【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
（産業上の利用分野）
この発明は、クロストリジウム属に属する新規
な細菌を用いて酢酸を製造する方法に関するもの
でる。
酢酸は食品用或いは工業用原料などの分野で用
いられている。
（従来技術）
食品用の酢酸水溶液である食酢は、アルコール
あるいはアルコールを含む酒類を酢酸菌を用いて
酸化する方法により作られる。一方、工業用の高
濃度の酢酸は、主として化学的方法によりメタノ
ール、アセトアルデヒド、炭化水素などを原料と
して製造されている。
常温の条件下で生育培地中に酢酸を蓄積する嫌
気微生物としてクロストリジウム・フアラツクス
（Clostridium fallax）、クロストリジウム・ステ
イクランデイ（Clostridium sticklandii）、クロ
ストリジウム・ゴーニー（Clostridium ghoni）
などが知られている。高温の条件下ではクロスト
リジウム・サーモアセチカム（Clostridium
thermoaceticum）が知られている。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者らは再生可能な資源を利用できる、微
生物による酢酸の製造方法を検討し、本発明に到
達した。現在発酵法ではアルコールより酢酸が製
造されているが、嫌気微生物による糖からの酢酸
製造法が注目されつつある。
これまでに、酢酸を製造する嫌気微生物とし
て、前記のような菌が知られているものの、酢酸
の製造を工業的に実施するために、解決すべき課
題は、まだ多い。中でも、酢酸の蓄積濃度および
生産速度の高い菌を得ることは重要である。その
ためには、酢酸を製造しうる新菌種の創製がきわ
めて重要な手段となる。本発明は、このような意
図のもとに、培地中に酢酸を蓄積する新規微生物
を得、これを用いた酢酸の新製法を提供すること
を目的とする。
（問題点を解決するための手段）
本発明はクロストリジウム・エスピー
（Clostridium sp）No.Ｓ−１を培養し、生成蓄積
された酢酸を回収することを特徴とする酢酸の製
造方法である。
本発明で用いられる微生物はクロストリジウム
属に属しグラム陰性で周鞭毛を有する桿菌クロス
トリジウム・エスピーNo.Ｓ−１である（以下本菌
と略記する。）。
本菌は、偏性嫌気性有胞子桿菌である点でクロ
ストリジウム属に属する菌と考えられるが、グラ
ム染色性、炭素源の資化性など後で詳しく記す諸
性質において公知の同属菌と相違しており、新菌
種であると考えられる。正式の種名はまだ付され
ていないので、本発明ではクロストリジウム・エ
スピーNo.Ｓ−１と表示する。次に本菌の創製法お
よび菌学的性質を示す。
（創製法）
本菌は下記の方法により分離した。すなわち第
１表に示す液体培地にソルボース１ｇ／を加え
た培地５mlを試験管へ分注し滅菌後、嫌気グロー
ブボツクス中で給源を添加し、ブチルゴム栓で密
栓後、気相を嫌気ガスに置換し、30℃で静置培養
し、約10日毎に植え継ぎを行つた。１回液体培地
で植え継いだのち、第１表の培地に寒天３％、ソ
ルボース１ｇ／を加えた寒天培地を用いてロー
ル・チユーブ法（メソツズ・イン・マイクロバイ
オロジー（Methods in Microbiology）３巻Ｂ、
117頁（1969）を繰り返すことにより本菌を得た。
（菌学的性質）
本発明の菌株の菌学的性質を示す。この菌学的
性質の検討には、「アンアエロブ・ラボラトリ
ー・マニユアル（Anaerobe Laboratory
Manual）第４版」（The V.I.P.Anaerobe
Laboratory Virginia polytechnic Institute
and State University、Blacksburg（1972））お
よび「バージーズ・マニユアル・オブ・デターミ
ネイテイブ・バクテリオロジー（Bergey′s
Manual of Determinative Bacteriologg）第８
版」「微生物の分類と同定」（長谷川武治著、学会
出版センター）に記載されている方法、培地組成
を用いた。
（顕微鏡的所見）
１ 細胞の形および大きさ：単独もしくは３〜
４連の直桿菌。幅0.4〜0.8μm、長さ３〜8μm
２ 運動性の有無：運動性あり。周鞭毛
３ 胞子：あり、ターミナル
４ グラム染色：陰性
５ 細胞の多形性の有無：細胞の多形性なし
（培地組成）
第１表に例示する。
(Industrial Application Field) This invention relates to a method for producing acetic acid using a novel bacterium belonging to the genus Clostridium. Acetic acid is used in fields such as food and industrial raw materials. (Prior Art) Vinegar, which is an aqueous acetic acid solution for food, is produced by oxidizing alcohol or alcoholic drinks containing alcohol using acetic acid bacteria. On the other hand, industrial high-concentration acetic acid is mainly produced by chemical methods using methanol, acetaldehyde, hydrocarbons, and the like as raw materials. Clostridium fallax, Clostridium sticklandii, and Clostridium ghoni are anaerobic microorganisms that accumulate acetic acid in the growth medium at room temperature.
