【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
（産業上の利用分野）
この発明は、クロストリジウム（Clostridium）
属に属する新規な細菌に関するものである。この
細菌はウラシルなどを製造する方法に用いること
ができる。
（従来技術）
ウラシルは化学的にはホルミル酢酸と尿素を縮
合させて合成する。
従来、微生物の培養液中に、ウラシル系化合物
が他の核酸成分と共に分泌されることについて
は、例えばブレビバクテリウム・リクエフアシエ
ンス（Breuibacterium Iiquefaciens）（ザ・ジヤ
ーナル・オブ・バクテリオロジー（The Janal
of Bacteriolgy）84巻、１頁、1962年）、バチル
ス（Bacillus）属細菌（アグリカルチユラル・バ
イオロジカル・ケミストリー（Agricaltural
Biological Chemistry）、26巻、586頁、1962年）
またはその他の微生物（特公昭40−10957、52−
139786、53−38691）において知られている。微
生物がウラシルのみを生産する例としてブレビバ
クテリウム（Brevibacterium）属の菌（特公昭
57−30476）、ミクロモノスポラ
（Micromonospor）属の菌（特公昭57−18873）
がある。しかし、嫌気性菌が培養液中にウラシル
を蓄積することは知られていない。
（発明が解決しようとする問題点）
上記のような方法が知られているもののウラシ
ルの化学合成法は強烈な条件下の反応を必要とす
る欠点がある。また微生物的には解決すべき課題
はまだ多く、ウラシルの生産速度、蓄積濃度の高
い菌などを得ることは重要である。そのためには
公知の菌種にもとづいた育種改良とならんで、ウ
ラシルを製造する新菌種の創製がきわめて重要な
手段となる。
本発明はこのような目的のもとに検討を重ねた
結果、ウラシルなどを生産する新規嫌気微生物を
分離することに成功し、本発明に到達した。
（問題点を解決するための手段）
本発明の微生物はクロストリジウム属に属しグ
ラム陰性で周鞭毛を有する桿菌である。本菌は偏
性嫌気性有胞子桿菌である点でクロストリジウム
属に属する菌と考えられるが、グラム染色性、炭
素源の資化性など後で詳しく記す諸性質において
公知の同属菌と相違しており、新菌種であると考
えられる。正式の種名はまだ付されていないの
で、本発明ではクロストリジウム・エスピ−No.Ｓ
−１と表示する。次にクロストリジウム・エスピ
−No.Ｓ−１（以下本菌と略記する）の創製法およ
び菌学的性質を示す。
（創製法）
本菌は下記の方法により分離した。すなわち第
１表に示す液体培地にソルボース１ｇ／を加え
た培地５mlを試験管へ分注し滅菌後、嫌気グロー
ブボツクス中で給源を添加し、ブチルゴム栓で密
栓後、気相を嫌気ガスに置換し、30℃で静置培養
し、約10日毎に植え継ぎを行なつた。１回液体培
地で植え継いだのち、第１表の培地に寒天30ｇ／
、ソルボース１ｇ／を加えた寒天培地を用い
てロール・チユーブ法（メソツズ・イン・マイク
ロバイオロジー（Methods in Microbiology）
３巻Ｂ、117頁（1969））を繰り返すことにより本
菌を得た。
（菌学的性質）
本発明の菌株の菌学的性質を示す。この菌学的
性質の検討には、「アンアエロブ・ラボラトリ
ー・マニユアル（Anaerobe Laboratory
Manual）第４版」（The V.I.P.Anaerobe
Laboratory Virginia Polytechnic Institute
and State University，Blacksburg（1972））お
よび「バージーズ・マニユアル・オブ・デターミ
ネイテイブ・バクテリオロジー（Bergey′s
Manual of Determinative Bacteriology）第８
版」「微生物の分類と同定」（長谷川武治著、学会
出版センター）に記載されている方法、培地組成
を用いた。
（顕微鏡的所見）
１ 細胞の形および大きさ：単独もしくは３〜４
連の直桿菌。幅0.4〜0.8μm、長さ３〜8μm
２ 鞭毛：周鞭毛を有する
３ 胞子：あり、ターミナル
４ グラム染色：陰性
（培地組成）
第１表に例示する。
(Industrial Application Field) This invention relates to clostridium
It concerns a new bacterium belonging to the genus. This bacterium can be used in methods for producing uracil and the like. (Prior Art) Uracil is chemically synthesized by condensing formyl acetic acid and urea. Conventionally, the secretion of uracil-based compounds together with other nucleic acid components into the culture solution of microorganisms has been reported, for example, in Breuibacterium Iiquefaciens (The Journal of Bacteriology).
