JPS6161065B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6161065B2 JPS6161065B2 JP10666979A JP10666979A JPS6161065B2 JP S6161065 B2 JPS6161065 B2 JP S6161065B2 JP 10666979 A JP10666979 A JP 10666979A JP 10666979 A JP10666979 A JP 10666979A JP S6161065 B2 JPS6161065 B2 JP S6161065B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- latex
- echovirus
- antigen
- sensitized
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
本発明はエコーウイルス感染症の診断用感作ラ
テツクスに関するものであり、さらに詳しくはラ
テツクス粒子にエコーウイルス抗原を結合させて
なるエコーウイルス受身ラテツクス凝集反応用感
作ラテツクスに関するものである。 エコーウイル（Echovirus）は、大きさ28nｍ
のRNAウイルスで、ピコルナウイルス
（picornavirus）群の中の腸管ウイルス
（Enterovirus）に属する。すなわち糞便より経口
的に人から人へ感染するウイルスである。このエ
コーウイルスは、これに感染しても多くは不顕性
感染におわるが、時として発症する。この症状は
齦膜炎、ポリオ様麻痺、発疹、上気道炎、夏期に
おける下痢などで、神経症状から呼吸器疾患、腸
管系疾患にわたる非常に広範囲の多彩な症状を示
す感染症であり、このエコーウイルス感染症に特
有の臨床所見がみられず、従つて他の病原による
感染症と臨床所見によつて鑑別することはほとん
ど不可能である。 この、エコーウイルス感染症の血清学的診断法
としては、現在、中和反応（Neutalization
Test、以下NTと略記する）と補体結合反応
（Complement Fixation Test以下CFと略記す
る）が行われている。このうち、CFは診療機関
で広く実施されている検査法であるが、この反応
はエコーウイルスに関しては非常に感度が低く、
多くの場合抗体が検出できず、エコーウイルス感
染症でありながら陰性と判断されることが多い。
これに反して、NTはCFよりも高い感度を示し、
かつ特異的であるので、すぐれた反応であるが、
組織培養によるウイルスの培養を行なわなければ
ならないので、特別な設備と多くの労力を要し、
通常用いる診断法として応用することはほとんど
不可能に近い。 このエコーウイルス感染症を確実に診断するこ
とは、治療方針の設定、予後の予測に必須である
ばかりではなく、流行の予測などの公衆衛生上の
観点からも極めて重要である。 本発明者は上記した従来のエコーウイルス診断
法における欠点を克服すべく鋭意研究を行なつた
結果、エコーウイルス抗原を結合させた感作ラテ
ツクスを用い、受身ラテツクス凝集反応により、
高感度でしかも特異的にエコーウイルス感染症を
鑑別診断することができることを見出し、本発明
を完成した。 本発明の目的は、ラテツクス粒子にエコーウイ
ルス抗原を結合してなるエコーウイルス感染症診
断用感作ラテツクスを提供することである。 本発明の感作ラテツクス製造に用いるエコーウ
イルス抗原は、ウイルスビリオンそのものであ
り、その性質および分離方法は周知である。例え
ば、LLCMK2などの培養細胞にエコーウイルス
を高い感染度で感染させ、約６時間後、凍結融解
をくりかえすことによつて、細胞内および上清中
のウイルス抗原を得ることができる。この試料か
らは、超遠心法、あるいはポリエチレングリコー
ルを用いる遠心法により容易にウイルスビリオン
のみを集めることができる。 上記エコーウイルス抗原によつて前記ラテツク
ス粒子を感作するには、ラテツクス粒子とウイル
ス抗原を生理食塩液、緩衝液などの中で接触させ
ればよい。この場合かきまぜまたはふりまぜによ
つて接触時間を短縮することができる。この感作
処理は、一般に、PH約6.4〜9.0、温度約４〜37℃
で行なう。感作処理後、水溶液で洗浄することに
よつて未吸着の過剰の抗原を除去する。この感作
洗浄後、さらにラテツクス粒子に吸着される性状
を有する物質たとえばウシ血清アルブミンなどで
抗原未吸着部分を飽和して、もはや何も吸着しな
いようにしておく。 上記のようにして得たラテツクス試薬は、通常
約0.5％のラテツクス粒子懸濁液として使用す
る。 上記の感作ラテツクスを長期にわたつて保存す
るには保存液中に懸濁させて氷室に保存してもよ
