JP5142246B2

JP5142246B2 - ラミニン６ｂ（ラミニン３ｂ１１）蛋白質

Info

Publication number: JP5142246B2
Application number: JP2007028897A
Authority: JP
Inventors: 香宮崎
Original assignee: Yokohama City University
Current assignee: Yokohama City University
Priority date: 2007-02-08
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2027-02-08
Also published as: JP2008189640A

Description

本発明は、ラミニン６Ｂ（ラミニン3B11）蛋白質に関する。

多細胞生物がその生命を維持するためには、細胞が細胞外マトリックス(Extracellular Matrix; ECM)に接着することが必須である。接着性の細胞はECMとの接着が失われると、増殖が停止し、アポトーシスを起こす。つまりECMは、細胞と相互作用することで細胞の生存にかかわる重要な機能を調節している(非特許文献１)。ECMには、細胞から分泌される蛋白質や複合多糖など、一般に巨大で複雑な蛋白質が含まれている。ECM分子は主に基底膜に存在する基底膜型と、結合組織に存在する間質型の2つに大別される。また、ECM分子の特徴として、自己会合能を持つことが挙げられる。これにより、単独分子種で強度の強い繊維やシート状構造を作ることができる。さらに、分子内に多くの機能ドメイン構造を持つとともに、他の分子と結合するドメインを有するため、ECM分子間で強固なネットワーク構造を形成できる。

上皮組織と結合組織との間に存在する基底膜には、IV型コラーゲン、パールカンなどのヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびラミニンやナイドジェンなどの糖蛋白質が存在する。これらの基底膜分子は互いに複雑に結合し、網目状の広大なネットワークを形成している。

ラミニンは、α鎖、β鎖、γ鎖の３つのサブユニットからなる一群の蛋白質ファミリーである。すべてのラミニンは、各構成鎖のC末端で結合してコイルドコイル構造を作り、ジスルフィド結合によって安定化したヘテロ三量体を形成している(非特許文献２及び３)。現在までに、5種類のα鎖、3種類のβ鎖、3種類のγ鎖が確認され、ラミニンとしては15種類のアイソフォームが確認されている(非特許文献４)。

ラミニンのα鎖は、C末端領域に球状ドメイン（Globularドメイン、Gドメイン）が5つ(G1-5)存在し、細胞膜表面受容体であるインテグリンやシンデカン、α-ジストログリカンなどへの主要な結合部位となっている(非特許文献５)。一方、β鎖やγ鎖にはコラーゲンやヘパラン硫酸またはナイドジェンなど、他のECM分子との結合ドメインが存在することが明らかとなっている。

ラミニンα3A鎖は、β3、γ2鎖と結合してラミニン５A（またはラミニン3A32)、またβ1、γ1鎖と結合してラミニン６A（またはラミニン3A11)を形成する（図１）(非特許文献４)。ラミニン５Aやラミニン６Aは組織中や培養系では様々な上皮細胞から分泌され、生体内では主に皮膚の基底膜に存在する(非特許文献３及び６)。ラミニン５Aのα3A鎖は、細胞外に分泌後、190 kDaから160 kDaもしくは145 kDaへとプロテアーゼによる切断（プロセシング）を受ける(非特許文献７)。その結果、ラミニン５Aの細胞に対する運動活性や接着活性が変化することが報告されている。また、その切断部位はG3ドメインとG4ドメインの間に存在することが報告されている。一方で、ラミニン６Aが持つα3鎖は、190 kDa型が主であることが明らかとなっている（非特許文献８）。

生体内に存在するラミニン５A はラミニン６Aと複合体を形成して存在していることが知られている(非特許文献９)。さらに、このラミニン５A -６A複合体はラミニン６Aのβ1鎖およびγ1鎖のVIドメインを介して他のラミニンと相互作用することができる。また、γ1鎖とナイドジェンとの結合を介して、IV型コラーゲンのネットワークに組み込まれると考えられている(非特許文献１０)。また、ラミニン５A -６A複合体におけるラミニン５Aのα3A鎖のGドメインはインテグリンα₃β₁もしくはα₆β₄と結合するが、ラミニン６Aのα3A鎖は結合しないと考えられている(非特許文献１１)。このことからラミニン６Aは、上皮系組織の基底膜において、他のECM分子と結合し、ECM分子間のネットワーク形成を架橋する働きを持つと考えられる。したがって、ラミニン６Aをラミニン５Aや他のECM蛋白質と組み合わせることにより、表皮や他の上皮細胞を生体内に近い条件で細胞培養できる可能性が考えられる。

ラミニンα3A鎖には、mRNAのスプライシングの違いによって、N末端領域が長いラミニンα3B鎖が存在することが知られていた。このラミニンα3B鎖はそのC末端領域にラミニンα3A鎖と共通のコイルドコイルドメイン（ドメインI/II）をもつため、β3、γ2鎖と結合してラミニン５B（またはラミニン3B32)、またβ1、γ1鎖と結合してラミニン６B（またはラミニン3B11)を形成すると予想されるが、これらの蛋白質の生体内での発現は知られていない（図１）。最近、ヒトのラミニンα3B鎖の全長ｃDNAがクローニングされ、ヒト胎児腎由来細胞株ＨＥＫ２９３において組み換え型ラミニン５Bが作製された（非特許文献１２）。ラミニン５Bはラミニン５Aよりも高い細胞接着活性や細胞運動活性を示す。