of Bacteriolgy (vol. 84, p. 1, 1962), Bacillus (Agricultural Biological Chemistry),
(Biological Chemistry), vol. 26, p. 586, 1962)
or other microorganisms (Special Publication No. 40-10957, 52-
139786, 53-38691). An example of a microorganism producing only uracil is a bacterium of the genus Brevibacterium (Tokukosho).
57-30476), bacteria of the genus Micromonospora (Special Publication No. 57-18873)
There is. However, it is not known that anaerobic bacteria accumulate uracil in the culture solution. (Problems to be Solved by the Invention) Although the above-mentioned methods are known, the chemical synthesis method for uracil has the drawback of requiring reaction under severe conditions. In addition, there are still many issues to be solved in terms of microorganisms, and it is important to obtain bacteria that can produce uracil at a high production rate and accumulate a high concentration. To this end, in addition to breeding and improvement based on known bacterial strains, the creation of new bacterial strains that produce uracil is an extremely important means. As a result of repeated studies based on these objectives, the present invention was achieved by successfully isolating a new anaerobic microorganism that produces uracil and the like. (Means for Solving the Problems) The microorganism of the present invention is a Gram-negative bacillus that belongs to the genus Clostridium and has periflagella. This bacterium is considered to belong to the genus Clostridium in that it is an obligate anaerobic sporobacillus, but it differs from known congener bacteria in various properties that will be described in detail later, such as Gram staining and ability to assimilate carbon sources. Therefore, it is considered to be a new bacterial species. Since the official species name has not yet been assigned, this invention uses Clostridium sp. No.S.
-1 is displayed. Next, the production method and mycological properties of Clostridium sp. No. S-1 (hereinafter abbreviated as the present bacterium) will be described. (Creation method) This bacterium was isolated by the following method. That is, 5 ml of the liquid medium shown in Table 1 to which 1 g of sorbose was added was dispensed into test tubes, and after sterilization, a supply source was added in an anaerobic glove box, the tube was sealed with a butyl rubber stopper, and the gas phase was replaced with anaerobic gas. The cells were then cultured statically at 30°C, and subcultured approximately every 10 days. After sub-planting once in a liquid medium, add 30g of agar to the medium shown in Table 1.
, roll tube method using an agar medium supplemented with 1 g of sorbose (Methods in Microbiology)
3B, p. 117 (1969)) was repeated to obtain this bacterium. (Mycological properties) The mycological properties of the strain of the present invention are shown. For examination of this mycological property, please refer to the “Anaerobe Laboratory Manual”.
Manual) 4th Edition” (The VIP Anaerobe
Laboratory Virginia Polytechnic Institute
and State University, Blacksburg (1972)) and Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
Manual of Determinative Bacteriology) No. 8
The method and culture medium composition described in "Classification and Identification of Microorganisms" (written by Takeharu Hasegawa, Gakkai Publishing Center) were used. (Microscopic findings) 1 Cell shape and size: Single or 3-4
Direct bacilli of Ren. Width: 0.4 to 0.8 μm, length: 3 to 8 μm 2 Flagella: having periflagella 3 Spores: present, terminal 4 Gram staining: negative (medium composition) Examples are shown in Table 1.
