JP7651826B2 - Oligonucleotides for detecting SARS-CoV-2 and their uses - Google Patents
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Description
本発明は、検体試料中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を迅速、確実かつ簡便に検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。更に、本発明は、該オリゴヌクレオチドを用いて、検体試料中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法及びその方法に用いるための試薬・キット等に関する。 The present invention relates to an oligonucleotide for quickly, reliably, and simply detecting SARS-CoV-2 contained in a specimen sample. Furthermore, the present invention relates to a method for detecting SARS-CoV-2 contained in a specimen sample using the oligonucleotide, and to reagents, kits, etc. for use in the method.
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年１２月に中国湖北省武漢市に初めて確認された新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因ウイルスである。これにて人に対して病原性をもつコロナウイルスは７種類となったが、その内４種（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）は一般の風邪の原因の１０～１５％を占め、多くは軽症である。他の２種類のウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（２００２）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（２０１２））は, ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳを引き起こし、ＭＥＲＳは中東地域で散発的に発生が続いている。そして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９は、２０１９年１２月以降、パンデミック（世界的大流行）をもたらしている。 SARS-CoV-2 is the causative virus of the new coronavirus disease (COVID-19), which was first identified in Wuhan, Hubei Province, China in December 2019. There are now seven types of coronaviruses pathogenic to humans, four of which (HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, and HCoV-HKU1) account for 10-15% of common cold cases, most of which are mild. The other two viruses (SARS-CoV (2002) and MERS-CoV (2012)) cause SARS and MERS, with MERS continuing to occur sporadically in the Middle East. COVID-19, caused by SARS-CoV-2, has been a pandemic (global epidemic) since December 2019.
ＣＯＶＩＤ－１９の症状としては、無症状から上気道炎、肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等、幅広い病態を呈する。特に高齢者や基礎疾患のある方が感染すると重症化するリスクが高く、これまでに多くの死者が出ている。一方、罹患しても約８割の方は軽症で経過し、治癒する例も多いことが報告されている。但し、このような無症状感染者あるいは軽症感染者は、感染に気付かないこともあり、感染源となるおそれがある。また、インフルエンザに比べて呼吸器検体における病原体の数が少ないこと（１／１００～１／１，０００）などから検査診断が困難である。このような理由から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を簡便、迅速、高感度に検出ができる検査方法が、今日強く求められている。 COVID-19 symptoms range from asymptomatic to upper respiratory tract infection, pneumonia, and acute respiratory distress syndrome (ARDS). Elderly people and those with underlying diseases are particularly at high risk of developing severe symptoms, and many deaths have been reported so far. On the other hand, it has been reported that about 80% of infected people experience mild symptoms and many recover. However, such asymptomatic or mildly infected people may not realize they are infected and may become a source of infection. In addition, the number of pathogens in respiratory samples is small compared to influenza (1/100 to 1/1,000), making testing and diagnosis difficult. For these reasons, there is a strong demand today for a testing method that can detect SARS-CoV-2 easily, quickly, and with high sensitivity.
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検査方法としては、これまでに遺伝子検査、抗原検査、抗体検査が開発されてきている。これらの内、抗原検査は、簡便に検査できるメリットがある一方、感度の点では難があるのが現状である。また抗体検査は、過去に罹患したかの確認ができるものの、現時点で感染しているかの検査には不向きである。これらに対し、遺伝子検査は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に優れた感度で検出できる特徴があり、現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の確定診断法となっている。 So far, genetic tests, antigen tests, and antibody tests have been developed as methods for testing for SARS-CoV-2. Of these, antigen tests have the advantage of being easy to use, but currently have problems with sensitivity. Also, while antibody tests can confirm whether a person has had the disease in the past, they are not suitable for testing whether a person is currently infected. In contrast, genetic tests have the characteristic of being able to specifically detect SARS-CoV-2 with excellent sensitivity, and are currently the definitive method for diagnosing SARS-CoV-2.
遺伝子検査法では、まず逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）した後、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などにより核酸増幅して検出を行う方法がとられている。これらは、各々ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法と呼ばれている。ＲＴ－ＰＣＲ法による検出では現在、ダブル標識核酸プローブ（Ｔａｑｍａｎプローブ、加水分解プローブなどとも呼ばれる）を用いたリアルタイムＰＣＲを行うことにより定量検出する方法が主に実施されている。本方法では、コントロールＲＮＡを基準にウイルス量を定量することが可能であるが、ＰＣＲのサイクル毎に測光する必要があるため、最も短い場合でも検出に約１時間を要する。一方、ＲＴ－ＬＡＭＰ法は、等温で比較的短時間にターゲットを増幅することができる優れた方法であるが、増幅産物の確認は反応時に生じるピロリン酸マグネシウムによる白濁の確認等で行うため、増幅反応産物が標的遺伝子由来のものであるかの識別が困難な場合がある。また、ＲＴ－ＬＡＭＰ法では、反応系に核酸増幅が正常に行われたかを確認するためのインターナルコントロールを組み込むことができないため、検体による増幅阻害が起きた場合には判定が困難になるといった課題がある（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。 In genetic testing, the genome RNA of SARS-CoV-2 is first reverse transcribed (RT) into cDNA using reverse transcriptase, and then the nucleic acid is amplified by PCR or LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) for detection. These are called RT-PCR and RT-LAMP, respectively. Currently, the main method for detection using RT-PCR is quantitative detection by performing real-time PCR using a double-labeled nucleic acid probe (also called Taqman probe, hydrolysis probe, etc.). This method makes it possible to quantify the amount of virus based on control RNA, but since photometry is required for each PCR cycle, detection takes about one hour even in the shortest case. On the other hand, the RT-LAMP method is an excellent method that can amplify a target isothermally in a relatively short time, but since the amplification product is confirmed by checking for cloudiness caused by magnesium pyrophosphate that occurs during the reaction, it can be difficult to distinguish whether the amplification reaction product is derived from the target gene. In addition, the RT-LAMP method has the problem that it is difficult to judge if amplification inhibition occurs due to the sample, because it is not possible to incorporate an internal control into the reaction system to check whether nucleic acid amplification has been performed normally (for example, Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4).
さらに、核酸増幅産物を検出する方法として、融解曲線解析法が知られている。融解曲線解析法は、核酸増幅と検出を別工程で実施することができ、最短３０分間程度で比較的簡便に測定が可能である。さらに蛍光標識核酸プローブを用いた融解曲線解析は、自動分析装置を利用した遺伝子検査にも適合させ易いという利点がある。しかし未だ、融解曲線解析法で高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出可能な核酸プローブは知られていない。 Furthermore, melting curve analysis is known as a method for detecting nucleic acid amplification products. In melting curve analysis, nucleic acid amplification and detection can be performed in separate steps, and measurements can be performed relatively easily in as little as 30 minutes. Furthermore, melting curve analysis using fluorescently labeled nucleic acid probes has the advantage of being easily adapted to genetic testing using automated analyzers. However, no nucleic acid probe capable of detecting SARS-CoV-2 with high sensitivity using melting curve analysis is known yet.
ところで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのＲＮＡウイルスは、頻繁に変異が入りやすい特徴があり、ＲＴ-ＰＣＲ法にて増幅検出を行う際、プライマーあるいはプローブが結合（アニール）する配列内に変異が生じた場合には、増幅または検出できないことが起こりうる。そこで、複数の領域を増幅して同時検出することで、たとえ一方の領域でＰＣＲが掛からない場合でも、他方が増幅されれば検出が可能となり、結果として、頻繁に変異が入りやすいＲＮＡウイルスに対しても、より確実かつ高感度な検出が可能となる。一方で、複数のプライマープローブセットを同一の反応系に入れることは、オリゴヌクレオチド間でダイマーを形成するなどの相互作用する可能性が高くなり、最適なプライマー、プローブ配列を見出すためにはより多くの試行錯誤が必要である。 However, RNA viruses such as SARS-CoV-2 are characterized by frequent mutations, and when amplification and detection is performed using the RT-PCR method, if a mutation occurs in the sequence to which the primer or probe binds (anneals), amplification or detection may not be possible. Therefore, by amplifying and simultaneously detecting multiple regions, even if PCR does not work in one region, detection is possible if the other is amplified, and as a result, more reliable and sensitive detection is possible even for RNA viruses that are prone to frequent mutations. On the other hand, putting multiple primer-probe sets into the same reaction system increases the possibility of interactions between oligonucleotides, such as the formation of dimers, and more trial and error is required to find the optimal primer and probe sequences.
加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検査においては、通常は、鼻咽頭拭い液、喀痰、唾液といった検体からＲＮＡ抽出精製キットを用いてＲＮＡを抽出精製し、そのＲＮＡ抽出液を次工程のＲＴ-ＰＣＲ法などに供するのが一般的である。しかしながら、ＲＮＡ抽出精製には多大な労力とコストがかかるため、簡便な前処理のみで調製した試料を検査に用いることが求められている。すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む検体からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡを抽出精製するのではなく、簡易的にＲＮＡを抽出した試料（簡易ＲＮＡ抽出液）を用いても検出が可能な方法が求められている。 In addition, in SARS-CoV-2 testing, RNA is typically extracted and purified from specimens such as nasopharyngeal swabs, sputum, and saliva using an RNA extraction and purification kit, and the RNA extract is then subjected to the next step, such as RT-PCR. However, because RNA extraction and purification requires a great deal of effort and cost, there is a demand for samples prepared with only simple pretreatment to be used in testing. In other words, there is a demand for a method that allows detection even when using a sample from which RNA has been simply extracted (simple RNA extraction solution), rather than extracting and purifying SARS-CoV-2 genomic RNA from specimens containing SARS-CoV-2.
以上に記載したように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検査においては、（１）測定時間が短いこと、（２）高感度であること、（３）検体試料による増幅阻害に強いこと、（４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異に対応できること、（５）検体による増幅阻害を検知できるインターナルコントロールを反応系に組み込むことができることなどの利点を有し得る測定方法が求められている。 As described above, there is a demand for a measurement method for testing SARS-CoV-2 that has the following advantages: (1) a short measurement time; (2) high sensitivity; (3) resistance to amplification inhibition by sample specimens; (4) the ability to respond to mutations in SARS-CoV-2; and (5) the ability to incorporate an internal control that can detect amplification inhibition by sample specimens into the reaction system.
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、より短時間で、高感度に、簡易抽出検体による増幅阻害に強く、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異に対応でき、検体による増幅阻害を検知できるインターナルコントロールを組み込むことを可能にするなどの利点を有し得る、検体試料中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する手法を提供することである。 The present invention has been made in light of the problems with the prior art. In other words, the object of the present invention is to provide a method for detecting SARS-CoV-2 contained in a specimen sample, which has the advantages of being highly sensitive, resistant to amplification inhibition by easily extracted specimens, capable of responding to mutations of SARS-CoV-2, and enabling the incorporation of an internal control that can detect amplification inhibition by the specimen, in a shorter time.
本発明者は鋭意研究の結果、特定の配列を有する標識プローブを用いること、なかでも複数の特定標識プローブを反応液中で組み合わせて用いることで、上記要求事項を満たし得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法を見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明の概要は以下の通りである。 As a result of intensive research, the inventors have discovered a method for detecting SARS-CoV-2 that satisfies the above requirements by using a labeled probe having a specific sequence, in particular by using a combination of multiple specific labeled probes in a reaction solution, and have completed the present invention. That is, the outline of the present invention is as follows.
