【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
（産業上の利用分野）
この発明は、クロストリジウム属に属する新規
な細菌を用いてエタノールを製造する方法に関す
るものである。エタノールは溶剤、燃料、種々の
化学薬品の合成原料として広く用いられている。
（従来技術）
常温の条件下で、生育培地中にエタノールを蓄
積する微生物は多く知られている。嫌気性菌で
は、クロストリジウム・バイフアーメンタンス
（Clostridium bifermentans）、クロストリジウ
ム・ソルデリ（Clostridium sordellii）、クロス
トリジウム・スフエノイデス（Clostridium
sphenoides）などがある。
（発明が解決しようとする問題点）
これまでに、エタノールを製造する微生物とし
て、前記のような菌が知られているものの、解決
すべき課題は、まだ多く、そのためには、エタノ
ールを製造しうる新菌種の創製がきわめて重要な
手段となる。本発明は、このような意図のもとに
炭素源を資化して、培地中にエタノールを蓄積す
る新規微生物を得、これを用いたエタノールの新
製法を提供することを目的とする。
（問題点を解決するための手段）
本発明はクロストリジウム・エスピー
（Clostridium・sp）No.Ｓ−１を培養し、生成蓄積
されたエタノールを回収することを特徴とするエ
タノールの製造方法である。
本発明で用いられる微生物はクロストリジウム
属に属しグラム陰性で周鞭毛を有する桿菌クロス
トリジウム・エスピーNo.Ｓ−１である（以下本菌
と略記する。）。
本菌は、偏性嫌気性有胞子桿菌である点でクロ
ストリジウム属に属する菌と考えられるが、グラ
ム染色性、炭素源の資化性など後で詳しく記す諸
性質において公知の同属菌と相違しており、新菌
種であると考えられる。正式の種名はまだ付され
ていないので、本発明ではクロストリジウム・エ
スピーNo.Ｓ−１と表示する。次に本菌の創製法お
よび菌学的性質を示す。
（創製法）
本菌は下記の方法により分離した。すなわち第
１表に示す液体培地にソルボース１ｇ／を加え
た培地５mlを試験管へ分注し滅菌後、嫌気グロー
ブボツクス中で給源を添加し、ブチルゴム栓で密
栓後、気相を嫌気ガスに置換し、30℃で静置培養
し、約10日毎に植え継ぎを行つた。１回液体培地
で植え継いだのち、第１表の培地に寒天３％、ソ
ルボース１ｇ／を加えた寒天培地を用いてロー
ル・チユーブ法（メソツズ・イン・マイクロバイ
オロジー（Methods in Microbiology）、３巻
Ｂ、117頁（1969）を繰り返すことにより本菌を
得た。
（菌学的性質）
本発明の菌株の菌学的性質を示す。この菌学的
性質の検討には、「アンアエロブ・ラボラトリ
ー・マニユアル（Anaerobe Laboratory
Manual）第４版、（The V.I.P.Anaerobe
Laboratory Virginia Polytechnic Institute
and State University、Blacksburg（1972））お
よび「バージーズ・マニユアル・オブ・デターミ
ネイテイブ・バクテリオロジー（Bergey′s
Manual ob Determinative Bacteriologg）第８
版、「微生物の分類と同定」（長谷川武治著、学会
出版センター）に記載されている方法、培地組成
を用いた。
（顕微鏡的所見）
１ 細胞の形および大きさ：単独もしくは３〜４
連の直桿菌。幅0.4〜0.8μｍ、長さ３〜8μｍ
２ 運動性の有無：運動性：あり、周鞭毛
３ 胞子：あり、ターミナル
４ グラム染色：陰性
５ 細胞の多形性の有無：細胞の多形性なし
（培地組成）
第１表に例示する。
(Industrial Application Field) The present invention relates to a method for producing ethanol using a novel bacterium belonging to the genus Clostridium. Ethanol is widely used as a solvent, fuel, and raw material for the synthesis of various chemicals. (Prior Art) Many microorganisms are known that accumulate ethanol in a growth medium under room temperature conditions. Anaerobic bacteria include Clostridium bifermentans, Clostridium sordellii, and Clostridium sphenoides.