【表】
（生育状態）
第１表の組成に30ｇ／寒天、１ｇ／ソルボ
ースを加えた寒天培地での生育は次の通りであ
る。
形状：円形
周縁：円滑
隆起：わずかに盛上る
表面：円滑
色調：白
（生理的性質）
酸素に対する態度：偏性嫌気性
インドールの生産性：−
ゼラチンの液化：−
カタラーゼの生産性：−
デンプンの加水分野：−
エスクリンの加水分野：＋
色素の生成：−
硫化物の還元性：−
（炭素源の資化性）
第１表の基本培地に下記炭素源（10ｇ／）を
含む液体培地５mlを直径18mmの試験管に加え、無
菌培地を作成し本菌を80μ植菌し、気相を窒素
（67％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに
置換し、30℃で14日間静置培養した。生育は
600nmの濁度を分光計（スペクトロニツク20、島
津製作所製）で測定した。600nmの濁度が炭素源
を含まないコントロールとの差が0.1未満のもの
を「資化しない」、0.1以上0.2未満のものを「わ
ずかに資化する」0.2以上のものを「資化する」
とした。
資化するもの：ラフイノース、ガラクトース、
ラムノース、グリコーゲン、トレハロース、マン
ノース、グルコース、アミグダリン、ソルボース
資化しないもの：フルクトース、キシロース、
リボース、アラビノース、マルトース、シユクロ
ース、ラクトース、メリビオース、セロビオー
ス、メレジトース、マンニトール、デンプン、ア
ドニトール、エリスリトール、イノシトール、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、エチ
レングリコール、グリセロール、ギ酸、酢酸、プ
ロピオン酸、コハク酸
（糖などからの生産物）
第１表の基本培地に上記の試験で資化すること
が確かめられた糖を10ｇ／添加し、気相を窒素
（67％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに
置換し、本菌を植菌、30℃で静置培養した。すべ
ての炭素源において培地中には、主生産物として
酢酸、エタノールが生産された。
（従来の類似種との比較）
上記の菌学的性質から、このクロストリジウ
ム・エスピ−No.Ｓ−１は偏性嫌気性のグラム陰性
有胞子桿菌で、その主要醗酵代謝産物が酢酸、エ
タノールである菌株である。また、硫化物の還元
性もない。このようなことから、本菌はクロスト
リジウム（Clostridium）に属する菌株であると
考えられる。グラム陰性のクロストリジウムには
クロストリジウム・セロビオパルム
（Clostridium Cellobioparum）、クロストリジウ
ム・サーモサツカロリテイカム（Costridium
thermosaccharolyticum）、クロストリジウム・
ブレビフアシエンス（Clostridium
brevifaciens）、クロストリジウム・クルイベリ
（Clostridium kluyveri）クロストリジウム・マ
ラコサム（Clostridium malacosomae）クロス
トリジウム・サーモセラム（Clostridium
thermocellum）がある。このうち、クロストリ
ジウム・サーモサツカロリテイカム、クロストリ
ジウム・サーモセラムは高温菌という点で本菌と
区別できる。クロストリジウム・ブレビフアシエ
ンス、クロストリジウム・マラコサムはアルカリ
菌という点で本菌と区別できる。そして、クロス
トリジウム・セロビオパルムは生産物が、酢酸の
みであり、エタノールを生産しないという点で、
クロストリジウム・クルイベリは生産物がカプロ
ン酸のみであるという点で区別できる。
以上のことから、本菌株はクロストリジウム属
に属する新菌種であると考えられるので、クロス
トリジウム・エスピーNo.Ｓ−１と命名した。さら
にこの菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
「微工研菌寄第8852号（FERM Ｐ−8852）」とし
て寄託した。
（培養方法）
培養方法は原則的には、一般の微生物の場合と
同様であるが、酸素の混入を防ぐことが必要であ
り、実験室的には、ゴム栓等で密栓した培養器中
で、静置あるいは振盪する方法が用いられる。や
や大きい規模では、通常用いられる醗酵槽がその
まま利用でき、装置内の酸素は、窒素などの不活
性気体などで置換することにより嫌気的な雰囲気
をつくることが可能である。醗酵槽の型式は特に
問わないが、普通に使用される攪拌混合槽のほ
か、一段あるいは多段の気泡塔型、ドラフトチユ
ーブ型の醗酵槽も利用できる。
培養に用いる炭素源は、資化する炭素源であれ
ばよく窒素源は塩化アンモニウムのごときアンモ
ニウム塩や硝酸ソーダのような硝酸塩のごとく、
通常の醗酵に用いうる各種の窒素化合物を用いる
ことができる。
その他必要に応じ、リン酸二水素カリ、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、硫
酸鉄、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜
鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、硼酸
などの無機化合物、あるいはビオチンや酵母エキ
スなどのビタミン類を添加することは、通常行な
われる通りでである。
本菌株は休止菌体として使用し資化することが
できない二酸化炭素を原料としてウラシルを生産
する方法に使用することもできる。この場合には
培養で得られた菌体を遠心分離、膜濾過等通常用
いられる方法で培養液から分離し通常用いられる
培養液から炭素源を除いた培養液に懸濁させ、資
化する炭素源の代りに二酸化炭素ガスを供給し反
応させる。二酸化炭素ガスの代りに、反応液中に
溶解二酸化炭素あるいは炭酸塩、炭酸水素塩とし
て加えることもできる。培養とは異なり、反応中
酸素が存在してもウラシルを生産させることがで
きる。
培地中に蓄積されたウラシルは、公知の技術に
より回収することができる。
（発明の効果）
本菌を培養することにより、ウラシル、酢酸、
エタノールを培地中に蓄積することができる。ま
た微生物菌体に二酸化炭素を作用させることによ
つてもウラシルを培地中に蓄積することができ
る。培地中に蓄積されたウラシル、酢酸、エタノ