［項１］ 検体試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために用いられる、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する標識プローブ：
（Ａ）配列番号１５若しくは配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項２］ 前記標識プローブが、（Ａ）配列番号１５で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む項１に記載の標識プローブであって、
（Ａ－２）配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含み、且つ、（Ｂ－２）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている標識プローブと反応液中で共存させて用いられることを特徴とする、項１に記載の標識プローブ。
［項３］ 前記標識プローブが、（Ａ）配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む項１に記載の標識プローブであって、
（Ａ－１）配列番号１５で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含み、且つ、（Ｂ－１）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている標識プローブと反応液中で共存させて用いられることを特徴とする、項１に記載の標識プローブ。
［項４］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１０塩基以上の塩基配列が、配列番号１５若しくは配列番号１６で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列からなる、項１～３のいずれかに記載の標識プローブ。
［項５］ 前記（Ａ）に記載の少なくとも１０塩基以上の塩基配列が、配列番号３～７若しくは配列番号１０～１４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる、項１～４のいずれかに記載の標識プローブ。
［項６］ 前記標識が蛍光色素標識である、項１～５のいずれかに記載の標識プローブ。
［項７］ 前記標識プローブが、該標識プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素で標識されている、項１～６のいずれかに記載の標識プローブ。
［項８］ グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている、項１～７のいずれかに記載の標識プローブ。
［項９］ 前記（Ｂ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～８のいずれかに記載の標識プローブ。
［項１０］ 前記（Ｂ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～９のいずれかに記載の標識プローブ。
［項１１］ 前記（Ｂ）において、標識されている末端塩基がシトシンである項１～１０のいずれかに記載の標識プローブ。
［項１２］ 核酸を精製する工程を経ていない生体由来の検体試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために用いられる、項１～１１のいずれかに記載の標識プローブ。
［項１３］ 少なくとも以下の第一の標識プローブ並びに第二の標識プローブを含む、検体試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために用いられる標識プローブセット：
（Ａ－１）配列番号１５で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ－１）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されていることを特徴とする、第一の標識プローブ；並びに
（Ａ－２）配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ－２）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されていることを特徴とする、第二の標識プローブ。
［項１４］ 項１～１２のいずれかに記載の標識プローブ又は項１３に記載の標識プローブセットを用いて、検体試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法。
［項１５］ ＲＴ－ＰＣＲ－融解曲線解析法で検出を行う、項１４に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法。
［項１６］ ＰＣＲ反応に用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである項１５に記載の検出方法。
［項１７］ ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、項１６に記載の検出方法。
［項１８］ ＲＴ反応に用いる逆転写活性を有する酵素が、Ｍ－ＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）由来のリバーストランスクリプターゼ又はその変異体である、項１４～１７のいずれかに記載の検出方法。
［項１９］ 検体試料が、核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料である、項１４～１８のいずれかに記載の検出方法。
［項２０］ 項１～１２のいずれかに記載の標識プローブ又は項１３に記載の標識プローブセットを含む、検体試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬キット。
[Item 1] A labeled probe used to detect SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen sample, the labeled probe having the following characteristics (A) and (B):
(A) comprising a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence that is 85% or more identical to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or a base sequence complementary thereto; and (B) only one of the 5' end or 3' end is labeled.
[Item 2] The labeled probe according to Item 1, wherein the labeled probe comprises (A) a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence showing 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or a base sequence complementary thereto,
Item 1. The labeled probe according to Item 1, characterized in that (A-2) it contains a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence showing 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO:16 or a base sequence complementary thereto, and (B-2) it is used in the presence in a reaction solution together with a labeled probe in which only one of the 5'-end or 3'-end is labeled.
[Item 3] The labeled probe according to Item 1, wherein the labeled probe comprises (A) a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence showing 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or a base sequence complementary thereto,
Item 1. The labeled probe according to Item 1, characterized in that (A-1) it contains a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence showing 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO:15 or a base sequence complementary thereto, and (B-1) it is used in the presence in a reaction solution of a labeled probe in which only one of the 5'-end or 3'-end is labeled.
[Item 4] The labeled probe according to any one of Items 1 to 3, wherein the base sequence of at least 10 bases described in (A) is a base sequence of at least 10 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or a base sequence complementary thereto, or a base sequence in which one or several bases have been substituted, deleted, or added in said base sequence.
[Item 5] The labeled probe according to any one of Items 1 to 4, wherein the base sequence of at least 10 bases described in (A) consists of a base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3 to 7 or 10 to 14, or a base sequence complementary thereto.
[Item 6] The labeled probe according to any one of Items 1 to 5, wherein the label is a fluorescent dye label.
[Item 7] The labeled probe according to any one of Items 1 to 6, wherein the labeled probe is labeled with a fluorescence quenching dye that is quenched when bound to a nucleic acid containing a base sequence that shows 90% or more identity to a base sequence complementary to the base sequence of the labeled probe.
[Item 8] The labeled probe according to any one of Items 1 to 7, which is labeled with a fluorescence quenching dye that is quenched by interaction with guanine.
[Item 9] The labeled probe according to any one of Items 1 to 8, wherein the label of (B) is a label with at least one fluorescence quenching dye selected from the group consisting of fluorescein and derivatives thereof, rhodamine and derivatives thereof, and BODIPY and derivatives thereof.
[Item 10] The labeled probe according to any one of Items 1 to 9, wherein the label of (B) is a label with at least one fluorescence quenching dye selected from the group consisting of 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid (BODIPY-FL), carboxyrhodamine 6G, TAMRA, rhodamine 6G, tetrabromosulfonefluorescein (TBSF), and 2-oxo-6,8-difluoro-7-dihydroxy-2H-1-benzopyran-3-carboxylic acid (Pacific Blue).
[Item 11] The labeled probe according to any one of Items 1 to 10, wherein in (B) the labeled terminal base is cytosine.
[Item 12] The labeled probe according to any one of Items 1 to 11, which is used for detecting SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen sample derived from a living body that has not been subjected to a nucleic acid purification step.
[Item 13] A labeled probe set for detecting SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen sample, comprising at least the following first labeled probe and second labeled probe:
(A-1) a first labeled probe, characterized in that it comprises a base sequence having 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO:15 or a base sequence having at least 10 or more consecutive bases in a base sequence complementary thereto; and (B-1) a first labeled probe, characterized in that only either the 5' end or the 3' end is labeled; and (A-2) a base sequence having 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO:16 or a base sequence having at least 10 or more consecutive bases in a base sequence complementary thereto; and (B-2) a second labeled probe, characterized in that only either the 5' end or the 3' end is labeled.
[Item 14] A method for detecting SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen sample, using the labeled probe according to any one of Items 1 to 12 or the labeled probe set according to Item 13.
[Item 15] The method for detecting SARS-CoV-2 according to Item 14, wherein detection is performed by RT-PCR-melting curve analysis.
[Item 16] The detection method according to Item 15, wherein the nucleic acid amplification enzyme used in the PCR reaction is a DNA polymerase belonging to Family B.
[Item 17] The detection method according to Item 16, wherein the DNA polymerase belonging to Family B is a DNA polymerase derived from KOD or a mutant thereof.
[Item 18] The detection method according to any one of Items 14 to 17, wherein the enzyme having reverse transcription activity used in the RT reaction is a reverse transcriptase derived from M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) or a mutant thereof.
[Item 19] The detection method according to any one of Items 14 to 18, wherein the specimen sample is a biological sample that has not been subjected to a nucleic acid purification step.
[Item 20] A reagent kit for detecting SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen sample, comprising the labeled probe according to any one of Items 1 to 12 or the labeled probe set according to Item 13.
本発明により、検体試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、迅速、高感度に検出することができる。本発明の方法によれば、例えば、高度に核酸を単離・精製されていない試料、すなわち、簡易ＲＮＡ抽出した試料を用いる場合であっても増幅阻害を受けにくく、極めて高い感度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドを用いた検出方法、試薬あるいはキットを使用することで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の簡便、迅速、高感度な検出が可能になり、臨床診断の分野に大きく貢献できる。 The present invention allows rapid and highly sensitive detection of SARS-CoV-2 contained in a specimen sample. According to the method of the present invention, even when a sample in which nucleic acid has not been highly isolated or purified, i.e., a sample from which RNA has been extracted simply, is used, SARS-CoV-2 is unlikely to be inhibited in amplification and can be detected with extremely high sensitivity. By using a detection method, reagent, or kit using the oligonucleotide of the present invention, SARS-CoV-2 can be detected easily, quickly, and with high sensitivity, making a significant contribution to the field of clinical diagnosis.
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方または両方を意味する。 The present invention will be described in more detail below while showing embodiments of the present invention, but the present invention is not limited thereto. All non-patent documents and patent documents described in this specification are incorporated herein by reference. In addition, "~" in this specification means "more than or equal to, less than or equal to", for example, if the specification states "X~Y", it means "more than or equal to X, less than or equal to Y". In addition, "and/or" in this specification means either one or both.
また、本明細書では、核酸プライマーをオリゴヌクレオチドプライマー又は単にプライマーといい、核酸プローブをオリゴヌクレオチドプローブ又は単にプローブという場合があり、これらを総称してオリゴヌクレオチドともいう。 In addition, in this specification, a nucleic acid primer may be referred to as an oligonucleotide primer or simply as a primer, and a nucleic acid probe may be referred to as an oligonucleotide probe or simply as a probe, and these are collectively referred to as oligonucleotides.
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法］
本発明の実施態様の一つは、検体試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を高感度に検出する方法である。本発明は、後述する特定塩基配列を有する標識プローブ（本明細書では、これを「核酸プローブ」ともいう）を使用すること、好ましくは当該標識プローブを２種以上組み合わせて使用することで、例えばＲＴ－ＰＣＲ－融解曲線解析法などにおいて、検体試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を迅速、簡便、高感度に検出することができる。
特定の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも以下の（１）～（３）の工程：
（１）検体試料中において、逆転写活性を有する酵素を用いてターゲットのＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程；
（２）特定の塩基配列からなる１または複数の核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、前記工程（１）で得られたｃＤＮＡを鋳型に１または複数の核酸増幅産物を生成する工程；及び
（３）前記工程（２）で得られた１または複数の増幅産物を、特定の塩基配列からなる１または複数の本発明の標識プローブを用いた融解曲線解析法により検出する工程、
を包含することを特徴とする。即ち本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出において、高感度な判定結果を得るために、核酸増幅検出反応において１または複数の特定塩基配列の標識プローブを用いることを一つの特徴とする。
Methods for detecting SARS-CoV-2
One embodiment of the present invention is a method for detecting SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen with high sensitivity. The present invention uses a labeled probe (also referred to as a "nucleic acid probe" in this specification) having a specific base sequence described below, preferably a combination of two or more types of the labeled probe, to rapidly, easily, and highly sensitively detect SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen, for example, in an RT-PCR-melting curve analysis method.
In a specific embodiment, the method of the present invention includes at least the following steps (1) to (3):
(1) converting target RNA into cDNA in a specimen using an enzyme having reverse transcription activity;
(2) performing a nucleic acid amplification reaction using one or more nucleic acid primer sets each having a specific base sequence, and generating one or more nucleic acid amplification products using the cDNA obtained in the step (1) as a template; and (3) detecting the one or more amplification products obtained in the step (2) by melting curve analysis using one or more labeled probes of the present invention each having a specific base sequence.
That is, one of the features of the present invention is that, in order to obtain highly sensitive determination results in the detection of SARS-CoV-2, a labeled probe having one or more specific base sequences is used in a nucleic acid amplification detection reaction.
［逆転写反応］
一つの実施態様において、本発明の方法は、核酸プライマー及び逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いて逆転写（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）反応を行い、標的とするＲＮＡからｃＤＮＡを生成させる。逆転写酵素としては、逆転写活性を有する酵素であれば特に限定されず、例えば、Ｍ－ＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ：モロニーマウス白血病ウイルス）やＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）由来のリバーストランスクリプターゼ（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が挙げられる。変異体としては、例えば、野生型のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加した変異体等が挙げられ、具体的には、ｃＤＮＡの合成効率を上げるために、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠失させた変異体などが挙げられる。また、特定の条件下ではＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼとその変異体も逆転写活性があることが知られており、本発明において逆転写酵素として使用されることがある。
[Reverse transcription reaction]
In one embodiment, the method of the present invention uses a nucleic acid primer and a reverse transcriptase to perform a reverse transcription (RT) reaction to generate cDNA from a target RNA. The reverse transcriptase is not particularly limited as long as it is an enzyme having reverse transcription activity, and examples thereof include reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase) derived from M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) or AMV (Avian Myeloblastosis Virus) and mutants thereof. Examples of mutants include mutants in which one or several amino acids are deleted, substituted and/or added in the wild-type amino acid sequence, and specifically, mutants in which RNase H activity is deleted in order to increase the efficiency of cDNA synthesis. In addition, it is known that Tth DNA polymerase and its mutants also have reverse transcription activity under certain conditions, and may be used as the reverse transcriptase in the present invention.
逆転写反応で使用される核酸プライマーは、次の核酸増幅反応で使用されるＰＣＲプライマーの一方を兼ねていてもよい。また、逆転写反応の条件は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、３７～５５℃で０秒～６０分が好ましい。特に４２～５０℃で２～１５分が好ましい。 The nucleic acid primer used in the reverse transcription reaction may also serve as one of the PCR primers used in the subsequent nucleic acid amplification reaction. The conditions for the reverse transcription reaction are not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved, but for example, 37 to 55°C and 0 seconds to 60 minutes are preferred. In particular, 42 to 50°C and 2 to 15 minutes are preferred.
