JP5364430B2

JP5364430B2 - 細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法

Info

Publication number: JP5364430B2
Application number: JP2009104025A
Authority: JP
Inventors: 尊己芝崎; 佳弘島田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2009-04-22
Filing date: 2009-04-22
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2029-04-22
Also published as: JP2010256077A

Description

本発明は、細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法に関する。

バイオテクノロジーの分野では、様々な条件下での種々の生細胞の反応を解明する目的で、多数の生細胞を対象とした統計解析が行なわれている。このような目的のため、従来、フローサイトメーターと呼ばれる装置が使用されてきたが、近年、顕微観察装置を用いて多数の生細胞の画像を取得し、取得した画像を解析することにより統計解析結果を得るという手法が用いられてきている。

ところで、実際に様々な条件下での生細胞の反応を統計解析するには、マイクロプレートなどの容器内で培養条件を制御して培養された非常に多くの生細胞を解析対象とする必要がある。このため、細胞画像を取得するための顕微観察装置としては、マイクロプレートなどの容器を下方より観察する倒立顕微鏡型の光学配置を採用し、さらに、撮像視野の変更、焦点合わせ、撮像などの、画像取得に関する一連の動作を自動化した装置が望まれる。

従来、このような顕微観察装置として、例えば、次の特許文献１に記載の細胞スキャニングシステムがある。

特開２００２−３５５０９０号公報

特許文献１に記載の細胞スキャニングシステムは、図４に示すように、電動フィルターホイール５０を介して励起波長を切り替えることで、観察する蛍光波長を切り替え可能な倒立型蛍光顕微鏡５１と、サンプルを収容したマイクロウェルプレート５４を載置しＸＹ方向に移動可能なＸＹステージ５３と、倒立型蛍光顕微鏡５１に備えられていて、倒立型
蛍光顕微鏡５１の対物レンズの焦点合わせを行うためのＺ軸焦点駆動装置５５と、ＸＹステージ５３の移動を手動で操作可能なジョイスティック５６と、高解像度デジタルカメラ５７と、カメラ電源装置５８と、自動制御装置５９と、中央演算装置６０と、所定のソフトウェアを有するパーソナルコンピュータ６１と、ディスプレイ６２を有して構成されている。図４中、５２は光源である、

このように構成された特許文献１に記載の細胞スキャニングシステムでは、細胞解析をおおむね次の手順で行うようになっている。
まず、オートスキャンを開始する前に、ユーザが、使用する生物学的標識に適合するフィルター設定及びチャネルを指定し、さらに検体輝度に適合するように露光時間などのカメラの設定を調整する。さらに、マイクロウェルプレート５４におけるスキャン対象とすべきウェル、各ウェルにおける解析対象とすべき視野の数（種類）、および細胞の種類を指定する。

次に、ユーザは、焦点合わせの方法を次の２つの方法から選択する。第１の方法は、細胞スキャニングシステムが、オートフォーカス手順を用いて、スキャンするように指定されたマイクロウェルプレート５４の領域を自動的にプレフォーカスするというものである。第２の方法は、ユーザがスキャンする領域を定義するための３つの参照点を指定し、細胞スキャニングシステムが、指定された参照点をスキャニング領域としてプレフォーカスするというものである。そして、オートスキャン中にこれらの参照点から最小二乗法により“焦点面モデル”が計算され、各ウェルの焦点が、スキャン中の“焦点面モデル”から内挿することによって推定されるようになっている。

オートスキャンを開始すると、細胞スキャニングシステムは、マイクロウェルプレート５４全体におけるウェルのスキャンパターン、及び各ウェルにおける撮像視野のスキャンパターンを決定する。そして、マイクロウェルプレート５４は、ソフトウェアの制御を介して、自動的にＸＹステージ５３を所定のウェルから次のウェルへ、また各ウェル内の所定視野から次の視野へ移動することによって螺旋状にスキャンされるようになっている。さらに、細胞スキャニングシステムでは、各視野位置において、Ｚ軸焦点駆動装置５５がオートフォーカス手順を用いてサンプルの焦点を調整し、電動フィルターホイール５０がフィルター選択を制御し、ＣＣＤカメラ６０がサンプルを撮像し、パーソナルコンピュータ６１が撮像されたサンプルの画像を収集して解析する。そして、ディスプレイ６２が、分析された細胞数、現在分析中のウェル、各独立波長の画像、及び各ウェルに対するスクリーニングの結果を含むスキャン状態などを動的に表示する。