く、あるいは保護剤を含む媒体とともに凍結乾燥
して、凍結乾燥品として保存してもよい。凍結乾
燥品の場合は使用に際しては感作ラテツクスに希
釈液を加えて診断液を調製する。 本発明の感作ラテツクスがエコーウイルス抗体
に対し特異的に反応して凝集を起すこと、また正
常抗原感作ラテツクスは上記抗体に全く反応しな
いことから本発明の感作ラテツクスはラテツクス
粒子にエコーウイルス抗原が結合したものである
といえる。本発明に用いる高比重ポリスチレンラ
テツクスは、比重1.14好ましくは比重1.2以上の
ポリスチレンラテツクスをいう。ポリスチレンラ
テツクスの比重が小さいと、感作ラテツクスの凝
集による沈降に時間がかかり、分析時間が長くな
つて好ましくない。 本発明において用いられるラテツクスとして
は、上記の高比重ポリスチレンが最も好適なもの
であるが、この他に、カルボキシル化ポリスチレ
ン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−
ジビンルベンゼン共重合体、アクリロニトリル−
ブタジエン−スチレン共重合体なども用いること
ができる。 本発明の感作ラテツクスを用いたエコーウイル
ス感染症の診断は、本発明の感作ラテツクス懸濁
液をヒトまたは動物の血清などの体液もしくはそ
の希釈液と接触させ、受身ラテツクス凝集反応に
基づく管底凝集像を観察することによつて行う
が、手法としてはマイクロタイター法によるのが
最も好ましく、本発明の感作ラテツクスを用いた
マイクロタイター法によれば、(イ)手技が極めて簡
単であり、(ロ)約10時間で判定が可能であり、(ハ)感
度が極めて高く（CFの100〜1000倍）(ニ)さらに担
体がラテツクスであるために、担体に対する抗体
が人血中に存在しないので担体による血清の前処
理がすべて不要になる。しかも以上詳記したとこ
ろより明らかなように、本発明のエコーウイルス
感染症診断用感作ラテツクスは、抗原を組織培養
で調製するため、CF抗原とほゞ同一の低コスト
で製造することができる上、生血球、補体、溶血
素などを使用しないため、全体として診断に要す
る費用はCF法に比較してかなり低いものにな
る。すなわち本発明は、従来エコーウイルス感染
症の診断に用いられたことのない受身ラテツクス
凝集反応用感作ラテツクスを提供し、本発明の感
作ラテツクスを用いた診断法によつてエコーウイ
ルスの抗体を高感度で迅速に検出し、患者の診断
を確実にしたのはもちろんのこと、さらに、ヒト
の抗体測定によるエコーウイルス感染症の流行予
測など、公衆衛生上、疫学上の要請に応えること
ができるほか、期限切れの輪血用血液から特異的
血清療法用のガンマーグロブリン製剤を調製する
時の抗体スクリーニングにも有用である。現在ま
でにラテツクス粒子にエコーウイルス抗原を感作
した例は全く交献未載であり、マイクロタイター
法による受身ラテツクス凝集反応は全く新規なも
のである。 以下調製例および実施例を示して本発明をさら
に詳しく説明するが、本発明はその要旨を超えな
い限りこれらによつて限定されるものではない。 調製例 １ 抗原の調製 LLCMK2細胞の単層培養にFchovirus Type7
（Wallace株）を感染の度合（multiplicity of
infection）50で接種し、37℃で６時間培養した。
培養びんから細胞を剥離し、ドライアイス−メタ
ノールと温湯で凍結融解を３回くりかえして細胞
を破壊し、これを10000rpm30分遠心して上清を
分取し、この上清にポリエチレングリコール6000
を８％加え、室温に２時間、４℃に一夜おいた
後、5000rpm15分遠心してウイルスを沈渣として
集め、培養液の1/100容のリン酸塩緩衝食塩液
（以下PBSという）に懸濁してから5000rpm30分
遠心して上清をとり、抗原とした。 他の型のエコーウイルスについても同様にして
抗原を調製した。またウイルスを感染させないで
全く同様にして調製した抗原をつくり、これを正
常抗原として対照に用いた。このようにして調製
した抗原は−20℃以下で長期間安定である。 調製例 ２ 感作ラテツクスの調製 高比重ラテツクスであるところのポリスチレン
ラテツクス（武田薬品工業株式会社製、SDL59比
重1.2）をPBSで0.25％懸濁液とし、これに等量
の、調製例１において得られた抗原液の80倍希釈
液を加え、室温で２〜４時間処理した後、PBSで
２回洗浄し原量の1/10量の凍結乾燥媒〔希釈液
（PH7.2のＭ／60PBSに、牛血清アルブミン１％、
NaN30.1％を加えたもの）にグリシン0.5％、デキ
ストランT10（フアルマシア社製）0.7％を加え
たもの〕に懸濁し凍結乾燥した。 実験例 受身ラテツクス凝集反応 凍結乾燥感作ラテツクスに前記希釈液を、原量
