JP5284031B2 - 細胞分散方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞懸濁液中の細胞塊を単離細胞及びみなし単離細胞に分散させる細胞分散方法に関する。

再生医療の分野では、生体から採取した細胞を生体外で培養などして、体内へ移植する手法が採用されている。このような細胞移植療法として、心血管の再生や神経の再生などがあげられる。また、移植に用いられる細胞として、間葉系幹細胞や骨髄細胞などがあげられる。このような移植に用いられる細胞は、生体から採取されて培養又は保存された後に、細胞懸濁液中において、複数個の細胞が相互に接着して細胞塊を形成することが知られている。

一方、細胞移植にスキャフォールドを利用する分野においては、スキャフォールドに播種される細胞が、スキャフォールドの表面のみならず隙間の内部にまで入り込むことが、組織再生の促進において望ましく、ひいては再生すべき損傷部の早期治癒が期待されるとされている（特許文献１参照）。

また、特許文献２には、患者に移植する細胞を含む細胞懸濁液をフィルタなどによりろ過して、大きい細胞凝集塊を除去する方法が開示されている。

他方、特許文献３には、中空糸内部で細胞を培養又は保存するための器具が開示されている。この器具は、細胞懸濁液流通管に中空糸固定部を介して中空糸の束が固定され、その中空糸の束の先端が封止されたものが遠心容器内に挿入されている。細胞懸濁液流通管を通じて中空糸の束に細胞懸濁液が注入されると、中空糸の内部に細胞が堆積される。そして、中空糸が配置された状態で遠心容器が遠心されると、中空糸内の細胞が凝集体を形成する。その後、その細胞の凝集体が中空糸内で培養される。

また、特許文献４には、生体組織マトリックスへ細胞を播種する方法が開示されている。この方法においては、播種すべき細胞が充填された生体分解性中空糸が生体組織片に埋め込まれ、その生体組織片において中空糸から細胞が放出される。

特開２００８−２０６４７７号公報 特表２００４−５２９８７２号公報 特開２００５−１１０６９５号公報 特開２００７−１６８号公報

例えば、間葉系幹細胞を体内に移植して心血管を再生する療法において、間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液をカテーテルなどを用いて再生すべき心血管近傍へ注入すると、細胞塊を形成している間葉系幹細胞が再生すべき心血管に到達する。しかし、細胞塊の状態では、再生しようとする組織中に細胞が付着乃至進入し難く、組織の再生効率がよくないという不具合が想定される。また、心血管に注入された細胞塊が末梢血管まで流れると、末梢血管が梗塞されるおそれもある。

また、トリプシンなどの酵素を用いて細胞塊を解離させたり、特許文献２に記載されているようにフィルタなどでろ過して細胞懸濁液から細胞塊を除去したりすることが考えられる。しかしながら、トリプシンなどの酵素を用いて細胞塊を解離させても、その後に細胞懸濁液が保存されている間に、再び細胞塊が形成されることが見出されている。また、移植の直前にトリプシンなどの酵素処理を施すことは作業が煩雑である。一方、フィルタなどでろ過して細胞塊を除去すると、除去された細胞塊の分だけ細胞懸濁液中の細胞数が減少するという問題がある。特に、細胞塊の割合が多ければ、ろ過後の細胞懸濁液中に含まれる細胞数が極端に少なくなるという問題が生じる。

本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞塊を除去することなく単離細胞及びみなし単離細胞に分散させる簡易な手段を提供することにある。

(1) 本発明に係る細胞分散方法は、複数の細胞が塊となった細胞塊を含む細胞懸濁液を、中空糸に流通させて、その内面が親水性である複数本の中空糸の束に流通させて、細胞懸濁液に含まれる全細胞のうち、単離細胞及びみなし単離細胞が占める割合が１０％以上の細胞懸濁液を得る。