etc. are known. Under high temperature conditions Clostridium thermoaceticum (Clostridium
thermoaceticum) is known. (Problems to be Solved by the Invention) The present inventors have studied a method for producing acetic acid using microorganisms that can utilize renewable resources, and have arrived at the present invention. Currently, acetic acid is produced rather than alcohol using fermentation methods, but a method for producing acetic acid from sugar using anaerobic microorganisms is attracting attention. Although the above-mentioned bacteria have been known as anaerobic microorganisms that produce acetic acid, there are still many problems to be solved in order to industrially produce acetic acid. Among these, it is important to obtain bacteria that have a high accumulation concentration and production rate of acetic acid. To this end, the creation of new bacterial species that can produce acetic acid is an extremely important means. With this intention in mind, the present invention aims to obtain a new microorganism that accumulates acetic acid in a culture medium and to provide a new method for producing acetic acid using this microorganism. (Means for Solving the Problems) The present invention is a method for producing acetic acid, which is characterized by culturing Clostridium sp No. S-1 and recovering the produced and accumulated acetic acid. The microorganism used in the present invention is Clostridium sp. No. S-1, which belongs to the genus Clostridium and is Gram-negative and has periflagellates (hereinafter abbreviated as the present bacterium). This bacterium is considered to belong to the genus Clostridium in that it is an obligate anaerobic sporobacillus, but it differs from known congener bacteria in various properties that will be described in detail later, such as Gram staining and ability to assimilate carbon sources. It is considered to be a new bacterial species. Since the official species name has not yet been assigned, it is designated as Clostridium sp. No. S-1 in the present invention. Next, we will show the method for creating this bacterium and its mycological properties. (Creation method) This bacterium was isolated by the following method. That is, 5 ml of the liquid medium shown in Table 1 to which 1 g of sorbose was added was dispensed into test tubes, and after sterilization, a supply source was added in an anaerobic glove box, the tube was sealed with a butyl rubber stopper, and the gas phase was replaced with anaerobic gas. The cells were then cultured statically at 30°C, and subcultured approximately every 10 days. After subculture once in a liquid medium, use the roll tube method (Methods in Microbiology, Vol. 3) using an agar medium prepared by adding 3% agar and 1 g of sorbose to the medium shown in Table 1. B,
This bacterium was obtained by repeating the procedure on page 117 (1969). (Mycological properties) The mycological properties of the strain of the present invention are shown. For examination of this mycological property, please refer to the “Anaerobe Laboratory Manual”.
Manual) 4th Edition” (The VIP Anaerobe
Laboratory Virginia Polytechnic Institute
and State University, Blacksburg (1972)) and Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
Manual of Determinative Bacteriologg) No. 8
The method and culture medium composition described in "Classification and Identification of Microorganisms" (written by Takeharu Hasegawa, Gakkai Publishing Center) were used. (Microscopic findings) 1 Cell shape and size: Single or 3-
Four straight rods. Width 0.4 to 0.8 μm, length 3 to 8 μm 2 Mobility: Motile. Perifelgate 3 Spores: present, terminal 4 Gram staining: negative 5 Presence or absence of cell pleomorphism: No cell pleomorphism (medium composition) Table 1 shows examples.
