JPH0456592B2

JPH0456592B2 -

Info

Publication number: JPH0456592B2
Application number: JP9210585A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nakayama; Shinichi Fukunaga; Hiroshi Jinno
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1985-04-27
Filing date: 1985-04-27
Publication date: 1992-09-08
Also published as: JPS61249391A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は固定化微生物の製造方法に関する。（従来の技術）微生物の化合物変換や生産能を利用し、有用な
化合物を生産することが、近年益々盛んになつて
いる。又、これを反復使用可能な形とし、且つ生
産物と微生物菌体とを容易に分離するため、微生
物を固定化して用いる研究が活発に行われてお
り、種々の方法が知られている。従来、微生物の固定化方法としては、微生物が
酸素や抗体といつた蛋白質分子に比較し、はるか
に大きな形を有するものである為、アクリルアミ
ドポリマー、ヒドロキシエチルメタクリレートポ
リマー等の合成ポリマーや、アルギン酸、カラギ
ーナン等の天然ポリマーゲルによる包括固定化が
有利であると謂われている。しかし、ポリアクリ
ルアミドゲル等の合成ポリマーを用いる方法の場
合、モノマーの毒性の為、微生物が死滅したり、
菌体内酵素の失活等が起こり易い。又、開始剤や
光重合架橋法で用いる増感剤が菌体に損失を与え
たり、この固定化微生物を用いて食品や医薬品等
の製造を行う場合、生産物にこれ等が混入する等
の問題がある。更に、これ等の架橋性樹脂の多くは、脆く、膜
状等に成型した場合、折れたり、砕けたりする欠
陥がある。天然物ポリマーゲル、即ち、アルギン
酸のカルシウムイオン架橋ゲルや、カラギーナン
のカリウムイオンによるゲルで固定化する方法
は、安全な天然物による温和な方法であるが、使
用条件によつて、経時的に架橋が切断され解膠し
て菌体等の漏出が起こる問題がある。又、これ等の方法によつて得られるものは、所
謂、拡散律速型の固定化物となる為、これを薄膜
として用いる事が有利であるが、その為に十分な
強度を有するとは言い難い。（発明が解決しようとする問題点）本発明者等は、前述の諸欠点を改良し、効率良
く、且つ安定性に優れると共に、十分な強度を有
する微生物の固定化法に就いて、鋭意研究の結
果、本発明を完成したものである。本発明の目的は、微生物菌体に損傷を与えるこ
となく、高活性を保持したまま或いは死滅するこ
となく固定化する事が可能であると共に、経時的
な脱落がない安定な微生物の固定化方法を提供す
るにある。他の目的は、上記特長を有し更に、膜
強度の物理的性質に優れ、可撓性を有し、且つ、
拡散律速の影響を受けにくい固定化微生物膜の製
造方法を提供するにある。（問題点を解決するための手段）上述の目的は、剪断力を作用し、結晶域を配向
せしめたフイブロインと、微生物菌体とを分散し
た水溶液を、水溶液中へのフイブロインの析出、
或いは水溶液の凝固が起こる前に、成型工程に付
すことを特徴とする固定化微生物の製造方法によ
り達成される。上記本発明方法に於いて微生物とフイブロイン
を含有する水溶液は種々の方法で調整されるが好
ましい調整方法の一例を示すと次の通りである。生糸、まゆ、生糸屑、キキ、ビス、ブーレツト
等の絹原料を常法に従い、セリシンを精練除去し
たものを、フイブロインを溶解し得る例えばアル
カリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の水溶液ある
いは銅−エチレンジアミン水溶液等に溶解せし