Hood JD, Cheresh DA. (2002): Role of integrins in cell invasion and migration.Nat Rev Cancer.;2(2):91-100. Colognato H, Yurchenco PD. (2000): Form and function: the laminin family of heterotrimers. Dev Dyn.; 218(2):213-34. Review. Aumailley M, Rousselle P. （1999）: Laminins of the dermo-epidermal junction. Matrix Biol.; 18(1):19-28. Review. Aumailley, M., Bruckner-Tuderman, L., Carter, W. G., Deutzmann, R., Edgar, D., Ekblom, P., Engel, J., Engvall, E., Hohenester, E., Jones, J. C., Kleinman, H. K., Marinkovich, M. P., Martin, G. R., Mayer, U., Meneguzzi, G., Miner, J. H., Miyazaki, K., Patarroyo, M., Paulsson, M., Quaranta, V., Sanes, J. R., Sasaki, T., Sekiguchi, K., Sorokin, L. M., Talts, J. F., Tryggvason, K., Uitto, J., Virtanen, I., von der Mark, K., Wewer, U. M., Yamada, Y. and Yurchenco, P. D. (2005): A simplified laminin nomenclature. Matrix Biol. 24:326-332. Review. Hirosaki T, Mizushima H, Tsubota Y, Moriyama K, Miyazaki K. (2000): Structural requirement of carboxyl-terminal globular domains of laminin alpha 3 chain for promotion of rapid cell adhesion and migration by laminin-5.J Biol Chem.; 275(29):22495-502. Marinkovich MP, Lunstrum GP, Keene DR, Burgeson RE. (1992) The dermal- epidermal junction of human skin contains a novel laminin variant.J Cell Biol.; 119(3):695-703. Miyazaki K. (2006) Laminin-5 (laminin-332): unique biological activity and role in tumor growth and invasion. Cancer Sci; 97(2): 91-98. Hirosaki T, Tsubota Y, Kariya Y, Moriyama K, Mizushima H, Miyazaki K. (2002) Laminin-6 is activated by proteolytic processing and regulates cellular adhesion and migration differently from laminin-5.J Biol Chem.; 277(51):49287-95. Champliaud MF, Lunstrum GP, Rousselle P, Nishiyama T, Keene DR, Burgeson RE. (1996): Human amnion contains a novel laminin variant, laminin 7, which like laminin 6, covalently associates with laminin 5 to promote stable epithelial-stromal attachment.J Cell Biol.; 132(6):1189-98. Mayer U, Poschl E, Gerecke DR, Wagman DW, Burgeson RE, Timpl R. (1995) : Low nidogen affinity of laminin-5 can be attributed to two serine residues in EGF-like motif gamma 2III4.FEBS Lett.;365(2-3):129-32. Rousselle P, Keene DR, Ruggiero F, Champliaud MF, Rest M, Burgeson RE. (1997) Laminin 5 binds the NC-1 domain of type VII collagen.J Cell Biol.; 138(3):719-28. Kariya Y, Yasuda C, Nakashima Y, Ishida K, Tsubota Y, Miyazaki K. (2004) Characterization of laminin-5B (α3Bβ3γ2) and NH2-terminal proteolytic fragment of its α3B chain: Promotion of cellular adhesion, migration and proliferation. J Biol Chem, 279(23): 24774-24784.

本発明は、細胞の接着、移動、生存などを支え、組織の構築に重要な働きをするラミニン分子の新種を提供することを目的とする。

本発明らは、ＨＥＫ２９３細胞に、ラミニンα3B、β1、γ1鎖のｃDNAを導入することによって、初めてラミニン６Bを安定的に強制発現させる細胞系LN6B-HEKを確立した。この細胞が産生するラミニン６B蛋白質を精製し、このラミニンが細胞接着活性や細胞運動活性を示すことを明らかにした。また、ラミニン６Bが血管基底膜に局在し、血管内皮細胞の増殖を促進することを明らかにした。本発明ではまた、ラミニンα3B鎖の代わりにα3A鎖のｃDNAをＨＥＫ２９３細胞に導入することにより従来の方法よりも約10倍量のラミニン６Aを発現させることに成功した。

動物細胞が生存し、増殖するためには基質（足場）となる蛋白質が必要であり、この基質蛋白質は細胞の種類によって異なる。近年、再生医療の分野で様々な細胞を生体外で培養し、人体に移植利用することが考えられている。しかし、特に正常上皮細胞をシャーレの上で安定に培養することは困難であり、その要因の一つとして、適切な基質蛋白質が入手できないことが上げられる。

これまで、細胞接着基質蛋白質としては、容易に調製できるフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン１などが使用されてきたが、ラミニン６Ｂはその存在が知られてなく、当然使用されたことがない。ラミニン６Ｂはラミニン１（α1、β1、γ1鎖から構成される。）よりも高い細胞接着活性をしめす。構造、活性、組織分布の違いから、細胞培養においてラミニン６Ｂが既知の細胞接着分子と異なる特性をしめすことが期待される。
後述の実施例に示すように、ラミニン６Bは血管基底膜に局在し、血管内皮細胞の増殖を促進する。したがって、ラミニン６Ｂは血管内皮細胞や表皮細胞を安定的に培養するための接着基質として利用できる可能性がある。
本発明の要旨は以下の通りである。