【表】
（生育状態）
第１表の組成に３％寒天、１ｇ／ソルボース
を加えた寒天培地での生育は次の通りである。
形状：円形
周縁：円滑
隆起：わずかに盛上る
表面：円滑
色調：白
（生理的性質）
酸素に対する態度：偏性嫌気性
インドールの生産性：−
ゼラチンの液化：−
カタラーゼの生産性：−
デンプンの加水分解：−
エスクリンの加水分解：＋
色素の生成：−
硫酸塩の還元性：−
ミルク：凝固、ペプトン共に−
ウレアーゼ：−
ビタミンの要求性：なし
生育範囲：温度25〜40℃、最適温度35℃、PH
5.5〜9.0、最適PH7.0
（炭素源の資化性）
第１表の基本培地に下記炭素源（１％）を含む
液体培地５mlを直径18mmの試験管に加え、無菌培
地を作成し本菌を80μ植菌し、気相を窒素（67
％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに置換
し、30℃で14日間静置培養した。生育は600nmの
濁度を分光計（スペクトロニツク20、島津製作所
製）で測定した。600nmの濁度が炭素源を含まな
いコントロールとの差が0.1未満のものを「資化
しない」、0.1以上0.2未満のものを「わずかに資
化する」0.2以上のものを「資化する」とした。
資化するもの：ラフイノース、ガラクトース、
ラムノース、グリコ−ゲン、トレハロース、マン
ノース、グルコース、アミグダリン、ソルボース
資化しないもの：フルクトース、キシロース、
リボース、アラビノース、マルトース、シユクロ
ース、ラクトース、メリビオース、セロビオー
ス、メレジトース、マンニトール、デンプン、ア
ドニトール、エリスリトール、イノシトール、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、エチ
レングリコール、グリセロール、ギ酸、酢酸、プ
ロピオン酸、コハク酸
（糖などからの生産物）
第１表の基本培地に上記の試験で資化すること
が確かめられた糖を１％添加し、気相を窒素（67
％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに置換
し、本菌を植菌、30℃で静置培養した。すべての
炭素源において培地中には、主生産物として酢
酸、エタノールが生産された。
（従来の類似種との比較）
上記の菌学的性質から、このクロストリジウ
ム・エスピーNo.Ｓ−１は偏性嫌気性のグラム陰性
有胞子桿菌で、その主要発酵代謝産物が酢酸、エ
タノールである菌株である。また、硫酸塩の還元
性もない。このようなことから、本菌はクロスト
リジウム（Clostridium）に属する菌株であると
考えられる。グラム陰性のクロストリジウムには
クロストリジウム・セロビオパルム
（Clostridium cellobioparum）、クロストリジウ
ム・サーモサツカロリテイカム（Costridium
thermosa ccharolyticum）、クロストリジウム・
ブレビフアシエンス（Clostridium
brevifaciens）、クロストリジウム・クルイベリ
（Clostridium kluyveri）クロストリジウム・マ
ラコサム（Clostridium malacosomae）クロス
トリジウム・サーモセラム（Clostridium
thermocellum）がある。このうち、クロストリ
ジウム・サーモサツカロリテイカム、クロストリ
ジウム・サーモセラムは高温菌という点で本菌と
区別できる。クロストリジウム・ブレビフアシエ
ンス、クロストリジウム・マラコサムはアルカリ
菌という点で本菌と区別できる。そして、クロス
トリジウム・セロビオパルムは生産物が、酢酸の
みであり、エタノールを生産しないという点で、
クロストリジウム・クリイベリは生産物がカプロ
ン酸のみであるという点で区別できる。
以上のことから、本菌株はクロストリジウム属
に属する新菌種であると考えられるので、クロス
トリジウム・エスピーNo.Ｓ−１と命名した。さら
にこの菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
「微工研菌寄第8852号（FERMP−8852）として
寄託した。
（培養方法）
培養方法は原則的には、一般の微生物の場合と
同様であるが、酸素の混入を防ぐことが必要であ
り、実験室的には、ゴム栓等で密栓した培養器中
で、静置あるいは振盪する方法が用いられる。や
や大きい規模では、通常用いられる醗酵槽がその
まま利用でき、装置内の酸素は、窒素などの不活
性気体などで置換することにより嫌気的な雰囲気
をつくることが可能である。醗酵槽の形式は特に
問わないが、普通に使用される攪拌混合槽のほ
か、一段あるいは多段の気泡塔型、ドラフトチユ
ーブ型の醗酵槽も利用できる。
培養に用いる炭素源は、資化する炭素源であれ
ばよく窒素源は塩化アンモニウムのごときアンモ
ニウム塩や硝酸ソーダのような硝酸塩のごとく、
通常の醗酵に用いうる各種の窒素化合物を用いる
ことができる。
その他必要に応じ、リン酸二水素カリ、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、硫
酸鉄、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜
鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、硼酸
などの無機化合物、あるいはビオチンや酵母エキ
スなどのビタミン類を添加することは、通常行な
われる通りである。
培地中に蓄積された酢酸は公知の技術により回
収することができる。
（発明の効果）
本発明により嫌気的に醗酵により酢酸を製造す
ることが出来る。
以下具体例により本発明を説明する。
実施例 １
クロストリジウム・エスピーNo.Ｓ−１株を以下
のように培養した。
第１表に示す培地に10ｇ／のソルボースを加
え試験管へ５ml分注滅菌後、同培地であらかじめ
該菌株を前培養した培養液80μを嫌気グローブ
ボツクス中で添加し、ブチルゴム栓で密栓したの
ち気相を窒素（67％）と二酸化炭素（33％）を含
む除菌ガスに置換した。30℃で10日間静置培養を
行なつたところ、培養液中に酢酸0.43ｇ／を得
た。酢酸はガスクロマトグラフ−質量分析計によ
り標品と一致することを確認した。
（同時にエタノールを生成物として得た。）
実施例 ２
第１表の基本培地に10ｇ／のアミグダリンを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で0.52ｇ／の酢酸を生産した。
（同時にエタノールを生成物として得た。）
実施例 ３
第１表の基本培地に10ｇ／のグルコースを加
え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で0.60ｇ／の酢酸を生産した。
（同時にエタノールを生成物として得た。）
実施例 ４