このとき、オートフォーカス手順は、一般的には、各ウェルの第１撮像視野を対象として実行し、その後は、各ウェル内において１回当たり４〜５の撮像視野を対象として、ユーザが選択した頻度（回数）に応じて実行するようになっている。また、オートフォーカス手順は、事前に計算された焦点面モデルから内挿することによって、開始時のＺ軸点を計算する。この設定点の上方又は下方で、オートフォーカス手順は、多数の様々な位置に機械的にＺ軸を移動させ、各位置で画像を収集し、各画像のコントラストを推定する計算された焦点スコアの最大値を検出する。そして、最大焦点値を持つ画像のＺ位置を当該撮像視野における焦点として決定する。

しかしながら、特許文献１に記載の細胞スキャニングシステムにおいては、ウェルの全体を走査する際に、ウェルの外周部を含む撮像視野においては、ウェルの側壁部が視野内に入るため、画像のコントラストを正しく計算できなくなる。そのような場合、この撮像視野においては、オートフォーカス手順による焦点合わせが不可能となる。
また、特許文献１に記載の細胞スキャニングシステムにおいては、最小二乗法によって３点の参照点から算出した“焦点面モデル”を用いて、オートフォーカスの開始点を推定するようになっているが、マイクロウェルプレートの製造誤差は、平面に近似できる程度のものでない場合が多い。
したがって、特許文献１に記載の細胞スキャニングシステムのような従来の技術によっては、ウェル外周部を含む撮像視野で焦点が全く合わない画像になるため、解析結果に悪影響を与えてしまい易い。

本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、ウェル全体を走査する場合において、焦点合わせに失敗する撮像視野に対しても、概ね焦点が合った画像を取得することが可能な細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明による細胞画像取得装置は、対物レンズを備えた撮像装置と、細胞を収容したウェルを前記撮像装置の撮像位置に搬送する搬送装置と、前記撮像位置に搬送された前記ウェル内の対象物の合焦状態を検出する合焦検出装置と、前記合焦検出装置で検出した合焦状態に基づき、前記対物レンズの焦点を調節する合焦装置を有し、前記ウェル内の細胞の画像を自動的に取得する細胞画像取得装置において、前記撮像装置が、前記ウェルを複数の撮像視野に分けて撮像し、前記搬送装置が、前記ウェルの中心領域からその外側領域へ、前記撮像視野が螺旋状に移動するように、該ウェルを順次搬送し、前記合焦検出装置が、撮像視野ごとに焦点位置の検出を行い、焦点位置の検出に成功した撮像視野の焦点位置を所定の記憶領域に記憶し、さらに、所定の撮像視野において焦点位置の検出に失敗した場合、前記合焦検出装置が、前記所定の記憶領域に記憶されている前記撮像視野の焦点位置のうち、前記焦点位置の検出に失敗した所定の撮像視野から前記ウェルの中心領域に向かって最も近傍に位置する撮像視野の焦点位置を、該所定の記憶領域から抽出し、前記合焦装置が、前記抽出された撮像視野の焦点位置に前記対物レンズの焦点を合わせることを特徴としている。

本発明による細胞画像取得方法は、搬送装置が細胞を収容したウェルの中心領域からその外側領域へ、撮像視野が螺旋状に移動するように、該ウェルを順次搬送し、合焦検出装置が撮像視野ごとに焦点位置を検出し、合焦装置が前記撮像装置に備わる対物レンズの焦点を前記検出された焦点位置に合わせ、前記焦点合わせされた対物レンズの焦点で前記撮像装置が前記ウェルの撮像視野を撮像する細胞画像取得方法であって、前記撮像装置が、前記ウェルを複数の撮像視野に分けて撮像するステップと、前記搬送装置が、前記ウェルの中心領域からその外側領域へ、前記撮像視野が螺旋状に移動するように、該ウェルを順次搬送するステップと、前記合焦検出装置が、撮像視野ごとに焦点位置の検出を行い、焦点位置の検出に成功した撮像視野の焦点位置を所定の記憶領域に記憶するステップと、所定の撮像視野において焦点位置の検出に失敗した場合、前記合焦検出装置が、前記所定の記憶領域に記憶されている前記撮像視野の焦点位置のうち、前記焦点位置の検出に失敗した所定の撮像視野から前記ウェルの中心領域に向かって最も近傍に位置する撮像視野の焦点位置を、該所定の記憶領域から抽出し、前記合焦装置が、前記抽出された撮像視野の焦点位置に前記対物レンズの焦点を合わせるステップ、を有することを特徴としている。