(2) また、本発明は、ポリエーテルスルホン製の中空糸を用いることが好ましい。

(3) また、本発明は、上記細胞懸濁液を上記中空糸に流通させて、細胞懸濁液に含まれる全細胞のうち、細胞塊が占める割合が４０％以下の細胞懸濁液を得る方法として好適である。

(4) 上記細胞はヒトに移植されるものとして好適である。

本発明によれば、細胞塊を細胞懸濁液と共に中空糸に流通させることによって細胞塊が分散されるので、細胞塊を除去することなく単離細胞及びみなし単離細胞に簡易に分散させることができる。したがって、中空糸を流通させた後の細胞懸濁液に含まれる細胞をヒトに移植すると、再生すべき組織への付着乃至進入が向上されて、組織再生の促進が期さされ、ひいては再生すべき損傷部の早期治癒が期待される。

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。

［細胞分散装置］
図１に示されるように、細胞分散装置１０は、細胞懸濁液を貯留し、流出口から細胞懸濁液を流出させるシリンジ１１と、シリンジ１１の流出口に対して液体が流通可能に接続された中空糸１３と、を主として有する。

中空糸１３は、１本であっても複数本が束にされたものであってもよい。本発明に係る貯留部は、中空糸１３の一端から中空糸１３の内部へ細胞懸濁液を注入可能に連結されたシリンジ１１により実現されている。シリンジ１１の流出口である先端には、注射針１２を介して中空糸１３が連結されている。これにより、シリンジ１１内の細胞懸濁液が中空糸１３の内部へ注入可能である。なお、図１に示されるシリンジ１１は、手動で操作されるものであるが、シリンジポンプの如く駆動源を有するものによって、本発明に係る貯留部が実現されてもよい。また、中空糸１３は、注射針１２などのジョイント部材を介さずに直接にシリンジ１１に接続されてもよい。シリンジ１１から細胞懸濁液が中空糸１３の内部へ連続的に注入される圧力によって、中空糸１３内を細胞懸濁液が流通して、中空糸１３の先端から細胞懸濁液が流出される。この中空糸１３の内部を細胞塊が細胞懸濁液と共に流通する過程において、細胞懸濁液に含まれる細胞塊が分散されて単離細胞及びみなし単離細胞とされる。

細胞懸濁液に含まれる細胞は、再生医療においてヒトに移植される細胞が好適である。細胞の由来は特に限定されず、ヒト、マウス、ラットなどの任意の哺乳動物由来のものが使用でき、例えば、ヒトの肝臓や腎臓などの臓器細胞、幹細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、神経細胞など再生医療に用いられる種類の細胞があげられる。また、哺乳動物から採取された細胞は、必要に応じて、トリプシンなどの酵素を用いて処理が施されてもよい。また、細胞は、初代培養細胞であっても株化細胞であってもよい。哺乳動物から採取された細胞は、細胞培養液や生体適合性ゾル又はゲルなどの生理学的に許容される液体中に分散される。このように細胞が分散された液体が、本発明において細胞懸濁液と称される。

細胞懸濁液中において、前述された細胞は細胞塊を形成している。細胞塊とは、複数個の細胞が相互に接着等することにより一つの塊をなしている状態をいい、単離細胞及びみなし単離細胞に相対する概念である。単離細胞とは、他の細胞と接着せずに独立した状態にある一つの細胞をいう。みなし単離細胞とは、１，２個の他の細胞と接着している、或いは接着力が弱く簡単に離れてしまう程度に集合している状態の数個の細胞の群をいう。細胞塊と単離細胞及びみなし単離細胞は、集合してる細胞数によって区別されてもよいが、細胞懸濁液を光学顕微鏡などで拡大して観察した平面像において、細胞として一つのまとまりをなす領域の面積によって区別されてもよい。例えば、細胞として一つのまとまりをなす領域の面積が３００μｍ^２未満であれば単離細胞及びみなし単離細胞とし、３０００μｍ^２より広ければ細胞塊とする。