第１表の基本培地に10ｇ／のフルクトースを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で0.48ｇ／の酢酸を生産した。
（同時にエタノールを生成物として得た。）
実施例 ５
第１表の基本培地に10ｇ／のラムノースを加
え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で0.40ｇ／の酢酸を生産した。
（同時にエタノールを生成物として得た。）
実施例 ６
第１表の基本培地に10ｇ／のガラクトースを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で0.41ｇ／の酢酸を生産した。
（同時にエタノールを生成物として得た。）
実施例 ７
第１表の基本培地に10ｇ／のトレハロースを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で0.51ｇ／の酢酸を生産した。
（同時にエタノールを生成物として得た。）
実施例 ８
第１表の基本培地に10ｇ／のラフイノースを
加え、実施例１と同様に培養を行なつた。静置培
養14日間で0.53ｇ／の酢酸を生産した。
（同時にエタノールを生成物として得た。）[Table] (Growth status) Growth on an agar medium containing the composition shown in Table 1 plus 3% agar and 1 g/sorbose is as follows. Shape: Circular Perimeter: Smooth Ridges: Slightly raised Surface: Smooth Color: White (physiological properties) Attitude towards oxygen: Obligately anaerobic Productivity of indole: - Liquefaction of gelatin: - Productivity of catalase: - Productivity of starch Hydrolysis: - Aesculin hydrolysis: + Pigment formation: - Sulfate reducing properties: - Milk: both coagulation and peptone - Urease: - Vitamin requirements: None Growth range: Temperature 25-40℃, optimum temperature 35 °C, PH
5.5 to 9.0, optimal PH7.0 (Assimilation of carbon source) Add 5 ml of liquid medium containing the following carbon source (1%) to the basic medium shown in Table 1 to a test tube with a diameter of 18 mm to prepare a sterile medium. Inoculate 80μ of bacteria, and replace the gas phase with nitrogen (67
%) and carbon dioxide (33%), and cultured stationary at 30°C for 14 days. Growth was measured by measuring turbidity at 600 nm using a spectrometer (Spectronik 20, manufactured by Shimadzu Corporation). If the turbidity at 600 nm differs from the control containing no carbon source by less than 0.1, it is "not assimilated," if it is 0.1 or more and less than 0.2, it is "slightly assimilated," and if it is 0.2 or more, it is "assimilated." And so. Assimilated: raffinose, galactose,
Rhamnose, glycogen, trehalose, mannose, glucose, amygdalin, sorbose Non-assimilated: fructose, xylose,
Ribose, arabinose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, cellobiose, melezitose, mannitol, starch, adonitol, erythritol, inositol, methanol, ethanol, n-propanol, ethylene glycol, glycerol, formic acid, acetic acid, propionic acid, succinic acid (sugar 1% of the sugars that were confirmed to be assimilated in the above test were added to the basal medium shown in Table 1, and the gas phase was changed to nitrogen (67
%) and carbon dioxide (33%), and this bacteria was inoculated and cultured stationary at 30°C. Acetic acid and ethanol were produced as the main products in the medium using all carbon sources. (Comparison with conventional similar species) From the above mycological properties, this Clostridium sp. It is a bacterial strain. Moreover, it does not have the reducing property of sulfate. Based on these facts, this bacterium is considered to be a strain belonging to Clostridium. Gram-negative clostridia include Clostridium cellobioparum and Clostridium thermosatucaroliticum.
