧を測定する。

このように細胞９が活動する際に発する電気生理活動を測定する方法については、実施の形態１と同様であるため説明を省略する。

以上説明してきたように、本実施の形態によれば、まず、分注器から分注された細胞９を含んだ液滴が最も近いピラー６の一部に接触する。その後、このピラー６を形成する壁面６ａを液体の表面張力で移動し、その後フレーム２の近傍で液体を貫通孔１が存在するダイアフラム２の中心部へと液体を誘導することができる。これによって、気泡の発生の抑制と残留した気泡を効率よく除去することができる。

（実施の形態５）
本発明の実施の形態５における細胞電気生理センサについて、図１０を用いて説明する。図１０は、本発明の実施の形態５における細胞電気生理センサの断面図である。

本実施の形態の細胞電気生理センサが、図７に示した実施の形態４の細胞電気生理センサの構成と大きく異なっているところは、ピラー６の高さをフレーム３の端面５の高さよりも高くしていることである。

これによって、マイクロピペットなどの先端の開口径が大きな器具を用いたとしても、より確実に液滴の先端をピラー６の先端へ接触させることができ、気泡の残留を確実に抑制することができる。

なお本実施の形態では、ピラー６とダイアフラム２とが一体的に形成されているため、このようにピラー６を高くすることにより機械的強度に優れる。

（実施の形態６）
本発明の実施の形態６における細胞電気生理センサについて、図１１を用いて説明する。図１１は、本発明の実施の形態６における細胞電気生理センサの断面図である。

本実施の形態の細胞電気生理センサが、図７で示した実施の形態４の細胞電気生理センサの構成と大きく異なっているところは、ピラー６が円錐形状であって先端が鋭角に尖った形状をしていることである。

本実施の形態によれば、ピラー６の先端部に気泡が残留することがなく、ピラー６の間隔を狭く設計した場合であっても、ピラー６の先端側には液体が拡散するスペースを広げることができる。これは、ピラー６の先端から液滴の一部に大きな応力がかかると、液滴には表面張力が働きにくくなり、結果としてピラー６の外壁６ａと液滴との親和性が高まるからと考えられる。

すなわち、本実施の形態では、液滴の表面張力を分散して、液体をピラー６間に誘導しやすくなり、したがって気泡が貫通孔１近傍に残留することを抑えることができる。

（実施の形態７）
本発明の実施の形態７における細胞電気生理センサについて、図１２を用いて説明する。

図１２は、本発明の実施の形態７における細胞電気生理センサの上面図である。本実施の形態の細胞電気生理センサが、図７で示した実施の形態４の細胞電気生理センサの構成と大きく異なっているところは、断面形状が多角形状のピラー６の稜線２１を貫通孔１と対向するように配置している点である。

これによって、ウエル層１５あるいは仕切り板１４からキャビティ４の内部に流入してくる液体の濡れ性を高めるとともに、ピラー６の内周部からの気泡の抜けをより効果的とすることができる。

すなわち、気泡の残留をより少なくすることができるとともに、液体の流れをスムーズにすることができる。

また、細胞９を貫通孔１の近傍へ効率よく落下させることができることから、少数の細胞９であっても、速やかに被検体細胞９ａとして貫通孔１に固定できる。

（実施の形態８）
本発明の実施の形態８における細胞電気生理センサについて、図１３を用いて説明する。図１３は、本発明の実施の形態８における細胞電気生理センサの断面図である。

本実施の形態と図７に示す実施の形態４との主な違いは、図１３に示すように、ピラーの外壁面（表面）６ａに、その側面に沿って環状の凹凸１８を幾層にも形成した点である。この凹凸１８は、ドライエッチングによって形成することができる。

このようにピラーの外壁面６ａに、ピラー６の長軸方向に対してほぼ垂直な凹凸１８を形成することによって、この凹凸１８に沿って液滴をピラーの外壁面６ａの外周全体に行き渡らせることができる。