中空糸１３は、合成樹脂などがストロー形状に成形されたものである。中空糸１３を形成する素材として、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、再生セルロースなどがあげられる。本発明において、中空糸１３は、微細孔を有する膜からなる必要はない。一方、中空糸１３の内部を細胞懸濁液が流通されるときに、微細孔などから液体成分が滲出するのであれば、中空糸１３の外側の他の部材で覆うなどして微細孔を閉塞し、細胞懸濁液の液体成分が滲出しないようにすることが好ましい。また、中空糸１３の厚みは、前述された各素材からなる中空糸１３において、細胞懸濁液を流通させることにより生じる圧力に耐える機械強度を有するように設定される。

中空糸１３において細胞懸濁液と接触する内面は親水性であることが好ましい。中空糸１３の内面が親水性であることにより、中空糸１３の内部を流通する細胞懸濁液が乱流とならず、いわば層流の如く液体成分が流れ、この流れによって細胞塊が流れ方向へ分散されて単離細胞及びみなし単離細胞とされる。この親水性は、例えば、前述された中空糸１３の樹脂素材に親水化剤が添加されることによって実現されても、中空糸１３の内面に親水性物質がコーティングされることによって実現されてもよい。

中空糸１３の内径は、細胞懸濁液に含まれる細胞塊が流通可能な程度が選択され、好ましくは２０〜１０００μｍであり、さらに好ましくは５０〜５００μｍ程度である。中空糸１３の内径がこの範囲内にあれば、大きな細胞塊であっても中空糸１３の内部へ流入され、かつ中空糸１３の内部において細胞塊が詰まることがない。また、細胞塊を分散させるに適した細胞懸濁液の流れが生じ得る。

中空糸１３の長さは、その内部を細胞懸濁液が流通する過程において細胞塊が分散できる程度の長さが選択され、好ましくは１〜２００ｃｍであり、さらに好ましくは１０〜１００ｃｍである。中空糸１３の長さがこの範囲内であれば、細胞塊が分散されやすく、かつ操作性に優れる。また、中空糸１３の内部を細胞懸濁液を所望の流速で流通させるために、ポンプなどに大きな動力を必要としない。

［細胞分散方法］
本発明に係る細胞分散方法では、複数の細胞が塊となった細胞塊を含む細胞懸濁液を、中空糸１３に流通させて細胞塊を分散させる。なお、複数本の中空糸１３の束に細胞懸濁液を流通させてもよい。

細胞懸濁液は、前述されたように哺乳動物から採取された細胞の塊を含んでいる。この細胞懸濁液は、シリンジ１１内に貯留される。シリンジ１１のプランジャ１４を手動で操作することにより、シリンジ１１内の細胞懸濁液が注射針１２を介して中空糸１３の内部空間へ注入される。中空糸１３の内部における細胞懸濁液の流速は、シリンジ１１のプランジャ１４を操作する速さにより調整される。そして、中空糸１３の先端から流出された細胞懸濁液を容器等に貯留させることにより、単離細胞及びみなし単離細胞を含む細胞懸濁液が得られる。

得られた細胞懸濁液には、その中に含まれる全細胞のうち、単離細胞及びみなし単離細胞が占める割合が１０％以上であることが好ましく、特に好ましくは、２０％以上、最も好ましくは３０％以上である。単離細胞及びみなし単離細胞が占める割合が高いほど、再生医療において、分散された細胞を移植することができ、再生すべき組織への付着乃至進入が向上される。

また、得られた細胞懸濁液には、その中に含まれる全細胞のうち、細胞塊が占める割合が４０％以下であることが好ましく、特に好ましくは、２０％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。細胞塊が占める割合が低いほど、再生医療において、単離細胞及びみなし単離細胞、或いは比較的小さな細胞の集合である細胞群を移植することができ、再生すべき組織への付着乃至進入が向上される。