thermosa ccharolyticum), Clostridium
Brevifuaciens (Clostridium)
brevifaciens), Clostridium kluyveri, Clostridium malacosomae, Clostridium thermocellum
thermocellum). Among these, Clostridium thermosatucaloriticum and Clostridium thermocellum can be distinguished from this bacterium in that they are thermophilic bacteria. Clostridium brevifuaciens and Clostridium malacosum can be distinguished from this bacterium in that they are alkaline bacteria. Clostridium cellobioparum only produces acetic acid and does not produce ethanol.
Clostridium kriiberi can be distinguished in that its only product is caproic acid. Based on the above, this strain is considered to be a new bacterial species belonging to the genus Clostridium, so it was named Clostridium sp. No. S-1. Furthermore, this strain was deposited with the Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology as FERMP-8852. (Culture method) The culture method is basically the same as for general microorganisms. However, it is necessary to prevent oxygen from entering, and in the laboratory, a method is used in which the incubator is left standing or shaken in an incubator tightly closed with a rubber stopper.On a slightly larger scale, it is usually used. The fermenter can be used as is, and an anaerobic atmosphere can be created by replacing the oxygen in the device with an inert gas such as nitrogen.The type of fermenter is not particularly important, but it can be used normally. In addition to stirring mixing tanks, single-stage or multi-stage bubble column type and draft tube type fermenters can also be used.The carbon source used for the culture may be assimilated as long as it is an assimilated carbon source.The nitrogen source can be ammonium such as ammonium chloride. Like salt and nitrates such as sodium nitrate,
Various nitrogen compounds that can be used in normal fermentation can be used. Other inorganic compounds such as potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, manganese sulfate, sodium chloride, iron sulfate, cobalt chloride, calcium chloride, zinc sulfate, copper sulfate, alum, sodium molybdate, boric acid, or biotin. It is common practice to add vitamins such as yeast extract and yeast extract. Acetic acid accumulated in the medium can be recovered by known techniques. (Effects of the Invention) According to the present invention, acetic acid can be produced by anaerobic fermentation. The present invention will be explained below using specific examples. Example 1 Clostridium sp. No. S-1 strain was cultured as follows. Add 10g of sorbose to the medium shown in Table 1, dispense 5ml into a test tube, sterilize it, add 80μ of a culture solution prepared by pre-cultivating the strain in the same medium in an anaerobic glove box, and seal it with a butyl rubber stopper. The gas phase was replaced with a sterilizing gas containing nitrogen (67%) and carbon dioxide (33%). When static culture was carried out at 30°C for 10 days, 0.43 g of acetic acid was obtained in the culture solution. Acetic acid was confirmed to match the standard product using a gas chromatograph-mass spectrometer. (At the same time, ethanol was obtained as a product.) Example 2 10 g/amygdalin was added to the basal medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. 0.52 g/acetic acid was produced during 14 days of static culture. (At the same time, ethanol was obtained as a product.) Example 3 10 g/glucose was added to the basal medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. Static culture
0.60 g/acetic acid was produced in 14 days. (At the same time, ethanol was obtained as a product.) Example 4 10 g/fructose was added to the basal medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. During 14 days of static culture, 0.48 g/acetic acid was produced. (At the same time, ethanol was obtained as a product.) Example 5 10 g/rhamnose was added to the basic medium shown in Table 1, and cultivation was carried out in the same manner as in Example 1. Static culture
0.40 g/acetic acid was produced in 14 days. (At the same time, ethanol was obtained as a product.) Example 6 10 g/galactose was added to the basal medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. During 14 days of static culture, 0.41 g/acetic acid was produced. (At the same time, ethanol was obtained as a product.) Example 7 10 g/trehalose was added to the basal medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. During 14 days of static culture, 0.51 g/acetic acid was produced. (At the same time, ethanol was obtained as a product.) Example 8 10 g/raffinose was added to the basic medium shown in Table 1, and culture was carried out in the same manner as in Example 1. During 14 days of static culture, 0.53 g/acetic acid was produced. (At the same time, ethanol was obtained as a product.)