（１）以下の(a)又は(b)の蛋白質。
(a)配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するα３Ｂ鎖、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するβ１鎖、および配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するγ１鎖の各サブユニットから構成されるラミニン６Ｂ蛋白質。
(b) (a)の蛋白質において、配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号４で示されるアミノ酸配列、および配列番号６で示されるアミノ酸配列のすくなくとも１つのアミノ酸配列中の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつラミニン６Ｂ蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質。
ただし、α３Ｂ鎖に関しては、Ｃ末端側に存在するＬＧ４−５ドメイン（配列番号２の8833番目から10002番目のアミノ酸配列）を含まなくてもよい。

（２）以下の(i)、(ii)および(iii)のＤＮＡで形質転換した宿主細胞。
(i)１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するα３Ｂ鎖をコードするＤＮＡ
(ii)１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するβ１鎖をコードするＤＮＡ
(iii)１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するγ１鎖をコードするＤＮＡ
ただし、α３Ｂ鎖に関しては、Ｃ末端側に存在するＬＧ４−５ドメイン（配列番号２の8833番目から10002番目のアミノ酸配列）を含まなくてもよい。

（３）宿主細胞がHEK細胞である（２）記載の細胞。
（４）（２）または（３）記載の細胞を培養することを含む、（１）記載の蛋白質の製造方法。
（５）（１）記載の蛋白質を含む組成物。
（６）細胞の培養基質、細胞増殖促進剤、血管新生剤、創傷治癒剤、神経再生剤又は移植基材として用いられる（５）記載の組成物。

本発明により、新規なラミニン６Ｂ蛋白質が提供された。ラミニン６Ｂは細胞の接着や移動を促進することから、将来的に再生医療や細胞工学の分野で利用できる可能性がある。

以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
図１に、ラミニン５Ａ、本発明のラミニン６Ｂ、ラミニン６Ａの構造を示す。ラミニン６Ｂ蛋白質は、α３Ｂ鎖、β１鎖およびγ１鎖からなる。ラミニン５Ａは、α３Ａ鎖、β３鎖およびγ２鎖からなり、ラミニン６Ａは、α３Ａ鎖、β１鎖およびγ１鎖からなる。α３Ｂ鎖はα３Ａ鎖の約２倍の大きさをもち、α３Ｂ鎖のＣ末端側約半分の構造はα３Ａ鎖と共通である。α３Ｂ鎖とα３Ａ鎖のＣ末端部分には球状（Ｇ）ドメインが存在し、それは５つのサブドメイン（またはモジュール）（Ｇ１〜Ｇ５）に分かれている。

α３Ｂ鎖はαＡ鎖のＮ末端側に３つの球状ドメイン（Ｎ末端側からドメインＬＮ、Ｌ４ａ、Ｌ４ｂ）と２つのＥＧＦ様ドメイン（Ｎ末端側からドメインＬＥａ、ＬＥｂ）が付加された構造をもつ。これらのドメインはインテグリンへの結合や、自己あるいは他のラミニンとの会合に寄与すると考えられている。α３Ｂ鎖の全体的な構造は他の長鎖型α鎖である、α１、α２、α５鎖に類似する。

本発明のラミニン６Ｂ蛋白質は組換えＤＮＡ技術を用いて各サブユニットを発現させることにより製造することができる。本発明のラミニン６Ｂの各サブユニットをコードするｃＤＮＡは、配列番号１、３または５の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適当なｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅することにより製造することができる。このようなＰＣＲ手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、”ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９９０に記載されている。

ラミニン６Ｂの各鎖遺伝子をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに中に組み込み、これを宿主細胞（例えば、真核生物又は原核生物細胞など）に導入して、それぞれの鎖を発現させることにより所望の蛋白質を得ることができる。本発明の蛋白質を発現させるために用いることができる宿主細胞の例としては、限定されないが、大腸菌、枯草菌等の原核生物宿主、および酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。宿主として有用な哺乳動物細胞には、胃がん細胞株、例えばＳＴＫＭ−１やＭＫＮ−４５、繊維肉腫細胞株、例えばＨＴ１０８０、胎児腎由来細胞株、例えばＨＥＫ２９３や浮遊型ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、線維芽細胞由来の細胞、例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１、またはリンパ球由来の細胞、およびこれらの誘導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、ヒト腎由来細胞株、例えばＨＥＫ２９３や浮遊型ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、線維芽細胞由来の細胞、例えばＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１が含まれる。さらに、植物細胞および昆虫細胞、例えばショウジョウバエの細胞もまた宿主として利用可能である。

ベクターとは、細胞にトランスフェクトすることができ、細胞ゲノム中でまたはそれとは独立に複製しうる一本鎖または二本鎖の核酸分子を表す。発現ベクターは、ＤＮＡの発現を駆動するプロモーター領域を含み、さらに転写および翻訳の制御配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、３’非コード領域、エンハンサー等を含んでいてもよい。プロモーターの例としては、原核生物宿主中で用いる場合には、ｂｌａプロモーター、ｃａｔプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、真核生物宿主中で用いる場合には、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母解糖系酵素遺伝子配列プロモーター等が挙げられる。ベクターの例には、限定されないが、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、λｇｔｌ０、λｇｔ１１、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ、ｐＫＲＣ、ＢＰＶ、ワクチニア、ＳＶ４０、２−ミクロン等が含まれる。