［核酸増幅反応］
一つの実施態様において、本発明の方法は、核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行い、核酸増幅産物を生成させる。核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野においても広く用いられている。そのような核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法、ＴＭＡ法等が挙げられる。これらの技術は既に当該技術分野において確立されており、目的に合わせて方法を選択することができる。本発明で行う核酸増幅法はＰＣＲ法（ＲＴ－ＰＣＲ法を含む）が好ましいが、これに限定されない。
[Nucleic acid amplification reaction]
In one embodiment, the method of the present invention uses a nucleic acid primer set to carry out a nucleic acid amplification reaction to generate a nucleic acid amplification product. The nucleic acid amplification method is a technique for amplifying several copies of a target nucleic acid to a level at which it can be visualized, i.e., to hundreds of millions of copies or more, and is widely used not only in the field of life science research, but also in the fields of clinical diagnosis, food hygiene inspection, environmental inspection, and the like. Examples of such nucleic acid amplification methods include PCR, LAMP, LCR, TMA, SDA, RT-PCR, RT-LAMP, NASBA, TRC, and TMA. These techniques have already been established in the technical field, and a method can be selected according to the purpose. The nucleic acid amplification method carried out in the present invention is preferably, but is not limited to, the PCR method (including the RT-PCR method).
［ＰＣＲ反応］
ＰＣＲ反応は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応であり、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって標的核酸を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴやその変異体が挙げられる。本発明では、迅速、高感度、かつ検体による増幅阻害耐性を有するという観点から、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。また、融解曲線解析法を行う場合には、蛍光消光プローブを用いる観点からも、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
[PCR reaction]
PCR is a reaction catalyzed mainly by DNA polymerase, and the target nucleic acid is amplified by repeating three steps, namely (1) DNA denaturation by heat treatment (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA), (2) annealing of a primer to a template single-stranded DNA, and (3) extension of the primer using DNA polymerase, as one cycle. Examples of DNA polymerase include Taq, Tth, Bst, KOD, Pfu, Pwo, Tbr, Tfi, Tfl, Tma, Tne, Vent, DEEPVENT, and mutants thereof. In the present invention, it is preferable to use a DNA polymerase belonging to family B from the viewpoint of rapidity, high sensitivity, and resistance to amplification inhibition by a sample. In addition, when performing melting curve analysis, it is preferable to use a DNA polymerase belonging to family B that does not have 5'→3' exonuclease activity from the viewpoint of using a fluorescence quenching probe.
ＰＣＲ反応の条件は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、最初の熱変形工程が８０～１００℃で０秒～５分、繰り返しの熱変形工程が８０～１００℃で０．５～３００秒、アニーリンクが３５～８０℃で１～３００秒、伸長反応工程が３５～８５℃で１～３００秒程度行い、この繰り返しを３０～７０回繰り返すことが好ましい。ここで繰り返し行うサイクルの温度及び時間は、１～数サイクル毎に変化させてもよい。 The PCR reaction conditions are not particularly limited as long as they achieve the effects of the present invention, but for example, it is preferable to perform the initial heat deformation step at 80-100°C for 0 seconds to 5 minutes, the repeated heat deformation step at 80-100°C for 0.5-300 seconds, the annealing step at 35-80°C for 1-300 seconds, and the extension reaction step at 35-85°C for 1-300 seconds, with this cycle being repeated 30-70 times. The temperature and time of the repeated cycles may be changed every one or several cycles.
［ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ］
本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、これに限定されない。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されないが、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼであり、より好ましくは、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。また、本発明には、ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体も含まれる。ＤＮＡポリメラーゼの変異体には、ポリメラーゼ活性の増強、エキソヌクレアーゼ活性の欠損、基質特異性の調整等を目的とした変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）が、伸長性や熱安定性に優れているという観点から、本発明においてとりわけ好適に用いることができる。
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられ、そのいずれもが本発明に用いられ得る。
[DNA polymerases belonging to family B]
The DNA polymerase used in the present invention is preferably, but is not limited to, a DNA polymerase belonging to family B. The DNA polymerase belonging to family B is not particularly limited, but is preferably a DNA polymerase derived from Archea, more preferably a DNA polymerase derived from bacteria of the genus Pyrococcus and Thermococcus. The present invention also includes a mutant of the DNA polymerase derived from Archea belonging to family B that does not lose its activity. The mutant of DNA polymerase includes, but is not limited to, a mutant for the purpose of enhancing polymerase activity, deleting exonuclease activity, adjusting substrate specificity, etc.
Examples of DNA polymerases derived from the genus Pyrococcus include, but are not limited to, DNA polymerases isolated from Pyrococcus furiosus, Pyrococcus sp. GB-D, Pyrococcus woesei, Pyrococcus abyssi, and Pyrococcus horikoshii, as well as mutants derived therefrom that have not lost their DNA polymerase activity.
Examples of DNA polymerases derived from the genus Thermococcus include, but are not limited to, DNA polymerases isolated from Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus litoralis, Thermococcus sp. JDF-3, Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9°N-7), and Thermococcus siculi, and mutants thereof that have not lost their DNA polymerase activity. Preferably, DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaraensis and its mutants (for example, KOD-derived DNA polymerase lacking 3' to 5' exonuclease activity) can be particularly suitably used in the present invention from the viewpoint of excellent extensibility and thermal stability.
PCR enzymes using these DNA polymerases are commercially available, and include Pfu (Staragene), KOD (Toyobo), Pfx (Life Technologies), Vent (New England Biolabs), Deep Vent (New England Biolabs), Tgo (Roche), and Pwo (Roche), any of which may be used in the present invention.
［ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ］
本明細書において、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼともいう）とは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、天然由来のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、及び／又は付加することにより３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）をいう。一つの好ましい実施形態において、本発明は、このようなＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼを使用して核酸増幅反応を行う。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性、増幅効率、伸長性、検体由来の阻害物質による増幅阻害耐性に優れている。本発明では、このようなＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、後述の実施例に示すように、簡便でありながら、迅速、高感度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能となる。
[DNA polymerase derived from KOD]
In this specification, KOD-derived DNA polymerase (also referred to as KOD DNA polymerase) refers to a DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaraensis and its mutants (for example, a KOD-derived DNA polymerase in which 3'→5' exonuclease activity has been deleted by substituting, deleting, and/or adding one or several amino acids in a naturally-occurring amino acid sequence). In one preferred embodiment, the present invention uses such a KOD-derived DNA polymerase to perform a nucleic acid amplification reaction. Compared to Taq DNA polymerase, which is a DNA polymerase belonging to family A, KOD DNA polymerase is superior in accuracy, amplification efficiency, extensibility, and resistance to amplification inhibition by inhibitors derived from samples. In the present invention, by using such a KOD DNA polymerase, it is possible to detect SARS-CoV-2 simply, quickly, and with high sensitivity, as shown in the examples described below.
［核酸プライマーセット］
本発明においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために用いる、前記（２）に記載の核酸プライマーセットは、後述の標識プローブが複合体を形成できるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸断片を増幅し得るものであれば、特に限定されない。より高感度な判定結果が得られ易いという観点から、核酸プライマーセットは、配列番号１５又は１６で示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ゲノムＲＮＡの塩基配列の一部又は全部を増幅し得る核酸プライマーセットである。例えば、核酸プライマーセットは、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸プライマー及び配列番号２で示される塩基配列からなる核酸プライマーから構成される核酸プライマーセット、又は、配列番号８で示される塩基配列からなる核酸プライマー及び配列番号９で示される塩基配列からなる核酸プライマーから構成される核酸プライマーセットであり得るが、これらに限定されない。例えば、核酸プライマーセットは、上記の配列番号１、２の塩基配列に対してそれぞれ相補的な塩基配列からなる核酸プライマーの組み合わせ、又は、配列番号８、９の塩基配列に対してそれぞれ相補的な塩基配列からなる核酸プライマーの組み合わせでもよい。
[Nucleic acid primer set]
The nucleic acid primer set described in (2) above used for detecting SARS-CoV-2 in the present invention is not particularly limited as long as it can amplify a nucleic acid fragment derived from SARS-CoV-2 with which a labeled probe described below can form a complex. From the viewpoint of easily obtaining a more sensitive determination result, the nucleic acid primer set is a nucleic acid primer set capable of amplifying a part or all of the nucleotide sequence of SARS-CoV-2 genomic RNA shown in SEQ ID NO: 15 or 16. For example, the nucleic acid primer set may be a nucleic acid primer set consisting of a nucleic acid primer consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid primer consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a nucleic acid primer consisting of a nucleic acid primer consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 and a nucleic acid primer consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto. For example, the nucleic acid primer set may be a combination of nucleic acid primers consisting of nucleotide sequences complementary to the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively, or a combination of nucleic acid primers consisting of nucleotide sequences complementary to the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 8 and 9, respectively.
本明細書において、配列番号１５および配列番号１６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ配列の一部を逆転写しＤＮＡとしたものに相当する塩基配列である。本発明は、これらの配列番号１５又は１６に示される塩基配列が対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ゲノムＲＮＡ領域を標的配列とすること、特に、配列番号１５で示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム領域と配列番号１６で示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム領域の両方を標的配列として同時検出することで、融解曲線解析等においても高感度なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出が可能になるという新たな知見を見出したことに基づく。従って、本発明に用いる核酸プライマーセットは、配列番号１５及び１６に示される両領域のそれぞれ一部又は全部を増幅できるものであることが好ましい。 In this specification, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 are base sequences corresponding to DNA obtained by reverse transcribing a part of the RNA sequence of SARS-CoV-2. The present invention is based on the new finding that by using the SARS-CoV-2 genomic RNA region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or 16 as a target sequence, and in particular by simultaneously detecting both the SARS-CoV-2 genomic region shown in SEQ ID NO: 15 and the SARS-CoV-2 genomic region shown in SEQ ID NO: 16 as target sequences, specific detection of SARS-CoV-2 with high sensitivity is possible even in melting curve analysis, etc. Therefore, it is preferable that the nucleic acid primer set used in the present invention is capable of amplifying a part or all of both the regions shown in SEQ ID NO: 15 and 16.
［増幅産物を検出する工程］
本発明の前記方法では、工程（３）として、前記工程（１）～（２）で得られた増幅産物を検出する工程を包含する。この検出する工程の態様は特に限定されず、当該分野で公知の任意の方法で実施することができるが、本発明では、融解曲線解析法が好ましい。
[Step of detecting the amplification product]
In the method of the present invention, step (3) includes a step of detecting the amplification products obtained in steps (1) and (2). The mode of this detection step is not particularly limited and can be carried out by any method known in the art, but in the present invention, melting curve analysis is preferred.
一つの実施形態において、前記工程（３）は、以下の（３－１）～（３－２）の工程：
（３－１）前記工程（２）によって得られた核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程；及び
（３－２）前記工程（３－１）で得られた複合体を検出する工程。
を包含することを特徴とする。好ましい本実施態様では、本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出において、高感度な判定結果を得るために、前記（１）（２）工程によって得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸増幅産物と特異的に反応して複合体を形成しうる標識プローブを用いることを一つの特徴とする。簡易的なＲＮＡ抽出しか行われていない場合でも高感度な検出を可能にするという観点から、前記（１）（２）工程によって得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の１または複数の核酸増幅産物と特異的に反応して複合体を形成しうる１または複数の核酸標識プローブを用いることがなかでも好ましい。
In one embodiment, the step (3) includes the following steps (3-1) to (3-2):
(3-1) a step of hybridizing the nucleic acid amplification product obtained in the step (2) with a nucleic acid probe to form a complex; and (3-2) a step of detecting the complex obtained in the step (3-1).
In a preferred embodiment of the present invention, one of the features of the present invention is the use of a labeled probe capable of specifically reacting with a nucleic acid amplification product derived from SARS-CoV-2 obtained by the steps (1) and (2) to form a complex in order to obtain a highly sensitive determination result in the detection of SARS-CoV-2. From the viewpoint of enabling highly sensitive detection even when only simple RNA extraction has been performed, it is particularly preferable to use one or more labeled nucleic acid probes capable of specifically reacting with one or more nucleic acid amplification products derived from SARS-CoV-2 obtained by the steps (1) and (2) to form a complex.
［核酸プローブ］
一つの実施形態において、本発明は、前記のような核酸プライマーを含む核酸プライマーセットで増幅したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸増幅産物と特異的に反応して複合体を形成しうる核酸プローブである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸増幅産物と特異的に反応させる本発明の標識プローブは、以下の特徴を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための核酸プローブであり得る：
（Ａ）配列番号１５若しくは配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
このような特徴を有する核酸プローブを用いることで、例えば、融解曲線解析においても高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能になる。
[Nucleic acid probe]
In one embodiment, the present invention is a nucleic acid probe capable of specifically reacting with a nucleic acid amplification product derived from SARS-CoV-2 amplified with a nucleic acid primer set including the nucleic acid primers described above to form a complex. The labeled probe of the present invention that specifically reacts with a nucleic acid amplification product derived from SARS-CoV-2 may be a nucleic acid probe for detecting SARS-CoV-2 having the following characteristics:
(A) comprising a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence that is 85% or more identical to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or a base sequence complementary thereto; and (B) only one of the 5' end or 3' end is labeled.