［実施例１］
（細胞分散装置）
接触角７８度のポリエーテルスルホン製の中空糸膜を用いて、内径２００μｍ、長さ１０００ｍｍの中空糸とし、その中空糸の表面を樹脂でコーティングして微細孔を封止して、２２Ｇの注射針（テルモ製：商品名「ネオラス」）の先端に接着剤を用いて接続し、その注射針をシリンジ（テルモ製：商品名「テルモシリンジ１ｍＬツベルクリン用」）に装着して細胞分散装置を得た。この細胞分散装置をエチレンオキサイドガスで滅菌処理した。

（細胞懸濁液）
Ｌ９２９細胞をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ製ＰＢＳ：ｐＨ７．４）中に２．４×１０^６cell／100μLに分散して細胞懸濁液とした。Ｌ９２９細胞の大きさは約１０μｍ程度であり、その断面積は約３００μｍ^２である。このＬ９２９細胞が後述される細胞塊（１０個以上の細胞が相互に接着した領域）を形成したとすれば、その断面積は３０００μｍ^２以上になると想定される。

（細胞分散方法）
前述された細胞懸濁液１００μＬを細胞分散装置のシリンジに貯留して、手操作によって注射針を介して中空糸から流出させた。中空糸から流出された細胞懸濁液は、ポリプロピレン製容器（アシスト製滅菌保存チューブ）に貯留して、後述される評価試験に供した。

［実施例２］
中空糸膜を接触角５３度のセルロースジアセテート製とした他は、前述された実施例１と同様にして細胞分散装置を得た。そして、実施例１と同じ細胞懸濁液を用いて細胞分散方法を実施した。

［実施例３］
中空糸膜を接触角６７度のセルローストリアセテート製とした他は、前述された実施例１と同様にして細胞分散装置を得た。そして、実施例１と同じ細胞懸濁液を用いて細胞分散方法を実施した。

［実施例４］
細胞懸濁液のＬ９２９細胞を３．０×１０^６cell／100μLとした他は、実施例１と同様にして細胞分散方法を実施した。

［実施例５］
細胞分散装置において１８Ｇの注射針（ニプロ製：商品名「プラント針」）を用い、その注射針の先端に５本の中空糸を束にして接続した他は、実施例４と同様にして細胞分散方法を実施した。

［細胞懸濁液の観察］
前述された各実施例において細胞分散方法が実施された後の細胞懸濁液を、各ウェルに５％グルタルアルデヒドが５０００μＬずつ注入された６wellプレート中に２０μＬ加えて、光学顕微鏡（ニコン製：商品名「ＴＥ２０００−Ｕ、倍率４０倍）にて観察した。また、細胞分散方法を実施する前の細胞懸濁液を比較例として同様に観察した。その結果を図２及び図３に示す。

［単離細胞及びみなし単離細胞の割合、細胞塊の割合］
前述された細胞懸濁液の観察において得られた２９００μｍ×２３００μｍの画像中における単離細胞及びみなし単離細胞の割合、並びに細胞塊の割合を、次の手順にしたがって算出した。まず、画像処理ソフト（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）開発：ＩｍａｇｅＪ ver.1.40g）によって細胞が一つのまとまりをなす領域の面積を測定した。各領域の面積を表計算ソフト（マイクロソフト製：Ｅｘｃｅｌ２００４ for Mac）に書き写した後、各領域を構成する細胞の数を算出し、さらに、前述の画像中における全細胞数を集計した。最終的に、各領域の面積が３００μｍ^２未満であれば単離細胞及びみなし単離細胞とし、３０００μｍ^２より広ければ細胞塊とすることで、前述の画像中における全細胞数に対する単離細胞及びみなし単離細胞の割合、並びに細胞塊の割合を算出した。得られた単離細胞及びみなし単離細胞の割合、並びに細胞塊の割合を図４及び図５に示す。

［細胞分散方法実施後の細胞数］
前述された各実施例１〜３が実施された後の細胞懸濁液中の細胞数をカウントした。また、細胞分散方法を実施する前の細胞懸濁液中の細胞数を比較例としてカウントした。その結果を図６に示す。