発現ベクターは、これを含有する宿主細胞を選択することができるように、１またはそれ以上のマーカーを有することが好ましい。マーカーとしては、栄養要求性宿主に対する栄養、抗生物質耐性（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン等）、または重金属耐性（例えば銅）を与えるものを用いることができる。
さらに、シグナル配列を用いて本発明の蛋白質を分泌発現させるように、あるいは、本発明の蛋白質を別の蛋白質との融合蛋白質の形で発現させるように、ベクターを構築することができる。融合蛋白質を用いることにより、蛋白質の安定性を改良し、または精製を容易にすることができる。そのような発現ベクターの構築は当該技術分野においてよく知られている。

ラミニン６Ｂの各鎖をコードするＤＮＡは、一つの発現ベクター内に組み込んで発現させてもよく、または別個の発現ベクターに組み込んで、これらのベクターを同じ細胞にトランスフェクトして発現させてもよい。α３Ｂ鎖、β１鎖およびγ１鎖の各サブユニットはいずれも非常に大きなポリペプチドであるため、好ましくは後者の方法を用いる。

本発明のラミニン６Ｂを発現するよう構築したベクターは、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクション等により、適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて本発明の蛋白質を産生させ、細胞または培地から所望の組換え蛋白質を回収し、精製することにより、本発明ラミニン６Ｂ蛋白質を得ることができる。精製は、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。

本発明のラミニン６Ｂの各鎖は、対応する配列番号で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（１又は２個以上、好ましくは、２個以上３０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下）のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。ただし、α３Ｂ鎖に関しては、Ｃ末端側に存在するＬＧ４−５ドメイン（配列番号２の8833番目から10002番目のアミノ酸配列）を含まない蛋白質も本蛋白質に含まれる。このような天然の蛋白質と相同の蛋白質も本願発明の範囲内である。
アミノ酸の保存的変更を行って、元の機能を保持している蛋白質またはポリペプチドを得ることができることは、当該技術分野においてよく知られている。そのような置換には、アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること、例えば、１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ）を別のもので、または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間で置き換えることが含まれる。

また、配列番号２、４または６に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、かつラミニン６Ｂ蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質も本願発明の範囲内である。同一性は、同一である残基の数を、既知の配列または既知の配列のドメイン中の残基の総数で割り、１００を乗ずることにより計算する。標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム、例えば、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が利用可能である。好ましくは、これらのプログラムのデフォルト設定を用いるが、所望によりこれらの設定を変更してもよい。

ラミニン６Ｂ蛋白質の生物学的活性としては、細胞接着活性、細胞運動活性、細胞増殖活性などが挙げられる。特に血管内皮細胞の増殖に適した培養基質となる。
また、本発明のラミニン６Ｂを構成する各鎖の一部が欠失している蛋白質も本願発明の範囲内である。例えば、本発明のラミニン６Ｂのα３Ｂ鎖は、プロテアーゼによってＧ４およびＧ５が切断除去されるが、ラミニン６Ｂとしての活性を有する限り、切断型または非切断型を問わず本発明の範囲内にある。

さらに、ヒト以外の種の生物に由来する、ヒトラミニン６Ｂと同様の活性を有する蛋白質も本発明の範囲内である。このような蛋白質をコードする遺伝子は、配列番号１、３または５に示される配列を有するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをプローブまたはプライマーとして用いて、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ等の手法を用いて容易に単離することができる。このようにして得られる相同遺伝子は、配列番号１、３または５に記載の塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。あるいは、相同遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、３または５に記載の塩基配列を有する遺伝子とハイブリダイズすることができる。

ハイブリダイズとの用語は、ＤＮＡまたはこれに対応するＲＮＡが、溶液中でまたは固体支持体上で、別のＤＮＡまたはＲＮＡ分子と水素結合相互作用により結合することを意味する。このような相互作用の強さは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性によって、種々のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、ストリンジェンシーは、塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節することができる。そのようなストリンジェンシーの調節方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、"ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ"，第２版．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，１９８９）に記載されている。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、５０％ホルムアミドの存在下で、７００ｍＭのＮａＣｌ中４２℃、またはこれと同等の条件をいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄である。

本発明のラミニン６Ｂ蛋白質は、細胞接着活性、細胞運動活性、細胞増殖活性などを有する。ラミニン６Ｂの細胞接着活性は、プレートに本発明のラミニン６Ｂをコーティングし、このプレートに適当な細胞を播種し、所定時間インキュベートした後に接着した細胞の数を測定することによりアッセイすることができる。細胞運動促進活性は、プレートに本発明のラミニン６Ｂをコーティングし、このプレート上に適当な細胞を播種し、所定時間経過後に細胞の分散の程度を測定することによりアッセイすることができる。また、細胞の運動の様子をビデオにて撮影し、画像解析により細胞運動の速度を求めてもよい。細胞増殖活性は、ラミニン６Ｂをコーティングしたプレートに適当な細胞、例えば血管内皮細胞、を播種して数日間培養し、増殖した細胞を計数することにより測定することができる。