ールは公知の技術により回収することができる。
（使用例）
以下具体例により本発明を説明する。
使用例 １
クロストリジウム・エスピ−No.Ｓ−１株を以下
のように培養した。第１表に示す培地に10ｇ／
のソルボースを加え試験管へ５ml分注滅菌後、同
培地であらかじめ該菌株を前培養した培養液80μ
を嫌気グローブボツクス中で添加し、ブチルゴ
ム栓で密栓したのち気相を窒素（67％）と二酸化
炭素（33％）を含む除菌ガスに置換した。30℃で
10日間で静置培養を行なつたところ、培養液中に
ウラシル1.5mg／を得た。（ウラシルは培養液か
ら高速液クロで分散した後、質量分析、紫外線吸
収スペクトルおよびNMRスペクトルにより標品
と一致することを確認した）。
使用例 ２
第１表の基本培地に10ｇ／のアミグダリンを
加え使用例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で2.5mg／のウラシルを生産した。
使用例 ３
第１表の基本培地に10ｇ／のグルコースを加
え使用例１と同様に培養を行なつた。静置培養14
日間で1.9mg／ウラシルを生産した。
使用例 ４
第１表の基本培地に10ｇ／のフルクトースを
加え使用例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で2.2mg／のウラシルを生産した。
使用例 ５
第１表の基本培地に10ｇ／のグルコースを加
え使用例１と同様に培養を行なつた。静置培養14
日間で1.1mg／ウラシルを生産した。
使用例 ６
第１表の基本培地に10ｇ／のガラクトースを
加え使用例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で1.3mg／のウラシルを生産した。
使用例 ７
第１表の基本培地に10ｇ／のトレハロースを
加え使用例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で1.7mg／のウラシルを生産した。
使用例 ８
第１表の基本培地に10ｇ／のラフイノースを
加え使用例１と同様に培養を行なつた。静置培養
14日間で1.5mg／のウラシルを生産した。
使用例 ９
第１表に示す培地で10ｇ／のソルボースを炭
素源として培養を行なつた菌体（乾燥重量６mg）
を遠心分離し、第１表に示す培地５mlに懸濁さ
せ、ブチルゴム栓で密栓した後、気相を窒素（67
％）と二酸化炭素（33％）を含む除菌ガスに置換
し、35℃で４日間反応させた。反応液中に30mg／
のウラシルを生成した。
使用例 10
使用例９と同様に菌体（乾燥重量1.6mg）を第
１表に示す培地５mlに懸濁させ、ブチルゴム栓で
密栓した後、気相を窒素（33％）、と二酸化炭素
（33％）空気（33％）を含む除菌ガスに置換し、
35℃で３日間反応させた。反応液中に5.2mg／
のウラシルを生成した。[Table] (Growth status) Growth on an agar medium containing the composition shown in Table 1 plus 30g/agar and 1g/sorbose is as follows. Shape: Circular Perimeter: Smooth Ridges: Slightly raised Surface: Smooth Color: White (physiological properties) Attitude towards oxygen: Obligately anaerobic Productivity of indole: - Liquefaction of gelatin: - Productivity of catalase: - Productivity of starch Hydration field: - Hydration field of Aesculin: + Pigment production: - Sulfide reducibility: - (Carbon source assimilation ability) Add 5 ml of liquid medium containing the following carbon source (10 g/) to the basic medium in Table 1. In addition to a test tube with a diameter of 18 mm, a sterile medium was prepared and 80μ of this bacteria was inoculated, the gas phase was replaced with a sterilizing gas containing nitrogen (67%) and carbon dioxide (33%), and the culture was incubated at 30°C for 14 days. It was cultured statically. The growth is
Turbidity at 600 nm was measured with a spectrometer (Spectronic 20, manufactured by Shimadzu Corporation). If the turbidity at 600 nm differs from the control containing no carbon source by less than 0.1, it is "not assimilated," if it is 0.1 or more and less than 0.2, it is "slightly assimilated," and if it is 0.2 or more, it is "assimilated."
And so. Assimilated: raffinose, galactose,
Rhamnose, glycogen, trehalose, mannose, glucose, amygdalin, sorbose Non-assimilated: fructose, xylose,