の10倍量加える。反応はマイクロタイター法によ
つて行ない、先ずプレートにドロツパーで希釈液
を0.025mlずつ分注する。第１穴目に適当に希釈
した患者血清（例えば１：100）を0.025ml加え
る。ダイリユーターで２n希釈する。感作ラテツ
クス液を0.025mlずつ滴下し、ミキサーをかけ、
室温に10時間以上静置した後、判定を行なう。陽
性を示す最大希釈倍数の逆数を抗体価とする。本
発明の感作ラテツクスと患者血清のボツクス・タ
イトレーシヨンの結果を第１表に示す。
テツクスに関するものであり、さらに詳しくはラ
テツクス粒子にエコーウイルス抗原を結合させて
なるエコーウイルス受身ラテツクス凝集反応用感
作ラテツクスに関するものである。 エコーウイル（Echovirus）は、大きさ28nｍ
のRNAウイルスで、ピコルナウイルス
（picornavirus）群の中の腸管ウイルス
（Enterovirus）に属する。すなわち糞便より経口
的に人から人へ感染するウイルスである。このエ
コーウイルスは、これに感染しても多くは不顕性
感染におわるが、時として発症する。この症状は
齦膜炎、ポリオ様麻痺、発疹、上気道炎、夏期に
おける下痢などで、神経症状から呼吸器疾患、腸
管系疾患にわたる非常に広範囲の多彩な症状を示
す感染症であり、このエコーウイルス感染症に特
有の臨床所見がみられず、従つて他の病原による
感染症と臨床所見によつて鑑別することはほとん
ど不可能である。 この、エコーウイルス感染症の血清学的診断法
としては、現在、中和反応（Neutalization
Test、以下NTと略記する）と補体結合反応
（Complement Fixation Test以下CFと略記す
る）が行われている。このうち、CFは診療機関
で広く実施されている検査法であるが、この反応
はエコーウイルスに関しては非常に感度が低く、
多くの場合抗体が検出できず、エコーウイルス感
染症でありながら陰性と判断されることが多い。
これに反して、NTはCFよりも高い感度を示し、
かつ特異的であるので、すぐれた反応であるが、
組織培養によるウイルスの培養を行なわなければ
ならないので、特別な設備と多くの労力を要し、
通常用いる診断法として応用することはほとんど
不可能に近い。 このエコーウイルス感染症を確実に診断するこ
とは、治療方針の設定、予後の予測に必須である
ばかりではなく、流行の予測などの公衆衛生上の
観点からも極めて重要である。 本発明者は上記した従来のエコーウイルス診断
法における欠点を克服すべく鋭意研究を行なつた
結果、エコーウイルス抗原を結合させた感作ラテ
ツクスを用い、受身ラテツクス凝集反応により、
高感度でしかも特異的にエコーウイルス感染症を
鑑別診断することができることを見出し、本発明
を完成した。 本発明の目的は、ラテツクス粒子にエコーウイ
ルス抗原を結合してなるエコーウイルス感染症診
断用感作ラテツクスを提供することである。 本発明の感作ラテツクス製造に用いるエコーウ
イルス抗原は、ウイルスビリオンそのものであ
り、その性質および分離方法は周知である。例え
ば、LLCMK2などの培養細胞にエコーウイルス
を高い感染度で感染させ、約６時間後、凍結融解
をくりかえすことによつて、細胞内および上清中
のウイルス抗原を得ることができる。この試料か
らは、超遠心法、あるいはポリエチレングリコー
ルを用いる遠心法により容易にウイルスビリオン
のみを集めることができる。 上記エコーウイルス抗原によつて前記ラテツク
ス粒子を感作するには、ラテツクス粒子とウイル
ス抗原を生理食塩液、緩衝液などの中で接触させ
ればよい。この場合かきまぜまたはふりまぜによ
つて接触時間を短縮することができる。この感作
処理は、一般に、PH約6.4〜9.0、温度約４〜37℃
で行なう。感作処理後、水溶液で洗浄することに
よつて未吸着の過剰の抗原を除去する。この感作
洗浄後、さらにラテツクス粒子に吸着される性状
を有する物質たとえばウシ血清アルブミンなどで
抗原未吸着部分を飽和して、もはや何も吸着しな
いようにしておく。 上記のようにして得たラテツクス試薬は、通常
約0.5％のラテツクス粒子懸濁液として使用す
る。 上記の感作ラテツクスを長期にわたつて保存す
るには保存液中に懸濁させて氷室に保存してもよ
く、あるいは保護剤を含む媒体とともに凍結乾燥
して、凍結乾燥品として保存してもよい。凍結乾
燥品の場合は使用に際しては感作ラテツクスに希
釈液を加えて診断液を調製する。 本発明の感作ラテツクスがエコーウイルス抗体
に対し特異的に反応して凝集を起すこと、また正
常抗原感作ラテツクスは上記抗体に全く反応しな
いことから本発明の感作ラテツクスはラテツクス
粒子にエコーウイルス抗原が結合したものである