本発明のラミニン６Ｂ蛋白質を細胞の培養基質又は細胞増殖促進剤として用いる場合には、ラミニン６Ｂを細胞の培養液中に添加するか、または培養プレートもしくは培養シート上に塗布または固定化することにより使用することができる。あるいは、培養プレートもしくは培養シート上で増殖させたフィーダー細胞上に塗布してもよい。殆どの動物細胞は生存条件として培養器表面に接着することが必須であり、さらに増殖因子の刺激を受けて分裂する。ラミニン６Ｂは細胞接着活性をもつことから、多様な細胞の増殖促進剤として有効である。例えば、皮膚、肝臓、膵臓、軟骨、神経、血管などにおける正常細胞やがん細胞、各組織の幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞などの培養に使用できる。一方、本発明のラミニン６Ｂを薬学的に許容される担体とともに外用製剤として処方して、皮膚、粘膜等の表面に塗布してもよい。本発明のラミニン６Ｂ蛋白質は、軟膏、皮膚パッチ、移植用培養細胞シート、人工マトリクスなどの形態で、創傷治療用製剤として用いることができる。また、ラミニン６Ｂの高い細胞接着効果を利用して、生体組織に埋め込む種々の医療インプラントの塗布剤として用いることができる。さらに、血管新生剤、神経再生剤などとしても用いることができる。

限定されるわけではないが、本発明の組成物は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで使用する場合、好ましくは０．０１μｇ／ｍｌないし２０μｇ／ｍｌの濃度で用いることができる。本発明の組成物を医薬用組成物として用いる場合には、薬学的に受容可能な担体との混合物中に、治療上有効な量のラミニン６Ｂを含む。本発明の組成物は、全身的にまたは局所的に、好ましくは静脈内、皮下内、筋肉内に非経口的に投与し得る。非経口的に投与可能なラミニン溶液の調剤は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術的範囲内において行い得る。
本発明の組成物の用量用法は、薬剤の作用、例えば、患者の症状の性質及び／若しくは重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定され得る。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定することができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。

〔実施例１〕ラミニン６Ｂの発現系の作製と精製ラミニン６Ｂの性質
細胞培養
ヒト胎児腎由来細胞株HEK293は、American Type Culture Collection (ATCC, CRL-1573)（Rockville, MD）より購入した。培養はDalbecco’s modified essential medium(DMEM)/Ham’s F12(1:1)(Invitrogen, Carlsbad, CA)に 10%仔牛胎児血清（FCS; JRH Biosciences, Lenexa, KS）、100 U/mlペニシリンG(明治製菓, 東京)、0.1 mg/mlストレプトマイシン(明治製菓)を添加した培地（10% FCS入り DMEM/F12）を用いて37 ℃、5% CO₂存在下でおこなった。

抗体とその他の材料
ラミニンα3B鎖に対するマウスモノクローナル抗体（F7）、α3A鎖に対するマウスモノクローナル抗体（BG5）（α3B鎖にも弱く反応する）は当研究室で作製した。ラミニンγ2鎖に対するマウスモノクローナル抗体（D4B5）（Mizushima, H. et al., Horm. Res. 50 Suppl. 2: 7-14, 1998）とラミニンβ3鎖に対するマウスモノクローナル抗体（LE8A、LE12C）（Nakashima, Y. et al., J. Biochem. 138:539-552, 2005）は当研究室で作製したものを使用した。LE8Aはウェスタンブロッティング用、また LE12Cは免疫染色用に使用した。ラミニンβ1鎖に対するラットモノクローナル抗体(LT3)とラミニンγ1鎖に対するマウスモノクローナル抗体（2E8）はChemicon International社(Temecula, CA、USA)より購入した。

cDNA発現ベクターの作製
ヒトラミニンα3B鎖発現ベクター（LNα3BpcDNA3.1 Hygro(+))はWO2004/108927の実施例１に記載のように作製された（非特許文献１２）。このα3B鎖発現ベクターは8,832bpのcDNA（配列番号１の塩基配列の１番目〜8832番目）を含み、N末端側から2,944個のアミノ酸配列をコードする。ただし、この配列にはＬＧ４−５ドメイン（図１）（配列番号２のアミノ酸配列の2945番目〜3333番目）は含まれない。β1鎖(全長5,361 bp)およびγ1鎖（全長4,830 bp）cDNAは以下のように作製した。β1鎖、γ1鎖を、それぞれ４つの断片（β1-1〜4およびγ1-1〜4）に分けるようにプライマーを設計し、ヒト肺cDNAライブラリーよりPolymerase Chain Reaction（PCR）法を用いて各断片を増幅した。使用したプライマーと作製したプラスミドの組み合わせは表１に示す。その際、発現ベクターに組み込むため、β1-1の5’末端にKpn Iサイト、β1-4の3’末端にEcoR Vサイトを、γ1-1の5’末端にBamH Iサイト、γ1-4の3’末端にXba Iサイトをそれぞれ付加した。増幅断片はpGEM（登録商標）T-Easy ベクター（Promega, Madison, WI）に組み込み、DNAシークエンサーを用いて塩基配列を決定した。決定した配列を既知のβ1鎖（GenBank^TM accession no. M61916）およびγ1鎖（GenBank^TM accession no. J03202）の塩基配列と比較し、変異の有無を確認した。アミノ酸置換を伴う変異が認められた塩基については、点変異導入法や制限酵素によるつなぎ換えによって正しい塩基配列への修正をおこなった。

点変異導入法による塩基配列の修正にはPCRを用いた方法でおこなった（今井嘉紀 (1999): ワンデイミュータジェネシス）。その際、修正した塩基を含むプライマー（表１,２,３）を互いに背中合わせに接するように設計した。