本発明によれば、ウェル全体を走査する場合において、焦点合わせに失敗する撮像視野に対しても、概ね焦点が合った画像を取得することが可能な細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法が得られる。

本発明の細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法において、マイクロウェルプレートを構成する１つのウェルに対して設定した、複数の撮像視野及び撮像視野の走査方向の一例を示す説明図である。本発明の第１実施形態にかかる細胞画像取得装置の概略構成を示す説明図である。第１実施形態の細胞画像取得装置を用いた細胞解析処理手順を示すフローチャートである。特許文献１に記載の細胞スキャニングシステムの概略構成を示す説明図である。

図１は本発明の細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法において、マイクロウェルプレートを構成する１つのウェルに対して設定した、複数の撮像視野及び撮像視野の走査方向の一例を示す説明図である。
本発明の細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法では、例えば、図１に示すように、マイクロウェルプレートを構成する１つのウェル１ａの中心領域の撮像視野から走査を開始し、走査を進めるにしたがってウェル１ａの外側領域へ撮像視野が螺旋状に移動するように、搬送装置（図２に示すＸＹステージ３）での搬送が制御されるように構成する。このようにすると、走査の初期段階の撮像視野には焦点合わせの障害となるウェル側壁は含まれないため、合焦検出装置からの焦点検出用の補助光を撮像視野に向けて照射したときに、補助光が対象物を照射し、対象物からの反射光が検出されるので、オートフォーカス（ＡＦ）を成功させることができる。走査が進行し、撮像視野がウェル１ａの外側領域を含む領域に到達すると、撮像視野内にウェル側壁が含まれるようになる。このような場合、合焦検出装置からの焦点検出用の補助光を撮像視野に向けて照射したときに、対象物からの反射光が正しく検出されないので、オートフォーカスは成功しない。

ここで、本発明の細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法では、合焦検出装置が、焦点位置の検出に成功した撮像視野の焦点位置を所定の記憶領域に記憶し、さらに、所定の撮像視野において焦点位置の検出に失敗した場合、合焦検出装置が、所定の記憶領域に記憶されている撮像視野の焦点位置のうち、焦点位置の検出に失敗した所定の撮像視野からウェルの中心領域に向かって最も近傍に位置する撮像視野の焦点位置（Ｚ座標）を、所定の記憶領域から抽出し、合焦装置が、抽出された撮像視野の焦点位置に対物レンズの焦点を合わせるようにしている。
このようにすれば、対象物が存在せず、オートフォーカスに失敗する撮像視野に対しても、概ね焦点が合った画像を得ることができるようになる。

第１実施形態
図２は本発明の第１実施形態にかかる細胞画像取得装置の概略構成を示す説明図である。
第１実施形態の細胞画像取得装置は、細胞を収容するマイクロウェルプレート１と、対物レンズ２と、マイクロウェルプレート１を載置し対物レンズ２の光軸に垂直な平面内でマイクロウェルプレート１を搬送して撮像位置の位置決めを行うＸＹステージ３と、対物レンズ３を経由して焦点検出用の補助光を、撮像位置に搬送された対象物に投射し、その反射光を受光して対象物の焦点位置を検出する合焦検出装置４と対物レンズ２の焦点を合焦検出装置４で検出された焦点位置に合わせる合焦装置（図示省略）とを備えたオートフォーカス手段と、サンプルを照明するための光源５と、光源５からの照明光の波長を選択するためのフィルター６と、サンプルからの光の波長のうち撮像に用いる波長を選択するためのフィルター７と、光源５からの照明光とサンプルからの光を分離するためのダイクロイックミラー８と、対物レンズ２からの光束を集光する結像レンズ９と、サンプルの像をデジタル信号に変換するためのＣＣＤカメラ１０と、ＸＹステージ３、オートフォーカス手段の駆動を制御するとともに、ＣＣＤカメラ１０からの画像データを処理するためのパーソナルコンピュータ１１と、モニター１２を備えて構成されている。