といえる。本発明に用いる高比重ポリスチレンラ
テツクスは、比重1.14好ましくは比重1.2以上の
ポリスチレンラテツクスをいう。ポリスチレンラ
テツクスの比重が小さいと、感作ラテツクスの凝
集による沈降に時間がかかり、分析時間が長くな
つて好ましくない。 本発明において用いられるラテツクスとして
は、上記の高比重ポリスチレンが最も好適なもの
であるが、この他に、カルボキシル化ポリスチレ
ン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−
ジビンルベンゼン共重合体、アクリロニトリル−
ブタジエン−スチレン共重合体なども用いること
ができる。 本発明の感作ラテツクスを用いたエコーウイル
ス感染症の診断は、本発明の感作ラテツクス懸濁
液をヒトまたは動物の血清などの体液もしくはそ
の希釈液と接触させ、受身ラテツクス凝集反応に
基づく管底凝集像を観察することによつて行う
が、手法としてはマイクロタイター法によるのが
最も好ましく、本発明の感作ラテツクスを用いた
マイクロタイター法によれば、(イ)手技が極めて簡
単であり、(ロ)約10時間で判定が可能であり、(ハ)感
度が極めて高く（CFの100〜1000倍）(ニ)さらに担
体がラテツクスであるために、担体に対する抗体
が人血中に存在しないので担体による血清の前処
理がすべて不要になる。しかも以上詳記したとこ
ろより明らかなように、本発明のエコーウイルス
感染症診断用感作ラテツクスは、抗原を組織培養
で調製するため、CF抗原とほゞ同一の低コスト
で製造することができる上、生血球、補体、溶血
素などを使用しないため、全体として診断に要す
る費用はCF法に比較してかなり低いものにな
る。すなわち本発明は、従来エコーウイルス感染
症の診断に用いられたことのない受身ラテツクス
凝集反応用感作ラテツクスを提供し、本発明の感
作ラテツクスを用いた診断法によつてエコーウイ
ルスの抗体を高感度で迅速に検出し、患者の診断
を確実にしたのはもちろんのこと、さらに、ヒト
の抗体測定によるエコーウイルス感染症の流行予
測など、公衆衛生上、疫学上の要請に応えること
ができるほか、期限切れの輪血用血液から特異的
血清療法用のガンマーグロブリン製剤を調製する
時の抗体スクリーニングにも有用である。現在ま
でにラテツクス粒子にエコーウイルス抗原を感作
した例は全く交献未載であり、マイクロタイター
法による受身ラテツクス凝集反応は全く新規なも
のである。 以下調製例および実施例を示して本発明をさら
に詳しく説明するが、本発明はその要旨を超えな
い限りこれらによつて限定されるものではない。 調製例 １ 抗原の調製 LLCMK2細胞の単層培養にFchovirus Type7
（Wallace株）を感染の度合（multiplicity of
infection）50で接種し、37℃で６時間培養した。
培養びんから細胞を剥離し、ドライアイス−メタ
ノールと温湯で凍結融解を３回くりかえして細胞
を破壊し、これを10000rpm30分遠心して上清を
分取し、この上清にポリエチレングリコール6000
を８％加え、室温に２時間、４℃に一夜おいた
後、5000rpm15分遠心してウイルスを沈渣として
集め、培養液の1/100容のリン酸塩緩衝食塩液
（以下PBSという）に懸濁してから5000rpm30分
遠心して上清をとり、抗原とした。 他の型のエコーウイルスについても同様にして
抗原を調製した。またウイルスを感染させないで
全く同様にして調製した抗原をつくり、これを正
常抗原として対照に用いた。このようにして調製
した抗原は−20℃以下で長期間安定である。 調製例 ２ 感作ラテツクスの調製 高比重ラテツクスであるところのポリスチレン
ラテツクス（武田薬品工業株式会社製、SDL59比
重1.2）をPBSで0.25％懸濁液とし、これに等量
の、調製例１において得られた抗原液の80倍希釈
液を加え、室温で２〜４時間処理した後、PBSで
２回洗浄し原量の1/10量の凍結乾燥媒〔希釈液
（PH7.2のＭ／60PBSに、牛血清アルブミン１％、
NaN30.1％を加えたもの）にグリシン0.5％、デキ
ストランT10（フアルマシア社製）0.7％を加え
たもの〕に懸濁し凍結乾燥した。 実験例 受身ラテツクス凝集反応 凍結乾燥感作ラテツクスに前記希釈液を、原量
の10倍量加える。反応はマイクロタイター法によ
つて行ない、先ずプレートにドロツパーで希釈液
を0.025mlずつ分注する。第１穴目に適当に希釈
した患者血清（例えば１：100）を0.025ml加え
る。ダイリユーターで２n希釈する。感作ラテツ
クス液を0.025mlずつ滴下し、ミキサーをかけ、
室温に10時間以上静置した後、判定を行なう。陽
性を示す最大希釈倍数の逆数を抗体価とする。本