表１のプライマー１〜１３の塩基配列をそれぞれ配列番号７〜１９に示す。

表２のプライマー１〜１３の塩基配列をそれぞれ配列番号２０〜３２に示す。

表３のプライマー１〜９の塩基配列をそれぞれ配列番号３３〜４１に示す。

塩基配列が正しいことが確認された各断片を、図２及び３に示したように制限酵素サイトを利用して結合し、ヒトラミニンβ1鎖cDNA全長（β1full/pBS）およびヒトラミニンγ1鎖cDNA全長(γ1full/T-Easy)を作製した。β1full/pBSよりKpn IとEcoR Vで、γ1full/T-EasyよりBamH IとXba Iで切り出されたβ1、γ1鎖cDNAを、それぞれpcDNA3.1/Zeo(+)（Invitrogen社）あるいはpcDNA3 (Invitrogen社)発現ベクターの相当する酵素サイトに組み込みこんだ。
また、細胞に導入するcDNA発現ベクターはQIAGEN（登録商標）Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Valencia, CA)で精製した。

接着型HEK293細胞を用いたヒト組換え型LN6B安定発現細胞株の構築（図４）
ヒト胎児腎由来細胞株HEK293にリポフェクション法を用いてγ1鎖cDNA発現ベクターを導入した。導入後、耐性薬剤であるG418で選択を行い、さらに細胞をクローン化した。これらのクローンから回収した培養液上清内のγ1鎖の分泌量をウェスタンブロッティング法により分析し、発現量が最も高いクローンを選択し、このクローンをγ1-HEKとした。次に、このγ1-HEK細胞にβ1鎖cDNA発現ベクターを導入し、耐性薬剤であるzeocinで選択を行い、さらに細胞をクローン化した。これらのクローンから回収した培養液上清内のβ1鎖の分泌量を分析し、発現量が最も高いクローンををβ1・γ1-HEKとした。さらに、β1・γ1-HEKにα3B鎖cDNA発現ベクター（WO2004/108927の実施例１に記載のLNα3BpcDNA3.1 Hygro(+)）（非特許文献１２）を導入し、hygromycinで選択をおこない、さらに細胞をクローン化した。これらのクローンから回収した培養液上清内のLN6Bの発現量を各構成鎖の抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した結果、安定してLN6Bを発現するクローンを得ることができた(図５)。このクローンを細胞株LN6B-HEKとし、以下の実験に用いた。

なお本発明において、α3B鎖cDNAの代わりにα3A鎖cDNAを発現ベクターに組み込み、上記と同様の操作を行うことにより、ラミニン６Ａの発現系も樹立することができた。HEK293細胞でラミニン６Ａを発現させた場合、以前に樹立したＨＴ1080系でのラミニン６Ａの発現系（非特許文献８）と比較して、発現量が10倍以上になった。

ヒト組換え型LN6Bの精製
LN6B-HEKからラミニン６Bを精製するため、細胞を無血清培養液中で培養し、回収した培養液上清1.5 lをQ Sepharose CL-4B陰イオン交換カラム（10 ml）（Amersham社、Piscataway, NJ, USA）に供した。カラムに吸着した蛋白質を0.5M NaClで溶出した。その後、このラミニン６Bを含む画分を抗α3B抗体（F7）結合Sepharoseカラム（2 ml）に供し、吸着したラミニン６Bを0.05％三フッ化酢酸（TFA）で溶出した。溶出後直ちに、溶出液１ml当たり20 mM Tris-HCl (pH 8.0)の20μｌを混合し、中和した。各フラクションを還元条件のSDS電気泳動で分離し、CBB色素染色およびウェスタングロッティングを行って各構成鎖の発現を分析した。その結果、ラミニン６Bの構成鎖であるα3B、β1、γ1鎖に相当する分子量のバンドを検出した(図６)。蛋白質定量の結果、培養液上清1.5 lあたり約３５０μgのラミニン６Bを精製することができた。

ヒト組換え型ラミニン６Bの細胞接着活性の測定
精製したラミニン６B （LN6B）を用いて、既報の方法により細胞の接着活性を調べた（非特許文献13）。活性の測定にはラミニンに対して応答性が高い、ラット肝由来の上皮系細胞であるBRL細胞（California 大学San Diego校 Gordon H. Sato教授（現在は退職）の供与による）を用いた。比較対象として同じα3B鎖を持ち、β、γ鎖が異なるヒトラミニン５B（ LN5B）（非特許文献１２の方法により作製）、β1、γ1鎖を持ちα鎖が異なるラミニン１（LN1）（マウスEHSラミニン；Chemicon International社）を用いた。 ELISA用96穴プレート(Coster社, Cambridge, MA、USA)に各ラミニンを指定の濃度でコートし、さらに１％牛血清アルブミンでブロッキング処理した。このプレートに無血清DME/F12培地に分散させたBRL細胞（2 × 10⁴ 細胞／ウェル）を播種し、37℃で１時間インキュベートした。非接着細胞を除いた後、接着細胞を蛍光色素（Hoechst 33342）で染色し、蛍光強度を測定した(図７)。その結果、ラミニン５Bが最も高い細胞接着活性を示し、ラミニン６B はラミニン５B とラミニン１のほぼ中間の活性を示した。この結果から、精製したラミニン６Bはラミニン１に比べて約2倍、ラミニン５Bと比べて約2分の1の接着活性を持っていることが明らかになった。