By using a nucleic acid probe having such characteristics, it becomes possible to detect SARS-CoV-2 with high sensitivity, for example, in melting curve analysis.
本発明の核酸プローブは、配列番号１５若しくは配列番号１６の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列に相同性の高い配列を有するものであれば特に限定されないが、後述するグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識した核酸プローブとする場合には、当該色素で標識される少なくとも一つの末端塩基がシトシンであることが好ましい。 The nucleic acid probe of the present invention is not particularly limited as long as it has the base sequence of SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16 or a sequence highly homologous to a base sequence complementary thereto. However, when the nucleic acid probe is labeled with a fluorescent quenching dye that is quenched by interaction with guanine, as described below, it is preferable that at least one terminal base labeled with the dye is cytosine.
一つの実施形態において、本発明に用いる標識プローブは、配列番号１５若しくは配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列からなるものであり得る。好ましくは、配列番号１５若しくは配列番号１６で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列と９０％以上、より好ましくは９３％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を示す塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列からなる核酸プローブであり得る。特に好ましくは、配列番号１５若しくは配列番号１６で示される塩基配列と１００％同一の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列からなる核酸プローブである。 In one embodiment, the labeled probe used in the present invention may be a nucleic acid probe consisting of a base sequence showing 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or a base sequence complementary thereto, with at least 10 consecutive bases. Preferably, the nucleic acid probe may be a nucleic acid probe consisting of a base sequence showing 90% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or a base sequence complementary thereto, with at least 10 consecutive bases. Particularly preferred is a nucleic acid probe consisting of a base sequence 100% identical to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or a base sequence complementary thereto, with at least 10 consecutive bases.
特定の実施形態では、本発明の標識プローブは、例えば、配列番号１５若しくは配列番号１６で示される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列からなる標識プローブであり得る。ここで、１又は数個とは、例えば、１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個であり得る。このように配列番号１５又は１６で示される塩基配列と相同性の高い塩基配列を有する標識プローブを用いることで、高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能となる。 In a specific embodiment, the labeled probe of the present invention may be, for example, a labeled probe consisting of a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence in which one or several bases have been substituted, deleted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16. Here, one or several may be, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 to 2. In this way, by using a labeled probe having a base sequence highly homologous to the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or 16, it becomes possible to detect SARS-CoV-2 with high sensitivity.
一つの好ましい実施形態において、本発明の標識プローブは、配列番号１５に示される塩基配列の１５番目～４９番目に示される塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列からなる標識プローブである。このような標識プローブと核酸増幅産物とを反応させることで、より良好にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能となる。 In one preferred embodiment, the labeled probe of the present invention is a labeled probe consisting of a base sequence of at least 10 consecutive bases in the base sequence shown in the 15th to 49th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or a base sequence complementary to said base sequence. By reacting such a labeled probe with the nucleic acid amplification product, it becomes possible to more effectively detect SARS-CoV-2.
他の好ましい実施形態において、本発明の標識プローブは、配列番号１６に示される塩基配列の２２番目～４０番目に示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列からなる標識プローブである。このような標識プローブと核酸増幅産物とを反応させることで、より良好にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を出することが可能となる。 In another preferred embodiment, the labeled probe of the present invention is a labeled probe consisting of a base sequence of at least 10 consecutive bases in the base sequence shown in the 22nd to 40th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or a base sequence complementary thereto. By reacting such a labeled probe with the nucleic acid amplification product, it is possible to more effectively extract SARS-CoV-2.
標識プローブの長さとしては、１０塩基以上である限り特に限定されないが、例えば、１４塩基以上、好ましくは１４～２５塩基、より好ましくは１４～１９塩基であり得る。このような長さの標識プローブを用いることで、より高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を区別して高感度に検出することが可能である。 The length of the labeled probe is not particularly limited as long as it is 10 bases or more, but may be, for example, 14 bases or more, preferably 14 to 25 bases, and more preferably 14 to 19 bases. By using a labeled probe of such a length, it is possible to distinguish and detect SARS-CoV-2 with higher sensitivity.
特定の好ましい実施形態において、本発明に用いる標識プローブの具体例としては、配列番号３～７若しくは配列番号１０～１４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる標識プローブを挙げることができる。このような特定の塩基配列を有する標識プローブを用いることにより、より一層高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能になる。 In a specific preferred embodiment, a specific example of a labeled probe used in the present invention is a labeled probe consisting of a base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3 to 7 or 10 to 14, or a base sequence complementary thereto. By using a labeled probe having such a specific base sequence, it becomes possible to detect SARS-CoV-2 with even higher sensitivity.
上記の標識プローブは、５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されていることを特徴とする。一つの実施形態において、本発明の標識プローブは、該標識プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光又は蛍光を生じるように標識されていることが好ましく、消光を生じるように標識されていることがより好ましい。標識物質には特に制限はないが、蛍光物質を用いる蛍光色素標識であることがより好ましい。 The above-mentioned labeled probe is characterized in that only one of the 5'-end or 3'-end is labeled. In one embodiment, the labeled probe of the present invention is preferably labeled to cause quenching or fluorescence when bound to a nucleic acid containing a base sequence that shows 90% or more identity to a base sequence complementary to the base sequence of the labeled probe, and more preferably labeled to cause quenching. There are no particular limitations on the labeling substance, but it is more preferable that it is a fluorescent dye label using a fluorescent substance.
蛍光標識としては特に標的の核酸増幅産物とハイブリダイズして複合体を形成することにより蛍光を生じる蛍光物質又は消光を生じる蛍光物質のいずれであってもよいが、好ましくは標的の核酸増幅産物とハイブリダイズした際に消光を生じる蛍光物質であり、特に好ましくは、標的の核酸増幅産物とハイブリダイズにおいてグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素（例えば、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素）である。具体的には、フルオロセイン及びその誘導体（例えば、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ローダミン及びその誘導体（例えば、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシローダミン、ｘ－ローダミン、スルホローダミン１０１酸クロリド）、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体（例えば、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ／Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ／Ｃ６、ＢＯＤＩＰＹ－５－ＦＡＭ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－５６４、ＢＯＤＩＰＹ－５８１、ＢＯＤＩＰＹ－５９１、ＢＯＤＩＰＹ－６３０、ＢＯＤＩＰＹ－６５０、ＢＯＤＩＰＹ－６６５）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素が挙げられるが、これらに限定されない。 The fluorescent label may be either a fluorescent substance that fluoresces or a fluorescent substance that quenches by hybridizing with a target nucleic acid amplification product to form a complex, but is preferably a fluorescent substance that quenches when hybridized with a target nucleic acid amplification product, and is particularly preferably a fluorescent quenching dye that quenches by interaction with guanine when hybridized with a target nucleic acid amplification product (e.g., a fluorescent quenching dye that quenches by interaction with guanine). Specifically, fluorescein and its derivatives (e.g., fluorescein isothiocyanate (FITC)), rhodamine and its derivatives (e.g., 5-carboxyrhodamine 6G (GR6G), tetramethylrhodamine (TAMRA), carboxyrhodamine, x-rhodamine, sulforhodamine 101 acid chloride), and BODIPY and its derivatives (e.g., BODIPY-FL, BODI At least one fluorescent quenching dye selected from the group consisting of, but not limited to, PY-FL/C3, BODIPY-FL/C6, BODIPY-5-FAM, BODIPY-TMR, BODIPY-TR, BODIPY-R6G, BODIPY-564, BODIPY-581, BODIPY-591, BODIPY-630, BODIPY-650, and BODIPY-665).
より具体的には、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素として、例えば、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素を挙げることができ、本発明にはこれらの蛍光消光色素が好適に使用され得る。 More specifically, examples of the fluorescent quenching dye that is quenched by interaction with guanine include at least one fluorescent quenching dye selected from the group consisting of 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid (BODIPY-FL), carboxyrhodamine 6G, TAMRA, rhodamine 6G, tetrabromosulfonefluorescein (TBSF), and 2-oxo-6,8-difluoro-7-dihydroxy-2H-1-benzopyran-3-carboxylic acid (Pacific Blue), and these fluorescent quenching dyes can be suitably used in the present invention.
特定の好ましい実施形態では、蛍光消光色素で標識されている末端塩基がシトシンである標識プローブがより好ましい。
このようなオリゴヌクレオチドプローブは、増幅産物にハイブリダイズした際に、増幅産物中のグアニン塩基と塩基対を形成して相互作用することで消光できるため、非常に簡便に反応液の蛍光強度の変化を測定することができる。
In certain preferred embodiments, a labeled probe in which the terminal base is cytosine and which is labeled with a fluorescent quenching dye is more preferred.
When such oligonucleotide probes hybridize to amplification products, they can quench the light by forming base pairs with the guanine bases in the amplification products and interacting with them, making it very easy to measure changes in the fluorescence intensity of the reaction solution.
なお、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基と増幅産物中のグアニン塩基が塩基対を形成しなくとも、それらの塩基同士の距離が近ければ蛍光は消光できる。例えば、詳細は特許第５３５４２１６号公報に記載があり、本発明も該技術を参照できる。即ち、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基に対して、増幅産物中のグアニン塩基が例えば１～３塩基の範囲内に存在すれば消光できる（シトシン塩基と塩基対を形成する塩基を１とする）。 When the probe hybridizes, even if the cytosine base of the probe and the guanine base in the amplified product do not form a base pair, the fluorescence can be quenched as long as the distance between these bases is close. For example, details are described in Japanese Patent No. 5354216, and this technology can also be referenced in the present invention. In other words, when the probe hybridizes, the fluorescence can be quenched if the guanine base in the amplified product is within a range of, for example, 1 to 3 bases of the cytosine base of the probe (a base that forms a base pair with a cytosine base is counted as 1).
更に特定の実施態様では、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基（即ち、両端が標識されている場合は、少なくとも一方の末端塩基）がシトシンでない核酸プローブであっても、反応液の蛍光強度の変化を測定できる。例えば、詳細は特許第５３５４２１６号公報に記載があり、本発明も該技術を参照できる。例えば、該プローブがハイブリダイズした際に、蛍光消光色素が標識されている少なくとも一つの末端塩基に対して、増幅産物中のグアニン塩基が例えば１～３塩基の範囲内に存在すれば消光できる（末端塩基と塩基対を形成する塩基を１とする）。 Furthermore, in certain embodiments, even if at least one terminal base labeled with a fluorescent quenching dye (i.e., if both ends are labeled, at least one terminal base) is not cytosine in a nucleic acid probe, the change in fluorescence intensity of the reaction solution can be measured. For example, details are described in Japanese Patent No. 5354216, and this technology can also be referenced in the present invention. For example, when the probe hybridizes, quenching can be achieved if a guanine base in the amplification product is present within a range of, for example, 1 to 3 bases of at least one terminal base labeled with a fluorescent quenching dye (a base that forms a base pair with the terminal base is counted as 1).
特定の好ましい実施形態において、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法では、本発明の標識プローブを検出反応液中で２つ以上組み合わせて用いる。このように複数の本発明の標識プローブを反応液中で共存させるように用いることで、より一層高感度なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出が可能になる。例えば、このように本発明の標識プローブを２つ以上組み合わせて検出反応液中で共存させることにより、事前に核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料からでも十分な感度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが可能になり得る。 In a specific preferred embodiment, the method for detecting SARS-CoV-2 of the present invention uses a combination of two or more labeled probes of the present invention in a detection reaction solution. By using a plurality of labeled probes of the present invention so that they coexist in the reaction solution in this way, it becomes possible to detect SARS-CoV-2 with even higher sensitivity. For example, by combining two or more labeled probes of the present invention so that they coexist in the detection reaction solution in this way, it may be possible to detect SARS-CoV-2 with sufficient sensitivity even from a biological sample that has not been subjected to a prior process of purifying nucleic acids.
一つの好ましい実施形態では、（Ａ）配列番号１５で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む標識プローブを、以下の特徴（Ａ－２）及び（Ｂ－２）を有する標識プローブと反応液中で共存させるように用いる：
（Ａ－２）配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ－２）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
In one preferred embodiment, (A) a labeled probe containing a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence showing 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 or a base sequence complementary thereto is used so as to coexist in a reaction solution with a labeled probe having the following characteristics (A-2) and (B-2):
(A-2) comprising a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence showing 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO:16 or a base sequence complementary thereto; and (B-2) only one of the 5' end or 3' end is labeled.