Ribose, arabinose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, cellobiose, melezitose, mannitol, starch, adonitol, erythritol, inositol, methanol, ethanol, n-propanol, ethylene glycol, glycerol, formic acid, acetic acid, propionic acid, succinic acid (sugar 10g/sugar, which was confirmed to be assimilated in the above test, was added to the basic medium shown in Table 1, and the gas phase was extracted with nitrogen (67%) and carbon dioxide (33%). The air was replaced with bacterial gas, and this bacteria was inoculated and cultured stationary at 30°C. Acetic acid and ethanol were produced as the main products in the medium using all carbon sources. (Comparison with conventional similar species) Based on the above mycological properties, this Clostridium sp. It is a certain strain of bacteria. It also has no ability to reduce sulfides. Based on these facts, this bacterium is considered to be a strain belonging to Clostridium. Gram-negative clostridia include Clostridium Cellobioparum and Clostridium thermosatucaroliticum.
thermosaccharolyticum), Clostridium
Brevifuaciens (Clostridium)
brevifaciens), Clostridium kluyveri, Clostridium malacosomae, Clostridium thermocellum
thermocellum). Among these, Clostridium thermosatucaloriticum and Clostridium thermocellum can be distinguished from this bacterium in that they are thermophilic bacteria. Clostridium brevifuaciens and Clostridium malacosum can be distinguished from this bacterium in that they are alkaline bacteria. Clostridium cellobioparum only produces acetic acid and does not produce ethanol.
Clostridium kluyveri can be distinguished in that its only product is caproic acid. Based on the above, this strain is considered to be a new bacterial species belonging to the genus Clostridium, so it was named Clostridium sp. No. S-1. Furthermore, this strain was deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology as "FERM P-8852". (Cultivation method) The cultivation method is basically the same as that for general microorganisms, but it is necessary to prevent oxygen from entering, and in the laboratory, culture is carried out in an incubator tightly closed with a rubber stopper. , leaving it still or shaking it. On a slightly larger scale, a commonly used fermenter can be used as is, and an anaerobic atmosphere can be created by replacing the oxygen in the device with an inert gas such as nitrogen. The type of fermentation tank is not particularly limited, but in addition to commonly used stirring and mixing tanks, single-stage or multi-stage bubble column type, and draft tube type fermentation tanks can also be used. The carbon source used for culture may be any carbon source that can be assimilated, and the nitrogen source may be ammonium salts such as ammonium chloride or nitrates such as sodium nitrate.