ヒト組換え型ラミニン６Bの細胞分散活性の測定
精製したヒトラミニン６B （LN6B）の細胞運動活性を細胞分散活性として測定した。細胞分散活性はBRL細胞を用いて既報の方法により行った（非特許文献1２）。図７の実施例と同様な方法で、ラミニン６B、ヒトラミニン５B（ LN5B）、マウスラミニン１（LN1）を細胞培養用24穴プレートに指定の濃度でコートした。このプレートに1% FCS含有DME/F12培地に分散させたBRL細胞（7,000細胞／ウェル）を播種し、37℃で40時間インキュベートした。顕微鏡下の異なる3つの視野で、互いに接着せず、分散して存在する細胞の割合を求めた。その結果、ラミニン５Bのみが高い細胞分散活性を示した。ラミニン６Bはラミニン１よりもやや高い細胞分散活性を示した（図８）。

〔実施例２〕ラミニン６Bの血管での発現と機能
ヒトラミニン６Bの組織分布
ラミニンα3B鎖に対するmRNAは皮膚、肺など、広い組織で発現することが知られているが、蛋白質の同定は行われていない。そこで、ヒトラミニンα3B鎖に対する特異的マウスモノクローナル抗体（F7）を作製し、ヒト皮膚での免疫組織染色を行った。フォルマリン固定パラフィン切片はBioChain社（和光純薬、大阪）から購入したものを使用し、免疫組織染色は既報の方法に準じて行った（Kagesato, Y. et al., Jpn. J. Cancer Res. 92:184-192, 2001）。その結果、ラミニンα3B蛋白質のシグナルは、表皮基底膜に加え、結合組織の微小血管の基底膜（矢印）に強く検出された（図９）。

上記のラミニンα3B鎖の分布がラミニン６Bかラミニン５Bによるものか明らかにするために、抗α3A鎖抗体BG5（α3B鎖にも弱く反応）、α3B鎖特異的抗体F7、β3鎖特異的抗体LE12C、γ2鎖特異的抗体D4B5を用いてヒト皮膚組織切片の免疫組織染色を行った（図１０）。その結果、抗α3A鎖抗体BG5は表皮基底膜（矢印）を特異的に染色したが、α3B鎖特異的抗体は表皮基底膜（矢印）に加え、結合組織の微小血管の基底膜（矢印）を強く染色した。一方、β3鎖特異的抗体LE12Cとγ2鎖特異的抗体D4B5は表皮基底膜（矢印）を強く染色したが、血管基底膜（星印の位置）を染色しなかった。以上の結果から、表皮基底膜にはラミニンα3A鎖、α3B鎖、β3鎖、γ2鎖が存在するが、血管基底膜にはα3B鎖のみが存在することが分かった。同様な分布は、食道、乳腺、肺などでも見られた。血管の基底膜には、β1鎖、γ1鎖をもつラミニン８（α4β1γ1；ラミニン411）やラミニン１０（α5β1γ1；ラミニン511）が主要な成分として存在することが知られている（Iivanainen, A. et al., J. Biol. Biochem. 272: 27862-27878, 1997）。従って、血管基底膜に存在するラミニンα3B鎖は、ラミニン５B（α3Bβ3γ2）ではなく、ラミニン６B（α3Bβ1γ1）として存在するものと考えられる。一方、表皮基底膜においては、β3鎖、γ2鎖が存在することから主にラミニン５Bとして存在するものと考えられる。また、ラミニンα3B鎖の広い組織分布はラミニン６Bの血管による発現によるものと考えられる。

ヒト組換え型ラミニン６Bの微小血管内皮細胞に対する増殖促進活性の測定
皮膚の微小血管の基底膜にラミニン６Bが存在することが明らかになったことから、微小血管内皮細胞の増殖に対するラミニン６Bの影響を調べた。ヒト皮膚微小血管内皮細胞（HMVEC）と増殖培地（HuMedia-MvG）はクラボウ社（大阪）から購入した。精製ラミニン６B（LN6B）、ヒトラミニン５B（LN5B）、マウスラミニン１（LN1）を細胞培養用24穴プレートに2 μg/mlの濃度でコートした。牛血清アルブミンによるブロッキングは行わなかった。このプレートに5% FCS含有HuMedia-MvG培地に分散させたHMVEC細胞（5,000細胞／ウェル）を播種し、37℃で４日間培養した後、細胞数を計測した。図１１に示すように、ラミニン５Bとラミニン１では、非処理プレート（None）と比べて増殖促進効果が見られなかったが、ラミニン６Bコートプレートは高い増殖促進効果を示した。この結果から、ラミニン６Bが微小血管内皮細胞に対して高い増殖促進活性を示すことが明らかになった。

考察
本実施例１において、HEK293細胞にラミニン６Bの各サブユニットのcDNAを導入し、薬剤による選択を行うことにより、ヒト組換え型ラミニン６Bを安定して高度に発現する細胞株LN6B-HEKを樹立することができた。さらに、この細胞を大量に培養し、その培養液上清から安定してラミニン６Bを精製する系を確立することができた。これまでに、ラミニン６Bのin vivoおよびin vitroでの発現の報告はない。

今後、今回確立した発現細胞と精製操作を用いて、簡便にヒト組換え型ラミニン６Bを得ることができる。また、今回精製を行ったラミニン６Bはラット肝由来BRL細胞に対して、ラミニン１の約2倍、ラミニン５Bの約2分の1の接着活性をもち、またラミニン５Bに比べて非常に低い細胞分散活性を示すことが明らかになった。このことから、同じラミニンα3B鎖をもっているが、ラミニン６Bとラミニン５Bは互いに異なる性質をもつと考えられる。細胞の増殖や分化に及ぼす影響は、細胞接着活性や細胞運動活性と直接相関するわけではなく、細胞の種類によって異なる。従って、ラミニン６Bとラミニン５Bは多様な細胞の培養基質として補完的に使用できるものと考えられる。