さらに、第１実施形態の細胞画像取得装置は、パーソナルコンピュータ１１を、合焦検出装置４が、焦点位置の検出に成功した撮像視野の焦点位置を所定の記憶領域（図示省略）に記憶し、合焦装置（図示省略）が、検出された撮像視野の焦点位置に対物レンズ２の焦点を合わせるとともに、所定の撮像視野において焦点位置の検出に失敗した場合、所定の記憶領域に記憶されている撮像視野の焦点位置のうち、焦点位置の検出に失敗した所定の撮像視野からウェルの中心領域に向かって最も近傍に位置する撮像視野の焦点位置（Ｚ座標）を、所定の記憶領域（図示省略）から抽出し、合焦装置（図示省略）が、抽出された撮像視野の焦点位置に対物レンズ２の焦点を合わせるオートフォーカス駆動制御手段として機能させる制御プログラムを備えている。

図３は第１実施形態の細胞画像取得装置を用いた細胞解析処理手順を示すフローチャートである。
第１実施形態の細胞画像取得装置を用いて細胞解析を行うに先立ち、ユーザは、第一段階として、試験すべき条件でマイクロウェルプレート１の少なくとも１つのウェルに細胞を培養し、さらに当業者に一般的に知られている方法によって、例えば、細胞核、細胞内タンパクなどの観察すべき対象を蛍光標識する。
次いで、ユーザは、第二段階として、培養し、蛍光標識した細胞が収容されたマイクロウェルプレート１を、ＸＹステージ３に載置する。
次いで、ユーザは、第三段階として、細胞画像取得装置による走査を開始させる前に、次の撮像条件を設定する。先ず、走査対象とするウェル、及びウェル内の撮像視野を指定することで、走査パターンを設定する。ここで、第１実施形態の細胞画像取得装置においては、図１に示したように、走査パターンとして、ウェルの中心領域を走査開始時の撮像視野として設定し、ウェルの中心領域からその外側領域へ、撮像視野が螺旋状に順次移動するように、ＸＹステージ３によるマイクロウェルプレート１の搬送動作を設定する。また、ユーザは、撮像条件（露光条件、照明条件、観察条件）を設定し、さらに、オートフォーカス条件（焦点位置探索範囲）を設定する（ステップＳ１０１）。
第四段階として、ユーザは、図示省略したスタートボタンを押下等することによって、細胞画像取得装置に対し走査開始を指示する。（ステップＳ１０２）

走査開始が指示されると、細胞画像取得装置は、パーソナルコンピュータ１１を介して、マイクロウェルプレート１が載置されたＸＹステージ３を駆動制御し、撮像位置に所定のウェルにおける所定の撮像視野（当該ウェルにおいて最初の走査である場合は、当該ウェルの中央領域の撮像視野）が位置するように搬送させ、その位置で停止させる（ステップＳ１０３）。
次いで、細胞画像取得装置は、パーソナルコンピュータ１１に備わるオートフォーカス駆動制御手段を介して、オートフォーカスによる（合焦検出装置４による焦点検出及び合焦装置（図示省略）による対物レンズ２の焦点合わせ）を実行する（ステップＳ１０４）。
合焦検出装置４が、焦点検出に成功した場合、焦点位置の検出に成功した撮像視野の焦点位置を所定の記憶領域（図示省略）に記憶する。また、合焦装置（図示省略）が、検出された撮像視野の焦点位置に対物レンズ２の焦点を合わせる。次いで、ＣＣＤカメラ１０が撮像を行い、取得した画像を保存する（ステップＳ１０５）
一方、合焦検出装置４が、焦点検出に失敗した場合、所定の記憶領域に記憶されている撮像視野の焦点位置のうち、焦点位置の検出に失敗した現在の撮像視野からウェルの中心領域に向かって最も近傍に位置する撮像視野の焦点位置（Ｚ座標）を、所定の記憶領域（図示省略）から抽出し、合焦装置（図示省略）が、抽出された撮像視野の焦点位置を、当該撮像視野の焦点位置（Ｚ座標）として、対物レンズ２の焦点を合わせる。次いで、ＣＣＤカメラ１０が撮像を行い、取得した画像を保存する（ステップＳ１０６）
細胞画像取得装置は、このステップＳ１０３〜ステップＳ１０６の処理を、走査パターンが設定した全てのウェルにおける全ての撮像視野に対して撮像を完了するまで、繰り返す（ステップＳ１０７）。
全てのウェルにおける全ての撮像視野に対する撮像完了後、細胞画像取得装置は、撮像した画像に対して、所定の画像解析を実施し、細胞解析に必要なデータを抽出しモニター１２に表示する（ステップＳ１０８）。