sphenoides). (Problems to be solved by the invention) Although the above-mentioned microorganisms have been known as microorganisms that produce ethanol, there are still many problems to be solved. The creation of new bacterial species is an extremely important means. With this intention in mind, the present invention aims to obtain a new microorganism that assimilates carbon sources and accumulates ethanol in a culture medium, and to provide a new method for producing ethanol using this microorganism. (Means for Solving the Problems) The present invention is a method for producing ethanol, which is characterized by culturing Clostridium sp. No. S-1 and recovering the produced and accumulated ethanol. The microorganism used in the present invention is Clostridium sp. No. S-1, which belongs to the genus Clostridium and is Gram-negative and has periflagellates (hereinafter abbreviated as the present bacterium). This bacterium is considered to belong to the genus Clostridium in that it is an obligate anaerobic sporobacillus, but it differs from known congener bacteria in various properties that will be described in detail later, such as Gram staining and ability to assimilate carbon sources. It is considered to be a new bacterial species. Since the official species name has not yet been assigned, it is designated as Clostridium sp. No. S-1 in the present invention. Next, we will show the method for creating this bacterium and its mycological properties. (Creation method) This bacterium was isolated by the following method. That is, 5 ml of the liquid medium shown in Table 1 to which 1 g of sorbose was added was dispensed into test tubes, and after sterilization, a supply source was added in an anaerobic glove box, the tube was sealed with a butyl rubber stopper, and the gas phase was replaced with anaerobic gas. The cells were then cultured statically at 30°C, and subcultured approximately every 10 days. After subculture once in a liquid medium, use the roll tube method (Methods in Microbiology), 3 using an agar medium prepared by adding 3% agar and 1 g of sorbose to the medium shown in Table 1. This bacterium was obtained by repeating Volume B, p. 117 (1969). (Mycological properties) The mycological properties of the strain of the present invention are shown.・Manual (Anaerobe Laboratory
Manual) 4th edition, (The VIP Anaerobe
Laboratory Virginia Polytechnic Institute
and State University, Blacksburg (1972)) and Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
Manual of Determinative Bacteriologg) No. 8
The method and culture medium composition described in "Classification and Identification of Microorganisms" (written by Takeharu Hasegawa, published by Gakkai Publishing Center) were used. (Microscopic findings) 1 Cell shape and size: Single or 3-4
Direct bacilli of Ren. Width 0.4 to 0.8 μm, length 3 to 8 μm 2 Motility: Motility: Yes, periflagellate 3 Spores: Yes, terminal 4 Gram staining: Negative 5 Cell pleomorphism: No cell pleomorphism (Medium composition) Examples are shown in Table 1.