なお、図１３には図示していないが、ピラー６の外壁面６ａには、実施の形態２と同様に、長軸方向の溝を形成してもよい。この溝を形成することによって、注入される液滴を、溝に沿って貫通孔１の近傍へと誘導することができ、気泡の発生を抑制し、測定の信頼性の高い細胞電気生理センサを実現できる。

また溝を形成することにより、この溝と交差する凹凸１８は環形状の一部を欠いた弧状となる。これにより、液体を凹凸１８に沿ってピラー６の外周に行き渡らせながら、液体を交差する溝を伝ってダイアフラム２側へと効率よく導くことができる。

さらに本実施の形態では、貫通孔１、ダイアフラム２、フレーム３、ピラー６と、このピラー６の外壁面６ａの凹凸１８を同一工程で形成することができ、生産性に優れる。

なお上記実施の形態１〜８では、バイオセンサとして細胞電気生理センサを例に挙げたが、その他ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質、アミノ酸、脂質膜、糖質、イオン、抗原などを被検体とし、これらの測定を行う各種のバイオセンサに応用ができる。この場合は、被検体保持部がＤＮＡプローブなどの受容体や電極、抗体等となる。

本発明のバイオセンサは、貫通孔近傍における気泡の発生の抑制と残留した気泡の除去を容易に行うことができる。このことから、細胞電気生理センサの測定に対する信頼性を向上させることができる。従って、高精度な測定が要求される医療分野等におけるバイオセンサとして、大いに利用可能性を有するものである。

１ 貫通孔
２ ダイアフラム
３ フレーム
４ キャビティ
５ 端面
６ ピラー
９ 細胞
９ａ 被検体細胞
１０ 細胞外液
１１ 細胞内液
１２ 参照電極
１３ 測定電極
１４ 仕切り板
１４ａ 開口部
１５ ウエル層
１５ａ ウエル
１６ 流路
１７ 容器
１７ａ プレート
１８ 凹凸
１９ 溝
２０ 細胞電気生理センサ
２１ 稜線

Claims (12)

1. 被検体保持部を有したダイアフラムと、
   前記ダイアフラムを支持するとともにキャビティを有したフレームと、
   前記フレームの内壁面側であって前記ダイアフラム表面に形成されたピラーとを備え、前記ピラーは、前記被検体保持部の周囲を囲うように複数設けられているバイオセンサ。
2. 前記ピラーは、前記フレームの内壁面と接し、前記ピラーの外壁面と前記フレームの内壁面とのなす角が鋭角となるように形成された請求項１に記載のバイオセンサ。
3. 前記ピラーの断面形状が多角形形状であって、前記多角形状の稜線が前記フレームの内壁面と接している請求項２に記載のバイオセンサ。
4. 前記ピラーは、前記フレームの内壁よりも、前記被検体保持部の近傍に形成された請求項１に記載のバイオセンサ。
5. 前記ピラーの断面形状が多角形形状であって、前記多角形状の稜線が前記被検体保持部の方向を向いている請求項４に記載のバイオセンサ。
6. 前記ピラーの高さが、前記フレームの高さよりも高い請求項４に記載のバイオセンサ。
7. 前記ピラーは、外壁面が親水性である請求項１に記載のバイオセンサ。
8. 前記ピラーは、前記フレームの内壁と一体成形された請求項１に記載のバイオセンサ。
9. 前記ピラーの表面には、前記ピラーの長軸方向と交差する方向に複数個の凹凸が形成された請求項１に記載のバイオセンサ。
10. 前記ピラーの表面には、前記ピラーの長軸方向に複数の溝が形成された請求項１に記載のバイオセンサ。
11. 前記ピラーの高さと前記フレームの高さが同じである請求項１に記載のバイオセンサ。
12. 前記ピラーと前記ダイアフラムとが一体成型された請求項１に記載のバイオセンサ。

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