他の好ましい実施形態では、（Ａ）配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む標識プローブを、以下の特徴（Ａ－１）及び（Ｂ－１）を有する標識プローブと反応液中で共存させるように用いる：
（Ａ－１）配列番号１５で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ－１）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
In another preferred embodiment, (A) a labeled probe containing a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence showing 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or a base sequence complementary thereto is used so as to coexist in a reaction solution with a labeled probe having the following characteristics (A-1) and (B-1):
(A-1) comprises a base sequence of at least 10 consecutive bases in a base sequence showing 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO:15 or a base sequence complementary thereto; and (B-1) is labeled at only one of the 5' end or 3' end.
従って本発明はさらに、上記のような標識プローブを少なくとも２つ含む標識プローブセットの態様をも提供する。本発明の標識プローブセットは、例えば、融解曲線解析法を行う反応液中において、当該セットに含まれる複数の標識プローブを共存させるように使用され得る。一つの実施形態において、本発明の標識プローブセットは、少なくとも以下の第一の標識プローブ並びに第二の標識プローブを含む、検体試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために用いられる標識プローブセットである：
（Ａ－１）配列番号１５で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ－１）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されていることを特徴とする、第一の標識プローブ；並びに
（Ａ－２）配列番号１６で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列を含む；及び
（Ｂ－２）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されていることを特徴とする、第二の標識プローブ。
上記標識プローブセット（本明細書では、これを「核酸プローブセット」ともいう）における標識プローブの塩基配列、塩基長、蛍光標識などは、上記標識プローブにおいて詳述したものと同様である。本発明の標識プローブセットは、上記の本発明の標識プローブと同様にして使用され得る。
Therefore, the present invention further provides an embodiment of a labeled probe set comprising at least two of the above-mentioned labeled probes. The labeled probe set of the present invention can be used, for example, in a reaction solution in which a melting curve analysis method is performed, so that the multiple labeled probes contained in the set are coexistent. In one embodiment, the labeled probe set of the present invention is a labeled probe set used for detecting SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen sample, comprising at least the following first labeled probe and second labeled probe:
(A-1) a first labeled probe, characterized in that it comprises a base sequence having 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO:15 or a base sequence having at least 10 or more consecutive bases in a base sequence complementary thereto; and (B-1) a first labeled probe, characterized in that only either the 5' end or the 3' end is labeled; and (A-2) a base sequence having 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO:16 or a base sequence having at least 10 or more consecutive bases in a base sequence complementary thereto; and (B-2) a second labeled probe, characterized in that only either the 5' end or the 3' end is labeled.
The base sequence, base length, fluorescent label, etc. of the labeled probe in the above-mentioned labeled probe set (also referred to as "nucleic acid probe set" in this specification) are the same as those described in detail for the above-mentioned labeled probe. The labeled probe set of the present invention can be used in the same manner as the above-mentioned labeled probe of the present invention.
一つの好ましい実施形態において、上記核酸プローブ又は核酸プローブセットにおいて、（Ａ－１）の少なくとも１０塩基以上の塩基配列は、配列番号３～７のいずれかに示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列であり得る。他方の好ましい実施形態において、上記核酸プローブ又は核酸プローブセットにおいて、（Ａ－２）の少なくとも１０塩基以上の塩基配列は、配列番号１０～１４のいずれかに示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列であり得る。特に好ましい実施形態では、上記（Ａ－１）及び（Ａ－２）に記載の塩基配列を有する核酸プローブ又は核酸プローブセットを組み合わせて用いる。 In one preferred embodiment, in the above nucleic acid probe or nucleic acid probe set, the base sequence of at least 10 bases in (A-1) may be the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3 to 7 or a base sequence complementary thereto. In another preferred embodiment, in the above nucleic acid probe or nucleic acid probe set, the base sequence of at least 10 bases in (A-2) may be the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 10 to 14 or a base sequence complementary thereto. In a particularly preferred embodiment, a nucleic acid probe or a nucleic acid probe set having the base sequences described in (A-1) and (A-2) above is used in combination.
［複合体を検出する工程］
本発明の前記増幅産物を検出する工程において、核酸増幅産物と標識プローブとをハイブリダイズさせて形成せしめた複合体を検出する（３－２）の工程の態様は特に限定されず、当該分野で公知の任意の方法で実施することができる。
[Step of detecting the complex]
In the step of detecting the amplification product of the present invention, the embodiment of the step (3-2) of detecting a complex formed by hybridization of the nucleic acid amplification product with a labeled probe is not particularly limited, and can be carried out by any method known in the art.
一つの実施形態において、前記工程（３）は、以下の工程（３－ａ）～（３－ｃ）の少なくともひとつを含む態様であり得る：
（３－ａ）得られるうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（３－ｂ）前記工程（２）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、前記核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（３－ｃ）前記工程（２）の終了後に、得られうる増幅産物に該核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
前記（３－ａ）～（３－ｃ）のような工程によれば、簡便かつ高感度に、核酸増幅産物と核酸プローブとで形成される複合体の生成を検出することが可能となり得る。本発明の実施形態は、より迅速に核酸増幅産物の検出を行う観点から、（３－ｂ）または（３－ｃ）による検出工程が好ましい。特に（３－ｃ）すなわち融解曲線解析法による方法が好ましい。
In one embodiment, the step (3) may include at least one of the following steps (3-a) to (3-c):
(3-a) A step of hybridizing the nucleic acid probe to the obtainable amplification product and monitoring the progress of the nucleic acid amplification reaction in real time by measuring the fluorescence intensity of the reaction solution.
(3-b) After completion of the step (2), a step of hybridizing the nucleic acid probe to the amplification product that can be obtained and measuring the fluorescence intensity of the reaction solution to monitor the progress of the nucleic acid amplification reaction at an end point.
(3-c) After completion of the step (2), a step of hybridizing the nucleic acid probe to the amplification product that can be obtained and measuring the temperature dependence of the fluorescence intensity of the reaction solution.
According to the steps (3-a) to (3-c) described above, it is possible to easily and sensitively detect the formation of a complex formed between a nucleic acid amplification product and a nucleic acid probe. In an embodiment of the present invention, the detection step according to (3-b) or (3-c) is preferable from the viewpoint of detecting a nucleic acid amplification product more quickly. In particular, the method according to (3-c), i.e., the melting curve analysis method, is preferable.
［（３－ａ）核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニター］
核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする方法である。所謂、リアルタイムＰＣＲ法は、既知濃度のコントロール物質と比較することにより、定量解析が可能である。一方で、ＰＣＲのサイクル毎に測光する必要があるため、核酸増幅反応に掛かる時間が長くなる傾向がある。
[(3-a) Monitoring the progress of nucleic acid amplification reaction in real time]
This is a method for monitoring the progress of a nucleic acid amplification reaction in real time. The so-called real-time PCR method allows quantitative analysis by comparing with a control substance of known concentration. However, since photometry is required for each PCR cycle, the time required for the nucleic acid amplification reaction tends to be long.
［（３－ｂ）核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニター］
核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする方法もあるが、本発明においては、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターすることで、試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、エンドポイントでの蛍光強度等を比較することで標的核酸量もおおおその推定も可能である。
例えば、蛍光消光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする。核酸増幅反応終了後に、反応液の蛍光強度を測定する。反応後の反応液の蛍光強度を反応前の反応液の蛍光強度と比較することで、標的核酸の増幅の有無を確認できる。あるいは、反応後の反応液の蛍光強度をコントロール反応液の蛍光強度と比較することでも試料中に含まれる標的核酸の有無を確認することができる。コントロール反応液とは、測定したい試料の代わりに陰性と判明している試料あるいは陽性と判明している試料を加えた反応液である。
核酸増幅反応の進行は、一般的にリアルタイムでモニターする必要があるが、増幅検出工程をより迅速、簡便にする目的では、エンドポイントで測定することが好ましい。
(3-b) Monitoring the progress of nucleic acid amplification reaction at an endpoint
Although there are methods for monitoring the progress of a nucleic acid amplification reaction in real time, in the present invention, the progress of a nucleic acid amplification reaction is monitored at an end point, thereby enabling rapid detection of the target nucleic acid contained in a sample. Furthermore, the amount of the target nucleic acid can be roughly estimated by comparing the fluorescence intensity at the end point.
For example, the progress of the nucleic acid amplification reaction is monitored at an end point by measuring the fluorescence intensity of a reaction solution containing an oligonucleotide probe labeled with a fluorescent quenching dye. After the nucleic acid amplification reaction is completed, the fluorescence intensity of the reaction solution is measured. The presence or absence of amplification of the target nucleic acid can be confirmed by comparing the fluorescence intensity of the reaction solution after the reaction with the fluorescence intensity of the reaction solution before the reaction. Alternatively, the presence or absence of the target nucleic acid contained in the sample can also be confirmed by comparing the fluorescence intensity of the reaction solution after the reaction with the fluorescence intensity of a control reaction solution. A control reaction solution is a reaction solution to which a sample known to be negative or positive is added instead of the sample to be measured.
The progress of a nucleic acid amplification reaction generally needs to be monitored in real time, but for the purpose of making the amplification detection step quicker and easier, it is preferable to measure it at an end point.
［（３－ｃ）蛍光強度の温度依存性を測定］
蛍光強度の温度依存性を測定するとは、具体的には、反応液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度における蛍光強度を測定することである。得られた蛍光強度について温度で一次微分することにより、使用するオリゴヌクレオチドプローブに固有の融解温度（Ｔｍ値）を求めることができる。また、蛍光強度は目的に合わせて蛍光消光率等に変換してもよい。
Ｔｍ値を用いた標的核酸の検出、分析等を融解曲線分析という。一般的に、Ｔｍ値は、オリゴヌクレオチドがその相補鎖と二本鎖を形成している割合と二本鎖を形成せず一本鎖である割合が等しいときの温度をいう。Ｔｍ値は、塩基配列に固有の値であるため、融解曲線分析は標的核酸の塩基配列多型を分析する手法として使用できる。ここでいう塩基配列多型とは、一塩基多型、塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等を含む。
[(3-c) Measurement of temperature dependence of fluorescence intensity]
Specifically, the measurement of the temperature dependence of the fluorescence intensity means measuring the fluorescence intensity at each temperature while changing the temperature of the reaction solution from low to high. The melting temperature (Tm value) specific to the oligonucleotide probe used can be obtained by first-order differentiation of the obtained fluorescence intensity with respect to temperature. The fluorescence intensity may also be converted into a fluorescence quenching rate or the like according to the purpose.
The detection, analysis, etc. of target nucleic acid using Tm value is called melting curve analysis. In general, Tm value refers to the temperature at which the proportion of an oligonucleotide that forms a double strand with its complementary strand is equal to the proportion that does not form a double strand and is single stranded. Since Tm value is a value specific to a base sequence, melting curve analysis can be used as a method for analyzing base sequence polymorphism of target nucleic acid. Base sequence polymorphism here includes single base polymorphism, base substitution, base deletion, base insertion, etc.
一例として、融解曲線分析はＳＮＰ解析などにも応用されている。オリゴヌクレオチドプローブに対して標的核酸の塩基配列に変異がある場合、プローブがハイブリダイズした際に塩基がミスマッチしているため、一般的にＴｍ値は低くなる。したがって、Ｔｍ値の大きさを比較することで一塩基多型の解析（ＳＮＰ解析）も行うことができる。 As an example, melting curve analysis is also used in SNP analysis. When there is a mutation in the base sequence of the target nucleic acid relative to the oligonucleotide probe, the bases are mismatched when the probe hybridizes, and the Tm value is generally low. Therefore, single nucleotide polymorphism analysis (SNP analysis) can also be performed by comparing the magnitude of the Tm values.
［検体試料］
本発明において使用できる検体試料はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が疑われる被験体から採取した、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、唾液などが挙げられるが、これらに限定されない。生体試料を測定対象の検体試料とする場合、各生体試料に応じて、特に制限はされないが、希釈や懸濁、遠心、酵素処理などの前処理もしくは核酸抽出を行ってもよい。
[Specimen sample]
The specimen sample that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it may contain SARS-CoV-2. Examples include, but are not limited to, oral scrapings, pharyngeal swabs, nasal swabs, nasal aspirates, sputum, bronchial lavage fluid, alveolar lavage fluid, and saliva collected from subjects suspected of infection with SARS-CoV-2. When a biological sample is used as the specimen sample to be measured, pretreatment such as dilution, suspension, centrifugation, and enzyme treatment or nucleic acid extraction may be performed depending on each biological sample, although this is not particularly limited.