【表】【table】
【表】
（生育状態）
第１表の組成に３％寒天１ｇ／ソルボースを
加えた寒天培地での生育は次のとおりである。
形状：円形
周縁：円滑
隆起：わずかに盛上る
表面：円滑
色調：白
（生理的性質）
酸素に対する態度：偏性嫌気性
インドールの生産性：−
ゼラチンの液化：−
カタラーゼの生産性：−
デンプンの加水分解：−
エスクリンの加水分解：＋
色素の生成：−
硫酸塩の還元性：−
ミルク：凝固、ペプトン共に−
ウレアーゼ：−
ビタミンの要求性：なし
生育範囲：温度25〜40℃、最適温度35℃ PH
5.5〜9.0、最適PH7.0
（炭素源の資化性）
第１表の基本培地に下記炭素源（１％）を含む
液体培地５mlを直径18mmの試験管に加え、無菌培
地を作成し本菌を80μ植菌し、気相を窒素（67
％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに置換
し、30℃で14日間静置培養した。生育は600nｍ
の濁度を分光計（スペクトロニツク20、島津製作
所製）で測定した。600nｍの濁度が炭素源を含
まないコントロールとの差が0.1未満のものを
「資化しない」、0.1以上0.2未満のものを「わずか
に資化する」0.2以上のものを「資化する」とし
た。
資化するもの：ラフイノース、ガラクトース、
ラムノース、グリコーゲン、トレハロース、マン
ノース、グルコース、アミグダリン、ソルボース
資化しないもの：フルクトース、キシロース、
リボース、アラビノース、マルトース、シユクロ
ーズ、ラクトース、メリビオース、セロビオー
ス、メレジトース、マンニトール、デンプン、ア
ドニトール、エリスリトール、イノシトール、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、エチ
レングリコール、グリセロール、ギ酸、酢酸、プ
ロピオン酸、コハク酸
（糖などからの生産物）
第１表の基本培地に上記の試験で資化すること
が確かめられた糖を１％添加し、気相を窒素（67
％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに置換
し、本菌を植菌、30℃で静置培養した。すべての
炭素源において培地中には、主生産物として酢
酸、エタノールが生産された。
（従来の類似種との比較）
上記の菌学的性質から、このクロストリジウ
ム・エスピーNo.Ｓ−１は、偏性嫌気性のグラム陰
性有胞子桿菌で、その主要発酵代謝産物が酢酸、
エタノールである菌株である。また、硫酸塩の還
元性もない。このようなことから、本菌はクロス
トリジウム（Clostridium）に属する菌株である
と考えられる。グラム陰性のクロストリジウムに
はクロストリジウム・セロビオパルム
（Clostridium cellobioparum）、クロストリジウ
ム・サーモサツカロリテイカム（Clostridium
thermosacchalolyticum）、クロストリジウム・
ブレビフアシエンス（Clostridium
brivifaciens）、クロストリジウム・クルイベリ
（Clostridum kluyveri）、クロストリジウム・マ
ラコサム（Clostridium malacosomae）、クロス
トリジウム・サーモセラム（Clostridium
thermocellum）がある。このうち、クロストリ
ジウム・サーモサツカロリテイカム、クロストリ
ジウム・サーモセラムは高温菌という点で本菌と
区別できる。クロストリジウム・ブレビフアシエ
ンス、クロストリジウム・マラコサムはアルカリ
菌という点で本菌と区別できる。そして、クロス
トリジウム・セロビオパルム、クロストリジウ
ム・クイベリは生産物が、酢酸、カプロン酸とい
う点で区別できる。
以上のことから、本菌株はクロストリジウム属
に属する新菌種であると考えられるので、クロス
トリジウム・エスピーNo.Ｓ−１と命名した。さら
にこの菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
「微工研菌寄第8852号（FERM Ｐ−8852）とし
て寄託した。
（培養方法）
培養方法は原則的には、一般の微生物の場合と
同様であるが、酸素の混入を防ぐことが必要であ
り、実験室的には、ゴム栓等で密栓した培養器中
で、静置あるいは振盪する方法が用いられる。や
や大きい規模では、通常用いられる醗酵槽がその
まま利用でき、装置内の酸素は、窒素などの不活
性気体などで置換することにより嫌気的な雰囲気
をつくることが可能である。醗酵槽の形式は特に
問わないが、普通に使用される撹拌混合槽のほ
か、一段あるいは多段の気泡塔型、ドラフトチユ
ーブ型の醗酵槽も利用できる。
培養に用いる炭素源は、資化する炭素源であれ
ばよく窒素源は塩化アンモニウムのごときアンモ
ニウム塩や硝酸ソーダのような硝酸塩のごとく、
通常の醗酵に用いうる各種の窒素化合物を用いる
ことができる。
その他必要に応じ、リン酸二水素カリ、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、硫
酸鉄、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜
鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、硼酸
などの無機化合物、あるいはビオチンや酵母エキ
スなどのビタミン類を添加することは、通常行な
われる通りである。
培地中に蓄積されたエタノールは公知の技術に
より回収することができる。
（発明の効果）
本発明より嫌気的に醗酵によりエタノールを生
産することが出来る。以下具体例により本発明を
説明する。
実施例 １
クロストリジウム・エスピーNo.Ｓ−１株を以下
のように培養した。
第１表に示す培地に10ｇ／のソルボースを加
え試験管へ５ml分注滅菌後、同培地であらかじめ
該菌株を前培養した培養液80μを嫌気グローブ
ボツクス中で添加し、ブチルゴム栓で密栓したの
ち気相を窒素（67％）と二酸化炭素（33％）を含
む除菌ガスに置換した。30℃で10日間静置培養を
行なつたところ、培養液中にエタノール0.84ｇ／
を得た。エタノールはガスクロマトグラフー質
量分析計により標品と一致することを確認した。
（同時に酢酸を生成物として得た。）
実施例 ２
第１表の基本培地に10ｇ／のアミグダリンを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で0.92ｇ／のエタノールを生産した。