め、更にそれを透析脱塩し、フイブロインの濃度
を通常１〜20重量％、好ましくは５〜15重量％に
調整し、予めフイブロイン水溶液を調整してお
く。上記のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩
としては、LiCl、LiBr、Nal、LiNO₃、MgCl₂、
MgBr₂、Mg（NO₃）₂ZnCl₂、Zn（NO₃）₂等が使用
されるが、溶解性並びにフイブロインの分子量を
出来る限り高く保つためにCaCl₂又はCa（NO₃）₂
の使用が好ましい。また、該金属塩濃度は５〜80重量％、好ましく
は20〜70重量％、特に好ましくは40〜60重量％で
ある。又溶解性をより一層ならしめる為に、該水
溶液にメチルアルコール、エチルアルコール、プ
ロピルアルコール等のアルコール類の添加が好ま
しい。添加時期は、絹の溶解の前又は途中が良
く、又添加量は該金属塩溶液に対し、20〜60重量
％、好ましくは25〜50重量％である。本発明で固定化する微生物菌体は、酵母、細
菌、放射菌等が適宜用いられ例えば、アクロモバ
クター属、フラボバクテリウム属、エスシエリシ
ア属、アエロバクター属、ブレビバクテリウム
属、ストレプトコツカス属、コリネバクテリウム
属、アルスロバクター属、セラチア属、シユード
モナス属、アセトバクター属、ストレプトミセス
属、サツカロマイセス属、ロドトラル属に属する
細菌、放射菌、酵母が好ましいものとして挙げら
れる。これ等の微生物菌体は、凍結乾燥や有機溶
媒処理を行つた処理菌体でもよく、又、培養され
た生菌体でもよい。生菌体は、固定化後、培地中
で増殖させることも出来る。固定化される微生物菌体量は、その目的に応じ
適宜決めればよいが、余り過大であると、得られ
た固定化物からの菌体等の脱落が起こる為、一般
にフイブロイン蛋白量に対し、乾燥重量にして好
ましくは50重量％以下、特に好ましくは30重量％
以下である。微生物菌体は、そのまま或いは懸濁液として前
記フイブロイン水溶液と混合するが、剪断力を作
用させることにより、微生物が損傷を受け易い
為、フイブロイン水溶液に剪断力を作用した後混
合する事が好ましい。水溶液に流速勾配を与え、フイブロインに剪断
力を作用する手段としては種々の方法が考えられ
るが、例えば、ミキサー、ホモミキサー、プロペ
ラ等による撹拌や、細い管や、スリツトの間を通
過させること等があるが特に限定されるものでは
ない。しかし、過度に大きな剪断力を与えると短
時間にフイブロインが析出し、操作性が悪く、
又、非常に小さな剪断力では長い処理時間を必要
とする。水溶液に剪断力を作用した後、長時間放
置すると、ゲル化凝固又はフイブロインの析出が
起こり、成形が困難になつたり、不均一になつた
りする為、それ以前に水溶液の粘度が多少上昇し
た段階で成形工程に付することが肝要である。こ
の様にして調整した剪断力を作用し結晶を配向せ
しめたフイブロインと菌体とを溶解した水溶液は
成形工程に付されるが、成形は公知の方法から適
宜選定し菌体の使用目的に応じた形態に成形すれ
ばよい。成形方法の一例として成膜法による場合を示す
と、通常、ガラス板、テフロン板、アクリル板等
の上に上記水溶液を流延し、温度２〜70℃下、好
ましくは10〜50℃下、放置又は通風することによ
り、乾燥固化し膜状に成形する。この際、剪断力
を作用させたフイブロイン−菌体混合水溶液をそ
のまま、或いは必要に応じてこれに増粘剤を加え
て増粘し、各種の形状を有する面上に塗布、乾燥
し、薄膜状に成形することも出来る。本発明に係る固定化微生物は、特に膜状に成形
した場合剪断力を作用させなかつたときに得られ
る膜が殆どの場合、水中で半溶解し、形を留めな
いのに対し、完全な水不溶性膜となる。このこと
は本発明の大きな特長の１つである。本発明の固定化微生物の製造法により常温及び
中性領域を含む温和な条件で実質的にフイブロイ
ンと酵素のみからなる微生物含有成形物を容易に
得ることが出来る。その為、固定化による非生物菌体の損傷はな