検体試料の採取方法、調製方法等は、特に制限されず、試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。特定の好ましい実施形態では、本発明に用いる検体試料は、ＲＮＡを単離・精製した試料でなくてもよく、例えば、生体から採取した検体をタンパク質分解酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）処理及び／又は熱処理（例えば、６０～１００℃で１秒～１０分間）によるタンパク分解変性処理をし、検体中に存在しているＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）やＤＮａｓｅ（ＤＮＡ分解酵素）を予め分解除去した試料をそのまま用いてもよい。 There are no particular limitations on the method of collecting and preparing the specimen sample, and known methods can be used depending on the type of sample and the purpose. In a particular preferred embodiment, the specimen sample used in the present invention does not have to be a sample from which RNA has been isolated and purified. For example, a specimen collected from a living body may be treated with a protease (e.g., proteinase K) and/or heat-treated (e.g., at 60-100°C for 1 second to 10 minutes) to degrade and denaturate the sample, and RNase (ribonuclease) and DNase (DNA degrading enzyme) present in the sample may be degraded and removed in advance, and the sample may be used as is.
核酸抽出の方法は、特に制限されないが、検体の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。核酸として、主にＲＮＡを抽出精製するものであっても、ＲＮＡ及びＤＮＡを区別せずに核酸を抽出精製するものでも良い。核酸抽出には、例えば、各メーカーから販売されているキット等を使用してもよい。たとえば、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）が挙げられる。また、用手による方法でも、自動抽出精製装置を用いても良い。 The method of nucleic acid extraction is not particularly limited, and known methods can be used depending on the type of sample and the purpose. The nucleic acid may be extracted and purified mainly from RNA, or may be extracted and purified without distinguishing between RNA and DNA. For nucleic acid extraction, kits sold by various manufacturers may be used. For example, QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) may be used. In addition, manual methods or automatic extraction and purification devices may be used.
特定の好ましい実施態様において、本発明の方法は、従来の核酸増幅反応において通常は必須と考えられていた核酸精製工程を省略することができる。後述の試験例の結果に示されるように、本発明の方法によれば、標的核酸以外の生体由来成分などの夾雑物（核酸増幅反応の阻害物質となり得る）を含む状態の検体試料においても、高感度にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出できる。核酸精製を行う場合、専用試薬が必要であることに加えて、作業が煩雑で手間と時間がかかるという問題がある。しかし、本発明の遺伝子増幅反応によれば、そのような核酸精製を行うための専用機器を準備する必要がなく、煩雑な操作を省くことが可能である。更に、遠心分離法にかかる時間も短縮することができることから、被験体からの生体試料採取から遺伝子検査結果を得るまでの時間を短縮することができ、例えば、検体採取から遺伝子検査結果が得られるまでの時間を１日以内、好ましくは半日以内、より好ましくは６時間以内、更に好ましくは３時間以内、なかでも好ましくは２時間以内（例えば、１時間以内）とすることが可能となり得る。このように、核酸を精製する工程を経ていない生体由来試料を用いて検出できる本発明の標識プローブ及び方法は、核酸精製の手間を省くことができ、簡便且つ短時間でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を可能にする。 In a particular preferred embodiment, the method of the present invention can omit the nucleic acid purification step that is usually considered essential in conventional nucleic acid amplification reactions. As shown in the results of the test examples described below, the method of the present invention can detect SARS-CoV-2 with high sensitivity even in specimen samples that contain contaminants such as biological components other than the target nucleic acid (which may be inhibitors of the nucleic acid amplification reaction). In addition to the need for dedicated reagents, nucleic acid purification has the problem of being complicated and time-consuming. However, the gene amplification reaction of the present invention does not require the preparation of dedicated equipment for such nucleic acid purification, and it is possible to omit complicated operations. Furthermore, since the time required for centrifugation can be shortened, the time from collection of a biological sample from a subject to obtaining a genetic test result can be shortened, and for example, the time from collection of a sample to obtaining a genetic test result can be within one day, preferably within half a day, more preferably within six hours, even more preferably within three hours, and especially preferably within two hours (for example, within one hour). In this way, the labeled probe and method of the present invention, which can be used to detect SARS-CoV-2 using biological samples that have not undergone a nucleic acid purification process, can eliminate the need for nucleic acid purification and enable simple and rapid detection of SARS-CoV-2.
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２とも呼ばれる、Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属の一種）は、２０１９年１２月に中国湖北省武漢市に初めて確認された新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因ウイルスである。これにて人に対して病原性をもつコロナウイルスは７種類となり、その内４種（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）は一般の風邪の原因の１０～１５％を占め、多くは軽症である。他の２種類のウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（２００２）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（２０１２））は, ＳＡＲＳ及びＭＥＲＳを引き起こし、ＭＥＲＳは中東地域で散発的に発生が続いている。そして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９は、２０１９年１２月以降、パンデミック（世界的大流行）をもたらしている。
[SARS-CoV-2]
SARS-CoV-2 (also known as Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, a species of the Betacoronavirus genus) is the causative virus of the new coronavirus disease (COVID-19), which was first identified in Wuhan, Hubei Province, China in December 2019. This brings the number of coronaviruses pathogenic to humans to seven, of which four (HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, and HCoV-HKU1) account for 10-15% of common cold cases, most of which are mild. The other two viruses (SARS-CoV (2002) and MERS-CoV (2012)) cause SARS and MERS, with MERS continuing to occur sporadically in the Middle East. And COVID-19, caused by SARS-CoV-2, has been a pandemic (global epidemic) since December 2019.
ＣＯＶＩＤ－１９の症状としては、無症状から上気道炎、肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等、幅広い病態を呈する。特に高齢者や基礎疾患のある方が感染すると重症化するリスクが高く、これまでに多くの死者が出ている。一方、罹患しても約８割の方は軽症で経過し、治癒する例も多いことが報告されている。但し、このような無症状感染者あるいは軽症感染者は、感染に気付かないこともあり、感染源となるおそれがある。また、インフルエンザに比べて呼吸器検体における病原体の数が少ないこと（１／１００～１／１，０００）などから検査診断が困難である。このような理由から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を簡便、迅速、高感度に検出ができる検査方法が、今日強く求められている。本発明では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に検出することが可能である。 The symptoms of COVID-19 range from asymptomatic to upper respiratory tract infection, pneumonia, and acute respiratory distress syndrome (ARDS). In particular, elderly people and those with underlying diseases are at high risk of developing severe symptoms, and many deaths have been reported so far. On the other hand, it has been reported that about 80% of infected people experience mild symptoms and many recover. However, such asymptomatic or mildly infected people may not realize they are infected and may become a source of infection. In addition, the number of pathogens in respiratory samples is small compared to influenza (1/100 to 1/1,000), making testing and diagnosis difficult. For these reasons, there is a strong demand today for a testing method that can detect SARS-CoV-2 easily, quickly, and with high sensitivity. The present invention makes it possible to specifically detect SARS-CoV-2.
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬］
本発明の別の実施態様として、試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための試薬が挙げられる。試薬には、前述で説明した本発明の核酸プローブ又は核酸プローブセットに加えて、逆転写反応（ＲＴ）、核酸増幅反応、検出に必要な成分が少なくとも含まれる。必要な成分は、それぞれ公知のものを用いることができる。例えば、逆転写用核酸プライマー、ＰＣＲ用核酸プライマーセット、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、マグネシウム塩等の無機塩類を少なくとも含むことが好ましい。逆転写用核酸プライマーを兼ねたＰＣＲ用核酸プライマーセット及び検出用核酸プローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数領域を増幅させるために複数セットを含むことができる。各成分の濃度は適宜調整できるが、例えば、核酸プローブは０．０１～１μＭが好ましく、０．０２～０．５μＭがより好ましい。核酸プローブセットとして使用する場合は、該プローブセットに含まれる各核酸プローブがそれぞれ上記濃度の範囲内であることが好ましい。核酸プライマーは０．０１～１０μＭが好ましい。逆転写酵素は０．０１～１０Ｕ／μＬが好ましく、０．０２～２Ｕ／μＬがより好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは０．０１～１Ｕ／ｕＬが好ましく、０．０２～０．５Ｕ／ｕＬがより好ましい。デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）は０．０２～１ｍＭが好ましく、０．１～０．５ｍＭがより好ましい。マグネシウム塩等の無機塩類は０．１～１０ｍＭが好ましく、１～５ｍＭがより好ましい。
[Reagents for detecting SARS-CoV-2]
Another embodiment of the present invention is a reagent for detecting SARS-CoV-2 that may be contained in a sample. The reagent contains at least components necessary for reverse transcription reaction (RT), nucleic acid amplification reaction, and detection, in addition to the nucleic acid probe or nucleic acid probe set of the present invention described above. The necessary components can be those known in the art. For example, it is preferable to contain at least a nucleic acid primer for reverse transcription, a nucleic acid primer set for PCR, a reverse transcriptase, a DNA polymerase, deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs), and inorganic salts such as magnesium salts. The nucleic acid primer set for PCR, which also serves as a nucleic acid primer for reverse transcription, and the nucleic acid probe for detection can contain multiple sets in order to amplify multiple regions of SARS-CoV-2. The concentration of each component can be appropriately adjusted, but for example, the nucleic acid probe is preferably 0.01 to 1 μM, and more preferably 0.02 to 0.5 μM. When used as a nucleic acid probe set, it is preferable that each nucleic acid probe contained in the probe set is within the above concentration range. The nucleic acid primer is preferably 0.01 to 10 μM. The reverse transcriptase is preferably at 0.01 to 10 U/μL, more preferably at 0.02 to 2 U/μL. The DNA polymerase is preferably at 0.01 to 1 U/uL, more preferably at 0.02 to 0.5 U/uL. The deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) are preferably at 0.02 to 1 mM, more preferably at 0.1 to 0.5 mM. The inorganic salts such as magnesium salts are preferably at 0.1 to 10 mM, more preferably at 1 to 5 mM.
さらに、非特異増幅の抑制や反応促進を目的として、当該技術分野で知られる添加物等を加えてもよい。非特異増幅の抑制を目的とする添加物として、公知の抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体やリン酸等を用いてもよい。反応促進を目的とする添加物として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、カルニチン、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ４０などが挙げられる。また、本発明では、ターゲットであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの分解を低減させるため、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤または抑制剤を添加してもよい。例えば、ＲＮａｓｅインヒビターが挙げられる。本発明では、これらの添加物を１種類以上組み合わせて使用してもよいが、これらに限定されない。 Furthermore, additives known in the art may be added for the purpose of suppressing non-specific amplification or promoting the reaction. As additives for suppressing non-specific amplification, known anti-DNA polymerase antibodies, phosphoric acid, etc. may be used. As additives for promoting the reaction, bovine serum albumin (BSA), protease inhibitors, single strand binding protein (SSB), T4 gene 32 protein, tRNA, sulfur or acetic acid-containing compounds, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, trimethylene glycol, formamide, acetamide, betaine, ectoine, trehalose, dextran, polyvinylpyrrolidone (PVP), gelatin, tetramethylammonium chloride (TMAC), tetramethylammonium hydroxide (TMAH), tetramethylammonium acetate (TMAA), polyethylene glycol, carnitine, Triton, Tween 20, Nonidet P40, etc. may be mentioned. In addition, in the present invention, an inhibitor or suppressor of RNase may be added to reduce degradation of the target genomic RNA of SARS-CoV-2. For example, an RNase inhibitor may be included. In the present invention, one or more of these additives may be used in combination, but is not limited to these.
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキット］
本発明の別の実施態様として、試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットが挙げられる。本発明のキットは、前述で説明した本発明の核酸プローブ又は核酸プローブセット、及び／又はこれらを含む試薬を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出できるように構成されていれば特に限定されない。例えば、本発明のキットは、被検出対象の存在を検出又は定量することができる遺伝子検査試薬及び／又は使用方法等を説明する使用説明書等を任意に含むことができる。例えば、前記核酸プローブを同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。また、陽性コントロール液や陰性コントロール液を含めることもできる。
[Kit for detecting SARS-CoV-2]
Another embodiment of the present invention is a kit for detecting SARS-CoV-2 that may be contained in a sample. The kit of the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described nucleic acid probe or nucleic acid probe set of the present invention, and/or a reagent containing them, and is configured to detect SARS-CoV-2. For example, the kit of the present invention may optionally contain a genetic testing reagent capable of detecting or quantifying the presence of a target substance and/or an instruction manual for use that explains the method of use, etc. For example, the nucleic acid probes enclosed in the same container or in separate containers may be packaged in, for example, a single package, and provided in a form that includes information on the method of use of the kit. A positive control solution or a negative control solution may also be included.
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。本発明は下記実施例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically explained below based on examples. The present invention is not limited to the following examples.