第１実施形態の細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法によれば、ウェルの中心領域の撮像視野から走査を開始するため、オートフォーカスが成功する焦点位置が必ず得られる。また、オートフォーカスに失敗した場合、所定の記憶領域に記憶されているオートフォーカスに成功した撮像視野の焦点位置のうち、オートフォーカスに失敗した撮像視野からウェルの中心領域に向かって最も近傍に位置する撮像視野の焦点位置を、所定の記憶領域から抽出して、オートフォーカスに失敗した撮像視野の焦点位置として用いるようにしたので、オートフォーカス手段を介して焦点を検出することができない撮像視野が存在しても、その撮像視野に対して焦点が概ね合った良好な画像を得ることができる。

本発明の細胞画像取得装置及び細胞画像取得方法は、顕微観察装置を用いて多数の生細胞の画像を取得し、取得した画像を解析することにより統計解析結果を得るバイオテクノロジーの分野に有用である。

１マイクロウェルプレート
１ａウェル
２対物レンズ
３ＸＹステージ
４合焦検出装置
５光源
６、７フィルター
８ダイクロイックミラー
９結像レンズ
１０ＣＣＤカメラ
１１パーソナルコンピュータ
１２モニター
５０電動フィルターホイール
５１倒立型蛍光顕微鏡
５２光源
５３ＸＹステージ
５４マイクロウェルプレート
５５Ｚ軸焦点駆動装置
５６ジョイスティック
５７高解像度デジタルカメラ
５８カメラ電源装置
５９自動制御装置
６０中央演算装置
６１パーソナルコンピュータ
６２ディスプレイ

Claims

対物レンズを備えた撮像装置と、細胞を収容したウェルを前記撮像装置の撮像位置に搬送する搬送装置と、前記撮像位置に搬送された前記ウェル内の対象物の合焦状態を検出する合焦検出装置と、前記合焦検出装置で検出した合焦状態に基づき、前記対物レンズの焦点を調節する合焦装置を有し、前記ウェル内の細胞の画像を自動的に取得する細胞画像取得装置において、
前記撮像装置が、前記ウェルを複数の撮像視野に分けて撮像し、
前記搬送装置が、前記ウェルの中心領域からその外側領域へ、前記撮像視野が螺旋状に移動するように、該ウェルを順次搬送し、
前記合焦検出装置が、撮像視野ごとに焦点位置の検出を行い、焦点位置の検出に成功した撮像視野の焦点位置を所定の記憶領域に記憶し、さらに、
所定の撮像視野において焦点位置の検出に失敗した場合、前記合焦検出装置が、前記所定の記憶領域に記憶されている前記撮像視野の焦点位置のうち、前記焦点位置の検出に失敗した所定の撮像視野から前記ウェルの中心領域に向かって最も近傍に位置する撮像視野の焦点位置を、該所定の記憶領域から抽出し、前記合焦装置が、前記抽出された撮像視野の焦点位置に前記対物レンズの焦点を合わせることを特徴とする細胞画像取得装置。
搬送装置が細胞を収容したウェルの中心領域からその外側領域へ、撮像視野が螺旋状に移動するように、該ウェルを順次搬送し、合焦検出装置が撮像視野ごとに焦点位置を検出し、合焦装置が前記撮像装置に備わる対物レンズの焦点を前記検出された焦点位置に合わせ、前記焦点合わせされた対物レンズの焦点で前記撮像装置が前記ウェルの撮像視野を撮像する細胞画像取得方法であって、
前記撮像装置が、前記ウェルを複数の撮像視野に分けて撮像するステップと、
前記搬送装置が、前記ウェルの中心領域からその外側領域へ、前記撮像視野が螺旋状に移動するように、該ウェルを順次搬送するステップと、
前記合焦検出装置が、撮像視野ごとに焦点位置の検出を行い、焦点位置の検出に成功した撮像視野の焦点位置を所定の記憶領域に記憶するステップと、
所定の撮像視野において焦点位置の検出に失敗した場合、前記合焦検出装置が、前記所定の記憶領域に記憶されている前記撮像視野の焦点位置のうち、前記焦点位置の検出に失敗した所定の撮像視野から前記ウェルの中心領域に向かって最も近傍に位置する撮像視野の焦点位置を、該所定の記憶領域から抽出し、前記合焦装置が、前記抽出された撮像視野の焦点位置に前記対物レンズの焦点を合わせるステップ、を有することを特徴とする細胞画像取得方法。