（同時に酢酸を生成物として得た。）
実施例 ３
第１表の基本培地に10ｇ／のグルコースを加
え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で1.1ｇ／のエタノールを生産した。（同
時に酢酸を生成物として得た。）
実施例 ４
第１表の基本培地に10ｇ／のフルクトースを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で1.2ｇ／のエタノールを生産した。
（同時に酢酸を生成物として得た。）
実施例 ５
第１表の基本培地に10ｇ／のラムノースを加
え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で1.07ｇ／のエタノールを生産した。
（同時に酢酸を生成物として得た。）
実施例 ６
第１表の基本培地に10ｇ／のガラクトースを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で0.96ｇ／のエタノールを生産した。
（同時に酢酸を生成物として得た。）
実施例 ７
第１表の基本培地に10ｇ／のトレハロースを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で0.81ｇ／のエタノールを生産した。
（同時に酢酸を生成物として得た。）
実施例 ８
第１表の基本培地に10ｇ／のラフイノースを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で0.99ｇ／のエタノールを生産した。
（同時に酢酸を生成物として得た。）[Table] (Growth status) Growth on an agar medium containing the composition shown in Table 1 plus 1 g of 3% agar/sorbose is as follows. Shape: Circular Perimeter: Smooth Raised: Slightly raised Surface: Smooth Color: White (Physiological properties) Attitude towards oxygen: Obligate anaerobic Indole productivity: - Liquefaction of gelatin: - Catalase productivity: - Starch Hydrolysis: - Aesculin hydrolysis: + Pigment formation: - Sulfate reducing properties: - Milk: both coagulation and peptone - Urease: - Vitamin requirements: None Growth range: Temperature 25-40℃, optimum temperature 35 ℃PH
5.5 to 9.0, optimal PH7.0 (Assimilation of carbon source) Add 5 ml of liquid medium containing the following carbon source (1%) to the basic medium shown in Table 1 to a test tube with a diameter of 18 mm to prepare a sterile medium. Inoculate 80μ of bacteria and replace the gas phase with nitrogen (67
%) and carbon dioxide (33%), and cultured stationary at 30°C for 14 days. Growth is 600nm
The turbidity of the sample was measured using a spectrometer (Spectronic 20, manufactured by Shimadzu Corporation). If the turbidity at 600 nm differs from the control without carbon source by less than 0.1, it is "not assimilated," if it is 0.1 or more and less than 0.2, it is "slightly assimilated," and if it is 0.2 or more, it is "assimilated." And so. Assimilated: raffinose, galactose,
Rhamnose, glycogen, trehalose, mannose, glucose, amygdalin, sorbose Non-assimilated: fructose, xylose,
Ribose, arabinose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, cellobiose, melezitose, mannitol, starch, adonitol, erythritol, inositol, methanol, ethanol, n-propanol, ethylene glycol, glycerol, formic acid, acetic acid, propionic acid, succinic acid (sugar 1% of the sugars that were confirmed to be assimilated in the above test were added to the basal medium shown in Table 1, and the gas phase was changed to nitrogen (67
%) and carbon dioxide (33%), and this bacteria was inoculated and cultured stationary at 30°C. Acetic acid and ethanol were produced as the main products in the medium using all carbon sources. (Comparison with conventional similar species) Based on the above mycological properties, this Clostridium sp.