〔実施例１：核酸プローブの選抜 Ｎ１領域〕
（１）試料の調製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性コントロールＲＮＡ（ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社））を滅菌水で段階希釈し、２.５、５、1０コピー／テストとなるように調製し、試料とした。
（２）逆転写、核酸増幅、融解曲線解析、及び判定
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を行った。逆転写、核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。判定は、融解曲線解析にてピークが得られた場合に陽性と判定した。各濃度水準をｎ＝８で測定を行い、陽性数を８で除算することで検出率を算出した。
Example 1: Selection of nucleic acid probe N1 region
(1) Sample Preparation Positive control RNA for SARS-CoV-2 (EDX SARS-CoV-2 Standard (Bio-Rad Laboratories, Inc.)) was serially diluted with sterile water to prepare samples with concentrations of 2.5, 5, and 10 copies/test.
(2) Reverse transcription, nucleic acid amplification, melting curve analysis, and judgment The above samples were added to the following reagents, and SARS-CoV-2 was detected under the following conditions. GENECUBE (registered trademark) manufactured by Toyobo was used for reverse transcription, nucleic acid amplification, and melting curve analysis. The result was judged as positive when a peak was obtained in the melting curve analysis. Measurements were performed at each concentration level (n=8), and the detection rate was calculated by dividing the number of positives by 8.
試薬
配列番号３～７で示される各プローブの性能を評価するため、以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号１で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号３～７で示される各プローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
５Ｕ／μＬ 逆転写酵素（東洋紡製） ０．５μＬ
試料４μＬ
Reagents To evaluate the performance of each of the probes represented by SEQ ID NOs: 3 to 7, a solution containing the following reagents was prepared.
KOD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 3 μL
PPD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
IC Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 1 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 2 1.5 μL
10 μM each of the probes shown in SEQ ID NOs: 3 to 7 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
5U/μL reverse transcriptase (Toyobo) 0.5μL
Sample 4 μL
逆転写、核酸増幅および融解曲線解析
４２℃・２分
９７℃・１５秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Reverse transcription, nucleic acid amplification and melting curve analysis 42℃・2 minutes 97℃・15 seconds (one cycle)
97℃・1 sec 58℃・3 sec 63℃・5 sec (60 cycles)
94°C for 30 seconds, 39°C for 30 seconds, 40°C to 75°C (temperature rises at 0.09°C/second)
（３）結果
下記の表１は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、検出率をまとめた表である。本検討により、配列番号３～７の核酸プローブの中では配列番号５に示す核酸プローブが最も高い検出率を示すことが明らかとなった。
(3) Results Table 1 below shows the detection rates obtained by carrying out nucleic acid amplification detection under the above conditions. This study revealed that the nucleic acid probe shown in SEQ ID NO:5 showed the highest detection rate among the nucleic acid probes shown in SEQ ID NO:3 to 7.
〔実施例２：核酸プローブの選抜 Ｎ２領域〕
（１）試料の調製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性コントロールＲＮＡ（ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社））を滅菌水で段階希釈し、２.５、５、1０コピー／テストとなるように調製し、試料とした。
（２）逆転写、核酸増幅、融解曲線解析、及び判定
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を行った。逆転写、核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。判定は、融解曲線解析にてピークが得られた場合に陽性と判定した。各濃度水準をｎ＝８で測定を行い、陽性数を８で除算することで検出率を算出した。
Example 2: Selection of nucleic acid probes N2 region
(1) Sample Preparation Positive control RNA for SARS-CoV-2 (EDX SARS-CoV-2 Standard (Bio-Rad Laboratories, Inc.)) was serially diluted with sterile water to prepare samples with concentrations of 2.5, 5, and 10 copies/test.
(2) Reverse transcription, nucleic acid amplification, melting curve analysis, and judgment The above samples were added to the following reagents, and SARS-CoV-2 was detected under the following conditions. GENECUBE (registered trademark) manufactured by Toyobo was used for reverse transcription, nucleic acid amplification, and melting curve analysis. The result was judged as positive when a peak was obtained in the melting curve analysis. Measurements were performed at each concentration level (n=8), and the detection rate was calculated by dividing the number of positives by 8.
試薬
配列番号１０～１４で示される各プローブの性能を評価するため、以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号８で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号９で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１０～１４で示される各プローブ（配列番号１０、１３は、３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識；配列番号１１～１２、１４は５’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
５Ｕ／μＬ 逆転写酵素（東洋紡製） ０．５μＬ
試料４μＬ
Reagents To evaluate the performance of each of the probes represented by SEQ ID NOs: 10 to 14, a solution containing the following reagents was prepared.
KOD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 3 μL
PPD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
IC Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 8 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 9 1.5 μL
10 μM each of the probes shown in SEQ ID NOs: 10 to 14 (SEQ ID NOs: 10 and 13 are labeled with BODIPY-FL at the 3'end; SEQ ID NOs: 11 to 12 and 14 are labeled with BODIPY-FL at the 5' end) 0.125 μL
5U/μL reverse transcriptase (Toyobo) 0.5μL
Sample 4 μL
逆転写、核酸増幅および融解曲線解析
４２℃・２分
９７℃・１５秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Reverse transcription, nucleic acid amplification and melting curve analysis 42℃・2 minutes 97℃・15 seconds (one cycle)
97℃・1 sec 58℃・3 sec 63℃・5 sec (60 cycles)
94°C for 30 seconds, 39°C for 30 seconds, 40°C to 75°C (temperature rises at 0.09°C/second)
（３）結果
下記の表２は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、検出率をまとめた表である。本検討により、配列番号１０～１４の核酸プローブの中では配列番号１０に示す核酸プローブが最も高い検出率を示すことが明らかとなった。
(3) Results Table 2 below shows the detection rates of nucleic acid amplification detection performed under the above conditions. This study revealed that the nucleic acid probe shown in SEQ ID NO: 10 showed the highest detection rate among the nucleic acid probes of SEQ ID NO: 10 to 14.
〔実施例３：核酸プローブの組合せの検討〕
（１）試料の調製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性コントロールＲＮＡ（ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社））を滅菌水で段階希釈し、２.５、５、1０コピー／テストとなるように調製し、試料とした。
（２）逆転写、核酸増幅、融解曲線解析、及び判定
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を行った。逆転写、核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。判定は、融解曲線解析にてピークが得られた場合に陽性と判定した。各濃度水準をｎ＝８で測定を行い、陽性数を８で除算することで検出率を算出した。
Example 3: Examination of combinations of nucleic acid probes
(1) Sample Preparation Positive control RNA for SARS-CoV-2 (EDX SARS-CoV-2 Standard (Bio-Rad Laboratories, Inc.)) was serially diluted with sterile water to prepare samples with concentrations of 2.5, 5, and 10 copies/test.
(2) Reverse transcription, nucleic acid amplification, melting curve analysis, and judgment The above samples were added to the following reagents, and SARS-CoV-2 was detected under the following conditions. GENECUBE (registered trademark) manufactured by Toyobo was used for reverse transcription, nucleic acid amplification, and melting curve analysis. The result was judged as positive when a peak was obtained in the melting curve analysis. Measurements were performed at each concentration level (n=8), and the detection rate was calculated by dividing the number of positives by 8.
試薬
Ｎ１領域をターゲットとしたプライマープローブセットと、Ｎ２領域をターゲットとしたプライマープローブセットを同一の反応系に入れて共存させた場合について評価するために、それぞれ単独使用で検出率の高かった配列番号５あるいは３、及び、配列番号１０あるいは１３を組み合わせて以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号１で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号５あるいは３で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
１０μＭ 配列番号８で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号９で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１０あるいは１３で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
５Ｕ／μＬ 逆転写酵素（東洋紡製） ０．５μＬ
試料４μＬ
Reagents In order to evaluate the coexistence of a primer probe set targeting the N1 region and a primer probe set targeting the N2 region in the same reaction system, a solution containing the following reagents was prepared by combining sequence numbers 5 or 3, and sequence numbers 10 or 13, which had high detection rates when used alone.
KOD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 3 μL
PPD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
IC Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 1 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 2 1.5 μL
10 μM Probe represented by SEQ ID NO: 5 or 3 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 8 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 9 1.5 μL
10 μM Probe shown by SEQ ID NO: 10 or 13 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
5U/μL reverse transcriptase (Toyobo) 0.5μL
Sample 4 μL
逆転写、核酸増幅および融解曲線解析
４２℃・２分
９７℃・１５秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Reverse transcription, nucleic acid amplification and melting curve analysis 42℃・2 minutes 97℃・15 seconds (one cycle)
97℃・1 sec 58℃・3 sec 63℃・5 sec (60 cycles)
94°C for 30 seconds, 39°C for 30 seconds, 40°C to 75°C (temperature rises at 0.09°C/second)
（３）結果
下記の表３は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、検出率をまとめた表である。この結果に示されるように、本発明の標識プローブを複数組み合わせて使用することによって、特に低コピー条件下におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出率が向上することが確認された。本検討により、Ｎ１領域検出用の配列番号５を含むプライマープローブセットとＮ２領域検出用の配列番号１０を含むプライマープローブセットを組み合わせた場合にもっとも検出率が高く、高感度に検出できることが明らかとなった。そこで、以降の実施例では、本組み合わせにて測定を行った。
(3) Results Table 3 below summarizes the detection rates when nucleic acid amplification detection was performed under the above conditions. As shown in the results, it was confirmed that the detection rate of SARS-CoV-2, especially under low copy number conditions, is improved by using a combination of multiple labeled probes of the present invention. This study revealed that the highest detection rate and highest sensitivity were achieved when a primer probe set including SEQ ID NO: 5 for detecting the N1 region was combined with a primer probe set including SEQ ID NO: 10 for detecting the N2 region. Therefore, in the following examples, measurements were performed using this combination.
〔実施例４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最小検出感度の測定〕
（１）試料の調製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性コントロールＲＮＡ２種（ＡＭＰＬＩＲＵＮ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ＣＩＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社））及びＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社））を滅菌水で段階希釈し、それぞれ１、２.５、５、１０、２５、５０コピー／テストとなるように調製し、試料とした。
（２）逆転写、核酸増幅、融解曲線解析、及び判定
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を行った。逆転写、核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。判定は、融解曲線解析にてピークが得られた場合に陽性と判定した。各濃度水準をｎ＝８で測定を行い、陽性数を８で除算検出率を算出した。
Example 4: Measurement of minimum detection sensitivity of SARS-CoV-2
(1) Sample preparation Two types of SARS-CoV-2 positive control RNA (AMPLIRUN SARS-CoV-2 RNA CINTROL (Vircell)) and EDX SARS-CoV-2 Standard (Bio-Rad Laboratories)) were serially diluted with sterile water to prepare samples with concentrations of 1, 2.5, 5, 10, 25, and 50 copies/test, respectively.
(2) Reverse transcription, nucleic acid amplification, melting curve analysis, and judgment The above samples were added to the following reagents, and SARS-CoV-2 was detected under the following conditions. GENECUBE (registered trademark) manufactured by Toyobo was used for reverse transcription, nucleic acid amplification, and melting curve analysis. The result was judged as positive when a peak was obtained in the melting curve analysis. Measurements were performed at each concentration level (n=8), and the number of positives was divided by 8 to calculate the detection rate.
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号１で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号５で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
１０μＭ 配列番号８で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号９で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１０で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
５Ｕ／μＬ 逆転写酵素（東洋紡製） ０．５μＬ
試料４μＬ
Reagents A solution containing the following reagents was prepared:
KOD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 3 μL
PPD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
IC Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 1 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 2 1.5 μL
10 μM Probe represented by SEQ ID NO:5 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 8 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 9 1.5 μL
10 μM Probe represented by SEQ ID NO: 10 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
5U/μL reverse transcriptase (Toyobo) 0.5μL
Sample 4 μL
逆転写、核酸増幅および融解曲線解析
４２℃・２分
９７℃・１５秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Reverse transcription, nucleic acid amplification and melting curve analysis 42℃・2 minutes 97℃・15 seconds (one cycle)
97℃・1 sec 58℃・3 sec 63℃・5 sec (60 cycles)
94°C for 30 seconds, 39°C for 30 seconds, 40°C to 75°C (temperature rises at 0.09°C/second)
（３）結果
下記の表４は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を低濃度で検出した結果をまとめた表である。ｎ＝８測定において検出された数及び検出率（陽性数を８で除算した百分率）を示している。表４より本発明の測定方法は、検体を用いない純系では２.５コピー／テストまで検出できることが明らかとなった。
(3) Results Table 4 below summarizes the results of nucleic acid amplification detection performed under the above conditions to detect SARS-CoV-2 at low concentrations. The table shows the number of detections and the detection rate (percentage obtained by dividing the number of positives by 8) in n=8 measurements. Table 4 reveals that the measurement method of the present invention can detect up to 2.5 copies/test in a pure system that does not use a specimen.