実施例２で示すように、ラミニン５Bは皮膚、食道、肺、乳腺などの上皮基底膜に存在し、一方、ラミニン６Bは血管基底膜に広く存在することが明らかになった。実際、ラミニン６Bは微小血管内皮細胞に対して、ラミニン１やラミニン５Bに比べても高い細胞増殖促進活性をもつことが明らかになった。このような性質は、ラミニン６Bが血管内皮細胞を効率よく培養するための培養基質として役立つことを意味する。またこれらの結果から、ラミニン６Bが心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病、創傷治癒などにおける血管新生促進剤として役立つ可能性が考えられる。

ラミニン６Ｂは細胞の接着や移動を促進することから、将来的に再生医療や細胞工学の分野で利用できる可能性がある。実施例２に示すように、ラミニン６Ｂが血管の基底膜に存在し、血管内皮細の増殖を促進することが明らかになった。したがって、ラミニン６Ｂは血管内皮細胞や他の細胞を安定的に培養するための接着基質として利用でき、また循環器不全などにおける血管新生促進剤として利用できる可能性がある。

本発明のラミニン６Ｂの構造をラミニン５Ａ及び６Ａの構造とともに示す。 β１鎖発現ベクターの作製。 β１鎖発現ベクターの作製。遺伝子組換えラミニン６Ｂの大量発現系の構築。ラミニン６Ｂの構成鎖であるα３Ｂ鎖、β１鎖、γ１鎖全てを外来性遺伝子としてHEK293細胞に導入し、発現させる。ウェスタンブロット法による組換え型LN6Bの発現解析。LN6B-HEKの培養液上清を3〜7.5%ゲル、非還元条件下でのSDS-PAGEによって分離し、α3、β1、γ1抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ヒト組換え型LN6Bの精製。精製したLN6Bを5%ゲル、還元条件下でのSDS-PAGEによって分離し、CBB染色およびLNα3B,β1,γ1抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。ＣＢＢ；Coomasie brilliant blue ヒト組換え型LN6Bの細胞接着活性。ヒト組換え型LN6Bの細胞分散活性。ヒト皮膚組織の抗ラミニンα３Ｂ鎖抗体F7による免疫染色。α3B抗体による免疫染色。血管(矢印)と表皮(矢頭)の基底膜が染色されている。ヒト皮膚組織の抗ラミニンα３Ａ鎖BG5、抗ラミニンα３Ｂ鎖F7、抗ラミニンβ３鎖LE12C、抗ラミニンγ２鎖抗体D4B5による免疫染色。α3A鎖抗体は表皮基底膜（矢印）を特異的に染色したが、α3B鎖抗体は表皮基底膜（矢印）に加え、結合組織の微小血管の基底膜（矢印）を強く染色した。一方、β3鎖抗体とγ2鎖抗体は表皮基底膜（矢印）を強く染色したが、血管基底膜（星印の位置）を染色しなかった。ラミニン６Bのヒト皮膚微小血管内皮細胞HMVECに対する増殖促進活性。ラミニン６B（LN6B）は、ヒトラミニン５B（LN5B）やマウスラミニン１（LN1）に比べてHMVEC細胞の増殖を強く促進した。None、非処理プレートでの増殖。

＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトラミニンα３Ｂ鎖の全長塩基配列を示す。配列番号１の塩基配列中、ファーストメチオニンコドンは１番目〜３番目であり、終止コドンは１００００番目〜１０００２番目である。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトラミニンα３Ｂ鎖の全長アミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトラミニンβ１鎖の全長塩基配列を示す。配列番号３の塩基配列中、ファーストメチオニンコドンは３３６番目〜３３８番目であり、終止コドンは５６９４番目〜５６９６番目である。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトラミニンβ１鎖の全長アミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ヒトラミニンγ１鎖の全長塩基配列を示す。配列番号５の塩基配列中、ファーストメチオニンコドンは３００番目〜３０２番目であり、終止コドンは５１２７番目〜５１２９番目である。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ヒトラミニンγ１鎖の全長アミノ酸配列を示す。
＜配列番号７〜１９＞
配列番号７〜１９は、ヒトラミニンβ１鎖cDNA発現ベクター作製に用いたプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号２０〜３２＞
配列番号２０〜３２は、ヒトラミニンγ１鎖cDNA発現ベクター作製に用いたプライマーの塩基配列を示す。
＜配列番号３３〜４１＞
配列番号３３〜４１は、ヒトラミニンγ１鎖Oligo作製に用いたプライマーの塩基配列を示す。

Claims

以下の(a)又は(b)の蛋白質を含む組成物であって、細胞の培養基質、細胞増殖促進剤、血管新生剤、創傷治癒剤又は移植基材として用いられる前記組成物。
(a)配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するα３Ｂ鎖、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するβ１鎖、および配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するγ１鎖の各サブユニットから構成されるラミニン６Ｂ蛋白質
(b) (a)の蛋白質において、配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号４で示されるアミノ酸配列、および配列番号６で示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列中の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつラミニン６Ｂ蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質
ただし、α３Ｂ鎖に関しては、Ｃ末端側に存在するＬＧ４−５ドメイン（配列番号２の8833番目から10002番目のアミノ酸配列）を含まなくてもよい。