This strain is ethanol. Moreover, it does not have the reducing property of sulfate. Based on these facts, this bacterium is considered to be a strain belonging to Clostridium. Gram-negative clostridia include Clostridium cellobioparum and Clostridium thermosatucaroliticum.
thermosacchalolyticum), Clostridium
Brevifuaciens (Clostridium)
brivifaciens), Clostridium kluyveri, Clostridium malacosomae, Clostridium thermocellum (Clostridium
thermocellum). Among these, Clostridium thermosatucaloriticum and Clostridium thermocellum can be distinguished from this bacterium in that they are thermophilic bacteria. Clostridium brevifuaciens and Clostridium malacosum can be distinguished from this bacterium in that they are alkaline bacteria. Clostridium cellobioparum and Clostridium quiveri can be distinguished by their products being acetic acid and caproic acid. Based on the above, this strain is considered to be a new bacterial species belonging to the genus Clostridium, so it was named Clostridium sp. No. S-1. Furthermore, this strain was deposited with the National Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology as FERM P-8852. Similarly, it is necessary to prevent oxygen from entering, and in the laboratory, a method of standing or shaking in an incubator tightly closed with a rubber stopper is used. The fermenter can be used as is, and an anaerobic atmosphere can be created by replacing the oxygen in the device with an inert gas such as nitrogen.The type of fermenter is not particularly limited, but In addition to the stirring mixing tank used, single-stage or multi-stage bubble column type fermenters and draft tube type fermenters can also be used.The carbon source used for culturing can be any carbon source that can be assimilated, and the nitrogen source can be ammonium chloride or the like. Like ammonium salts and nitrates such as sodium nitrate,
Various nitrogen compounds that can be used in normal fermentation can be used. Other inorganic compounds such as potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, manganese sulfate, sodium chloride, iron sulfate, cobalt chloride, calcium chloride, zinc sulfate, copper sulfate, alum, sodium molybdate, boric acid, or biotin. It is common practice to add vitamins such as yeast extract and yeast extract. Ethanol accumulated in the medium can be recovered by known techniques. (Effects of the Invention) According to the present invention, ethanol can be produced by anaerobic fermentation. The present invention will be explained below using specific examples. Example 1 Clostridium sp. No. S-1 strain was cultured as follows. Add 10 g of sorbose to the medium shown in Table 1, dispense 5 ml into a test tube, sterilize it, add 80 μ of a culture solution prepared by pre-cultivating the strain in the same medium in an anaerobic glove box, and seal it with a butyl rubber stopper. The gas phase was replaced with a sterilizing gas containing nitrogen (67%) and carbon dioxide (33%). When statically cultured at 30℃ for 10 days, 0.84 g of ethanol/
I got it. Ethanol was confirmed to match the standard using a gas chromatograph-mass spectrometer.
(At the same time, acetic acid was obtained as a product.) Example 2 10 g/amygdalin was added to the basic medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. During 14 days of static culture, 0.92 g/ethanol was produced.
(At the same time, acetic acid was obtained as a product.) Example 3 10 g/glucose was added to the basal medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. Static culture
1.1 g/ethanol was produced in 14 days. (At the same time, acetic acid was obtained as a product.) Example 4 10 g/fructose was added to the basal medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. 1.2 g/ethanol was produced during 14 days of static culture.
(At the same time, acetic acid was obtained as a product.) Example 5 10 g/rhamnose was added to the basic medium shown in Table 1, and cultivation was carried out in the same manner as in Example 1. Static culture
1.07g/ethanol was produced in 14 days.
(At the same time, acetic acid was obtained as a product.) Example 6 10 g/galactose was added to the basal medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. During 14 days of static culture, 0.96 g/ethanol was produced.
(At the same time, acetic acid was obtained as a product.) Example 7 10 g/trehalose was added to the basal medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. During 14 days of static culture, 0.81 g/ethanol was produced.
(At the same time, acetic acid was obtained as a product.) Example 8 10 g/raffinose was added to the basic medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. During 14 days of static culture, 0.99 g/ethanol was produced.
(At the same time, acetic acid was obtained as a product.)