発明の感作ラテツクスと患者血清のボツクス・タ
イトレーシヨンの結果を第１表に示す。
【表】
比較例
補体結合反応
CFは抗体減量法であるコルマー（Kolmer）法
に準拠し、マイクロタイター法で実施した。すな
わち、0.025ml２n希釈非働化血清系列に抗原
0.025mlを加え、これに２単位の補体0.05mlを加
え、混合して４℃で一夜反応させる。この第一段
反応終了後、37℃に加温した後、20単位溶血素感
作した溶血系統0.05mlを加え、37℃で30分反応さ
せた後、1000rpm3分遠心して溶血を判定した。
結果を第２表に示す。
に準拠し、マイクロタイター法で実施した。すな
わち、0.025ml２n希釈非働化血清系列に抗原
0.025mlを加え、これに２単位の補体0.05mlを加
え、混合して４℃で一夜反応させる。この第一段
反応終了後、37℃に加温した後、20単位溶血素感
作した溶血系統0.05mlを加え、37℃で30分反応さ
せた後、1000rpm3分遠心して溶血を判定した。
結果を第２表に示す。
【表】
【表】
ここに用いた抗体はラテツクス凝集反応と同一
のものである。 上記したラテツクス凝集反応ボツクス・タイト
レーシヨンにみられるように、この感作ラテツク
スは、CF抗体価160の患者血清に対してラテツク
ス凝集抗体価160000と1000倍の感度を示し、希釈
液に対しては完全な陰性を示している。またこの
血清は正常抗原感作ラテツクスに対しては全く陽
性を示さず、この反応が感作した抗原に対する特
異反応であることを示している。このラテツクス
凝集反応において、抗原感作量は１：10〜１：80
の間で同一の抗体価を示し、抗原感作量の変動に
ともなう抗体価の影響がみられない。
のものである。 上記したラテツクス凝集反応ボツクス・タイト
レーシヨンにみられるように、この感作ラテツク
スは、CF抗体価160の患者血清に対してラテツク
ス凝集抗体価160000と1000倍の感度を示し、希釈
液に対しては完全な陰性を示している。またこの
血清は正常抗原感作ラテツクスに対しては全く陽
性を示さず、この反応が感作した抗原に対する特
異反応であることを示している。このラテツクス
凝集反応において、抗原感作量は１：10〜１：80
の間で同一の抗体価を示し、抗原感作量の変動に
ともなう抗体価の影響がみられない。
Claims (1)
- １ 比重が1.14以上のポリスチレンラテツクスに
エコーウイルス抗原を結合させてなる感作ラテツ
クス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10666979A JPS5630648A (en) | 1979-08-23 | 1979-08-23 | Latex sensitized with echo virus antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10666979A JPS5630648A (en) | 1979-08-23 | 1979-08-23 | Latex sensitized with echo virus antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5630648A JPS5630648A (en) | 1981-03-27 |
| JPS6161065B2 true JPS6161065B2 (ja) | 1986-12-24 |
Family
ID=14439474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10666979A Granted JPS5630648A (en) | 1979-08-23 | 1979-08-23 | Latex sensitized with echo virus antigen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5630648A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5841964U (ja) * | 1981-09-15 | 1983-03-19 | アンリツ株式会社 | 小型電磁継電器 |
-
1979
- 1979-08-23 JP JP10666979A patent/JPS5630648A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5630648A (en) | 1981-03-27 |
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