〔実施例５：鼻咽頭拭い液を用いた抽出済み検体に対するスパイク試験〕
（１）試料の調製
鼻咽頭拭い液（陰性検体）１６例を、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて処理し、ＲＮＡ抽出液を調製した。これらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性コントロールＲＮＡ２種（ＡＭＰＬＩＲＵＮ（Ｒ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社）及び、ＥＤＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｔａｎｄａｒｄ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社））を１０コピー／テストとなるようにスパイクし、試料とした。
（２）逆転写、核酸増幅、融解曲線解析、及び判定
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を行った。逆転写、核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。判定は、融解曲線解析にてピークが得られた場合に陽性と判定した。
Example 5: Spiking of extracted samples using nasopharyngeal swabs
(1) Sample preparation Sixteen nasopharyngeal swabs (negative specimens) were treated with QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) to prepare RNA extracts. These were spiked with two types of SARS-CoV-2 positive control RNA (AMPLIRUN® SARS-CoV-2 RNA CONTROL (Vircell) and EDX SARS-CoV-2 Standard (Bio-Rad Laboratories)) at 10 copies/test to prepare samples.
(2) Reverse transcription, nucleic acid amplification, melting curve analysis, and judgment The above samples were added to the following reagents, and SARS-CoV-2 was detected under the following conditions. GENECUBE (registered trademark) manufactured by Toyobo was used for reverse transcription, nucleic acid amplification, and melting curve analysis. The result was judged as positive when a peak was obtained in the melting curve analysis.
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号１で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号５で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
１０μＭ 配列番号８で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号９で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１０で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
５Ｕ／μＬ 逆転写酵素（東洋紡製） ０．５μＬ
試料４μＬ
Reagents A solution containing the following reagents was prepared:
KOD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 3 μL
PPD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
IC Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 1 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 2 1.5 μL
10 μM Probe represented by SEQ ID NO:5 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 8 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 9 1.5 μL
10 μM Probe represented by SEQ ID NO: 10 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
5U/μL reverse transcriptase (Toyobo) 0.5μL
Sample 4 μL
逆転写、核酸増幅および融解曲線解析
４２℃・２分
９７℃・１５秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Reverse transcription, nucleic acid amplification and melting curve analysis 42℃・2 minutes 97℃・15 seconds (one cycle)
97℃・1 sec 58℃・3 sec 63℃・5 sec (60 cycles)
94°C for 30 seconds, 39°C for 30 seconds, 40°C to 75°C (temperature rises at 0.09°C/second)
（３）結果
下記の表５は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出した結果をまとめた表である。２種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性コントロールＲＮＡを各々１０コピー／テストでスパイクした鼻咽頭拭い液（ＲＮＡ抽出液）１６検体の測定において、３２アッセイ全例でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出した。これにより、本発明の測定方法は、精製したＲＮＡ抽出液を試料に用いた場合、安定して１０コピー／テストの検出ができることが明らかとなった。
(3) Results Table 5 below summarizes the results of nucleic acid amplification detection under the above conditions and detection of SARS-CoV-2. In the measurement of 16 nasopharyngeal swabs (RNA extracts) spiked with two types of SARS-CoV-2 positive control RNA at 10 copies/test each, SARS-CoV-2 was detected in all 32 assays. This demonstrates that the measurement method of the present invention can stably detect 10 copies/test when purified RNA extracts are used as samples.
〔実施例６：疑似ウイルス検出試験(純系）〕
（１）試料の調製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡが組み込まれた疑似ウイルス（ＡｃｃｕＰｌｅｘ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｋｉｔ（ＳｅｒａＣａｒｅ社））を５コピー／テストとなるように希釈した。続いて、希釈液をプロテイナーゼＫ（関東化学社）及び熱処理にて簡易ＲＮＡ抽出液を調製し、これを試料とした。
（２）逆転写、核酸増幅、融解曲線解析、及び判定
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を行った。逆転写、核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。判定は、融解曲線解析にてピークが得られた場合に陽性と判定した。
[Example 6: Pseudovirus detection test (pure system)]
(1) Preparation of samples A pseudovirus incorporating the genome RNA of SARS-CoV-2 (AccuPlex SARS-CoV-2 Reference Material Kit (SeraCare)) was diluted to 5 copies/test. The diluted solution was then treated with proteinase K (Kanto Chemical) and heat treatment to prepare a simple RNA extract, which was used as a sample.
(2) Reverse transcription, nucleic acid amplification, melting curve analysis, and judgment The above samples were added to the following reagents, and SARS-CoV-2 was detected under the following conditions. GENECUBE (registered trademark) manufactured by Toyobo was used for reverse transcription, nucleic acid amplification, and melting curve analysis. The result was judged as positive when a peak was obtained in the melting curve analysis.
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号１で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号５で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
１０μＭ 配列番号８で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号９で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１０で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
５Ｕ／μＬ 逆転写酵素（東洋紡製） ０．５μＬ
試料４μＬ
Reagents A solution containing the following reagents was prepared:
KOD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 3 μL
PPD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
IC Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 1 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 2 1.5 μL
10 μM Probe represented by SEQ ID NO:5 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 8 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 9 1.5 μL
10 μM Probe represented by SEQ ID NO: 10 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
5U/μL reverse transcriptase (Toyobo) 0.5μL
Sample 4 μL
逆転写、核酸増幅および融解曲線解析
４２℃・２分
９７℃・１５秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Reverse transcription, nucleic acid amplification and melting curve analysis 42℃・2 minutes 97℃・15 seconds (one cycle)
97℃・1 sec 58℃・3 sec 63℃・5 sec (60 cycles)
94°C for 30 seconds, 39°C for 30 seconds, 40°C to 75°C (temperature rises at 0.09°C/second)
（３）結果
下記の表６は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出した結果をまとめた表である。ｎ＝８アッセイ全てで５コピー／テストの疑似ウイルスを検出した。これにより本発明の測定方法は、極めて低コピー数まで検出が可能であることが明らかとなった。
(3) Results Table 6 below shows the results of nucleic acid amplification detection performed under the above conditions and detecting SARS-CoV-2. Five copies/test of the pseudovirus were detected in all eight assays (n=8). This demonstrates that the measurement method of the present invention is capable of detecting even extremely low copy numbers.
〔実施例７：疑似ウイルススパイク試験(唾液検体）〕
（１）試料の調製
唾液検体(１０例）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡが組み込まれた疑似ウイルス（ＡｃｃｕＰｌｅｘ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｋｉｔ（ＳｅｒａＣａｒｅ社））を１０コピー／テストの濃度となるようにスパイクした。続いて、プロテイナーゼＫ（関東化学社）及び熱処理にて簡易ＲＮＡ抽出液を調製し、これを試料とした。本試料は、さらなる核酸の単離及び精製処理を行わずそのまま使用したため、生体由来の夾雑物質を含む試料に相当する。
（２）逆転写、核酸増幅、融解曲線解析、及び判定
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を行った。逆転写、核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。判定は、融解曲線解析にてピークが得られた場合に陽性と判定した。
Example 7: Pseudovirus spike test (saliva sample)
(1) Sample preparation Saliva samples (10 cases) were spiked with a pseudovirus incorporating SARS-CoV-2 genomic RNA (AccuPlex SARS-CoV-2 Reference Material Kit (SeraCare)) to a concentration of 10 copies/test. Next, a simple RNA extract was prepared using proteinase K (Kanto Chemical) and heat treatment, and this was used as the sample. This sample was used as is without further nucleic acid isolation and purification treatment, and therefore corresponds to a sample containing biological contaminants.
(2) Reverse transcription, nucleic acid amplification, melting curve analysis, and judgment The above samples were added to the following reagents, and SARS-CoV-2 was detected under the following conditions. GENECUBE (registered trademark) manufactured by Toyobo was used for reverse transcription, nucleic acid amplification, and melting curve analysis. The result was judged as positive when a peak was obtained in the melting curve analysis.
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１μＬ
１０μＭ 配列番号１で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号２で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号５で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
１０μＭ 配列番号８で示されるプライマー ０．２５μＬ
１０μＭ 配列番号９で示されるプライマー １．５μＬ
１０μＭ 配列番号１０で示されるプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬで標識） ０．１２５μＬ
５Ｕ／μＬ 逆転写酵素（東洋紡製） ０．５μＬ
試料４μＬ
Reagents A solution containing the following reagents was prepared:
KOD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 3 μL
PPD Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
IC Mix (Genecube® Test Basic, Toyobo) 1 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 1 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 2 1.5 μL
10 μM Probe represented by SEQ ID NO:5 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 8 0.25 μL
10 μM Primer shown in SEQ ID NO: 9 1.5 μL
10 μM Probe represented by SEQ ID NO: 10 (labeled at the 3' end with BODIPY-FL) 0.125 μL
5U/μL reverse transcriptase (Toyobo) 0.5μL
Sample 4 μL
逆転写、核酸増幅および融解曲線解析
４２℃・２分
９７℃・１５秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Reverse transcription, nucleic acid amplification and melting curve analysis 42℃・2 minutes 97℃・15 seconds (one cycle)
97℃・1 sec 58℃・3 sec 63℃・5 sec (60 cycles)
94°C for 30 seconds, 39°C for 30 seconds, 40°C to 75°C (temperature rises at 0.09°C/second)
（３）結果
下記の表７は、上記の条件で核酸増幅検出を行い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出した結果をまとめた表である。疑似ウイルスを１０コピー／テストでスパイクした唾液検体の簡易ＲＮＡ抽出液１０例をｎ＝２測定した全２０アッセイでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することができた。これより、本発明の測定方法は、核酸の単離及び精製処理をしていない、生体由来の夾雑物質を含む試料に対しても増幅阻害を受けることなく、安定してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出できることが明らかとなった。すなわち、検体用来の核酸増幅阻害物質による増幅阻害に対し高い耐性を持つことが明らかとなった。
(3) Results Table 7 below summarizes the results of nucleic acid amplification detection under the above conditions and detection of SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 could be detected in a total of 20 assays, in which 10 simple RNA extracts from saliva samples spiked with 10 copies of pseudovirus per test were measured (n=2). This demonstrated that the measurement method of the present invention can stably detect SARS-CoV-2 without amplification inhibition even in samples that have not been subjected to nucleic acid isolation and purification treatment and contain biological contaminants. In other words, it was demonstrated that the method has high resistance to amplification inhibition by nucleic acid amplification inhibitors originally used in samples.
本発明の核酸プローブを使用することで簡便、高感度に試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出できる。従って、例えば、本発明は従来検出が難しかったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を低濃度で含む試料や、簡易ＲＮＡ抽出した試料に対しても、迅速かつ確実に検出することを可能とし、臨床診断等などにおいて大きく貢献することが期待できる。 By using the nucleic acid probe of the present invention, SARS-CoV-2 that may be present in a sample can be detected easily and with high sensitivity. Therefore, for example, the present invention makes it possible to rapidly and reliably detect samples that contain low concentrations of SARS-CoV-2, which was previously difficult to detect, or samples from which simple RNA has been extracted, and is expected to make a significant contribution to clinical diagnosis, etc.
Claims (16)
（Ａ）配列番号３、５～７若しくは配列番号１０、１３のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる；及び
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。 A labeled probe used to detect SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen sample, the labeled probe having the following characteristics (A) and (B):
(A) consisting of a base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3 , 5 to 7, or 10 and 13 , or a base sequence complementary thereto; and (B) only one of the 5' end or 3' end is labeled.
（Ａ－１）配列番号３、５～７のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる；及び
（Ｂ－１）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されていることを特徴とする、第一の標識プローブ；並びに
（Ａ－２）配列番号１０、１３のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる；及び
（Ｂ－２）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されていることを特徴とする、第二の標識プローブ。 A labeled probe set used for detecting SARS-CoV-2 that may be contained in a specimen sample, comprising at least the following first labeled probe and second labeled probe:
(A-1) a first labeled probe, characterized in that it consists of a base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3 , 5 to 7, or a base sequence complementary thereto; and (B-1) a first labeled probe, characterized in that only either the 5' end or the 3' end is labeled; and (A-2) a first labeled probe, characterized in that it consists of a base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 10 and 13 , or a base sequence complementary thereto; and (B-2) a second labeled probe, characterized in that only either the 5' end or the 3' end is labeled.
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| National Center for Immunization and Respiratory Diseases (U.S.). Division of Viral Diseases，2019-novel coronavirus (2019-nCov) real-time rRT-PCR panel primers and probes，CDC，2020年01月24日 |
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