Various nitrogen compounds that can be used in normal fermentation can be used. Other inorganic compounds such as potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, manganese sulfate, sodium chloride, iron sulfate, cobalt chloride, calcium chloride, zinc sulfate, copper sulfate, alum, sodium molybdate, boric acid, or biotin. Addition of vitamins such as yeast extract and yeast extract is generally carried out. This strain can also be used as a dormant bacterial cell in a method for producing uracil using carbon dioxide, which cannot be assimilated, as a raw material. In this case, the bacterial cells obtained by culture are separated from the culture solution by a commonly used method such as centrifugation or membrane filtration, and suspended in a culture solution in which the carbon source is removed from the normally used culture solution. Supply carbon dioxide gas instead of the source and cause the reaction to occur. Instead of carbon dioxide gas, dissolved carbon dioxide, carbonate, or hydrogen carbonate can also be added to the reaction solution. Unlike culture, uracil can be produced even in the presence of oxygen during the reaction. Uracil accumulated in the medium can be recovered by known techniques. (Effect of the invention) By culturing this bacterium, uracil, acetic acid,
Ethanol can accumulate in the medium. Uracil can also be accumulated in the medium by allowing carbon dioxide to act on microbial cells. Uracil, acetic acid, and ethanol accumulated in the medium can be recovered by known techniques. (Example of Use) The present invention will be explained below using specific examples. Usage Example 1 Clostridium sp. No. S-1 strain was cultured as follows. 10g/
After adding 5 ml of sorbose to a test tube and sterilizing it, add 80μ of a culture solution in which the strain was pre-cultured in the same medium.
was added in an anaerobic glove box, and after sealing with a butyl rubber stopper, the gas phase was replaced with a sterilizing gas containing nitrogen (67%) and carbon dioxide (33%). at 30℃
When static culture was performed for 10 days, 1.5 mg of uracil was obtained in the culture solution. (Uracil was dispersed from the culture solution using high-speed liquid chromatography, and then confirmed to match the standard by mass spectrometry, ultraviolet absorption spectrum, and NMR spectrum.) Usage Example 2 Culture was carried out in the same manner as in Usage Example 1 by adding 10 g/amygdalin to the basic medium shown in Table 1. Static culture
2.5mg/uracil was produced in 14 days. Usage Example 3 Culture was carried out in the same manner as in Usage Example 1 by adding 10 g/glucose to the basal medium shown in Table 1. Static culture 14
1.9mg/uracil was produced per day. Usage Example 4 Culture was carried out in the same manner as in Usage Example 1 by adding 10 g/fructose to the basic medium shown in Table 1. Static culture
2.2 mg/uracil was produced in 14 days. Usage Example 5 Culture was carried out in the same manner as in Usage Example 1 by adding 10 g/glucose to the basal medium shown in Table 1. Static culture 14
1.1mg/uracil was produced per day. Usage Example 6 Culture was carried out in the same manner as in Usage Example 1 by adding 10 g/galactose to the basic medium shown in Table 1. Static culture
1.3 mg/uracil was produced in 14 days. Usage Example 7 Culture was carried out in the same manner as in Usage Example 1 by adding 10 g/trehalose to the basal medium shown in Table 1. Static culture
1.7 mg/uracil was produced in 14 days. Usage Example 8 Culture was carried out in the same manner as in Usage Example 1 by adding 10 g/raffinose to the basic medium shown in Table 1. Static culture
1.5mg/uracil was produced in 14 days. Usage example 9 Bacterial cells (dry weight: 6 mg) cultured in the medium shown in Table 1 using 10 g of sorbose as a carbon source.
was centrifuged, suspended in 5 ml of the medium shown in Table 1, and sealed with a butyl rubber stopper.
%) and carbon dioxide (33%), and reacted at 35°C for 4 days. 30mg/in the reaction solution
of uracil was produced. Usage Example 10 As in Usage Example 9, suspend the bacterial cells (dry weight 1.6 mg) in 5 ml of the medium shown in Table 1, seal with a butyl rubber stopper, and then replace the gas phase with nitrogen (33%) and carbon dioxide ( 33%) replaced with sterilizing gas containing air (33%),
The reaction was carried out at 35°C for 3 days. 5.2mg/in the reaction solution
of uracil was produced.