図２に示されるように、比較例においては細胞が細胞塊として塊をなして広範な黒い影をなしていることがわかる。これに対し、実施例１〜３では、比較例の如き広範な黒い影がなく、比較的小さな黒い影が分散して存在していることが確認された。特に、実施例１において、黒い影が小さく均等に分散していることが確認された。

図３に示されるように、実施例１に比べて実施例４，５における黒い影が若干大きいが、図２に示される比較例の如き広範な黒い影は実施例１，４，５のいずれにも確認されず、いずれにおいても比較的小さな黒い影が分散して存在していることが確認された。

図４に示されるように、細胞懸濁液中の全細胞に対する単離細胞及びみなし単離細胞の割合が、比較例では、１０％未満であるのに対し、各実施例１〜３ではいずれも１０％以上であった、特に実施例１，３では２０％以上であり、実施例１が３０％以上と最も単離細胞及びみなし単離細胞の割合が多かった。

図４に示されるように、細胞懸濁液中の全細胞に対する細胞塊の割合が、比較例では、７０％以上であるのに対し、各実施例１〜３ではいずれも４０％以下であった、特に実施例１，３では２０％以下であり、実施例１がほぼ０％近くと最も細胞塊の割合が少なかった。

図５に示されるように、単離細胞及びみなし単離細胞の割合は、実施例４に比べて実施例５が若干低いが、いずれも１０％以上であった。また、細胞塊の割合は、実施例４に比べて実施例５が若干高いが、いずれも４０％以下であった。

図６に示されるように、各実施例により細胞分散方法を実施することによって、実施前の細胞懸濁液中の細胞数（２．４×１０^６cell／100μL）に対して実施例１，２では若干減少してるが、図４に示されるように、実施前の細胞懸濁液中に細胞塊が７０％以上の割合で存在していたことを考慮すると、細胞塊が除去されて単離細胞及びみなし単離細胞の割合が増加したものではないことが確認された。

前述されたように、各実施例の細胞分散装置を用いて細胞分散方法が実施されることによって、細胞塊が占める割合が減少すると共に、単離細胞及びみなし単離細胞の割合が増加した。これにより、各実施例において、細胞懸濁液に含まれる細胞塊が除去されることなく単離細胞及びみなし単離細胞、或いはこれらに近い状態にまで分散されたことが確認された。

図１は、本発明の実施形態に係る細胞分散装置１０の構成を示す斜視図である。 図２は、実施例１〜３及び比較例により得られた細胞懸濁液及び細胞分散方法を実施していない細胞懸濁液の観察結果を示す図である。 図３は、実施例１，４，５により得られた細胞懸濁液の観察結果を示す図である。 図４は、実施例１〜３及び比較例により得られた細胞懸濁液における単離細胞及びみなし単離細胞の割合、及び細胞塊の割合を示す図である。 図５は、実施例４，５により得られた細胞懸濁液における単離細胞及びみなし単離細胞の割合、及び細胞塊の割合を示す図である。 図６は、実施例１〜３及び比較例により得られた細胞懸濁液中の細胞数を示す図である。

１０・・・細胞分散装置
１１・・・シリンジ（貯留部）
１３・・・中空糸

Claims (4)

1. 複数の細胞が塊となった細胞塊を含む細胞懸濁液を、その内面が親水性である複数本の中空糸の束に流通させて、細胞懸濁液に含まれる全細胞のうち、単離細胞及びみなし単離細胞が占める割合が１０％以上の細胞懸濁液を得る細胞分散方法。
2. ポリエーテルスルホン製の中空糸を用いる請求項１に記載の細胞分散方法。
3. 上記細胞懸濁液を上記中空糸に流通させて、細胞懸濁液に含まれる全細胞のうち、細胞塊が占める割合が４０％以下の細胞懸濁液を得る請求項１又は２に記載の細胞分散方法。
4. 上記細胞がヒトに移植されるものである請求項１から３のいずれかに記載の細胞分散方法。