く、生菌体の場合はその増殖能を保つたまま、又
処理菌体中の酵素活性も殆ど失われることなく固
定化される。又一般に包括型の固定化の場合、その基質や培
地成分の透過性が問題となり、拡散律速となるが
フイブロイン膜の場合、この影響を受けにくい薄
膜とした場合に於いても可撓性で、十分な強度を
持つ特長を有する。この意味から膜厚は50μｍ以
下が好ましく、特に30μｍ以下では、低分子基質
に対する活性は、元の菌体と殆ど変わらない。生菌体を固定化し、増殖させて用いる場合、固
定化物の内部では殆ど増殖が見られないことか
ら、菌体含量によつても異なるが、300μｍ以下
程度の膜厚とするのが効率的である。更に、静止菌体の場合、固定化物からの菌体脱
落は見られず、安定な活性を示す。（発明の効果）本発明の方法により実質的に無害なフイブロイ
ンのみによる微生物菌体の固定化物が得られる
為、これを食品や医薬品等の製造に用うる事が出
来る。又、センサー等にも有効に利用する事が可能で
ある。以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。実施例１ブーレツト１Kgをマルセル石けん１重量％水溶
液30中に浸漬し、98℃で１時間撹拌混合し、実
質的にセリシンを完全に除き、十分に乾燥後、70
℃で乾燥した。次いで65重量％の塩化カルシウム
水溶液４Kgとエチルアルコール1.6Kgの入つたニ
ーダー中に前記精練ずみの生糸0.8Kgを投入し、
75〜80℃で45分間撹拌溶解した。得られた粘稠な
溶解液に80℃の温水3.2Kgを加え希釈し、再生セ
ルロース系中空繊維を用いた透析装置により透析
脱塩してフイブロイン水溶液を得た。該フイブロ
イン水溶液のフイブロイン濃度は5.5重量％であ
つた。このフイブロイン水溶液を濃縮し、10.0重量％
とし、この200ｇをホモミキサー（特殊機化工業
社製Type4c）により4000rpmで撹拌した後、菌
体内にアルカリフオスフアターゼを有するエスシ
エリシア・コリ凍結乾燥菌体（シグマ社製）200
mgを混合し、５分間放置してからアクリル板上に
流延し、室温（20℃）で20時間乾燥成膜した。得られた固定化菌体膜を、菌体中のアルカリフ
オスフアターゼ活性飯を指標として評価した。活性測定法を以下に示す。酵素活性測定法エスシエリシア・コリ菌体含有膜（10mm×20
mm）をPH8.5−緩衝液２mlに浸漬し、これに、
0.01M−ｐ−ニトロフエニルフオスフエート溶液
３mlを基質として加え、30℃で10分間振盪、反応
させた後、サンプリングし、これを等量の0.5N
−水酸化ナトリウム水溶液に加えて混合し、直し
ち410nｍの吸収を測定し、生成ｐ−ニトロフエ
ノールを定量する。繰り返し測定を行う場合は、
反応後の膜を取り出し、３回、緩衝液中に浸漬、
洗浄した後、次の測定に供給した。又、活性収率
は次式により算出した。活性収率（％）＝膜の発現活性／膜中の添加活性計算量
×100 得られた固定化菌体膜の膜性質と撹拌効果の関
係を第１表に示す。又撹拌を30秒行つた場合、得
た膜について、膜厚と活性の関係を第２表、繰り
返し測定結果を第３表に示す。

【表】

【表】これ等の結果より撹拌による不溶化効果が明瞭
に認められ、又、固定化物からの微生物菌体の脱
落はない。更に30μｍ以下の薄膜で、殆ど拡散抵
抗の影響はないにも拘らず、十分使用に耐える強
度を有する。実施例２ロドトルラ・グルチニスIFO0559をモルト・エ
キス１％、酵母エキス0.1％、Ｌ−フエニルアラ
ニン0.1％、ポリペプトン１％を含む滅菌倍地１
中で、30℃、48時間振盪培養した後、遠心分離
集菌した。得られた菌体を0.05M−トリス塩酸緩衝液／ト
ルエン（１容／５容）中に加え、50℃で５分間振
盪し、処理菌体を再び集菌し、同緩衝液で３度洗
浄した。一方、実施例１と同様にして得たフイブロイン
水溶液を濃縮し濃度を9.5％とし、この200ｇを径
３cmの通常の撹拌羽根により回転数を変えて45分
間撹拌した後、この10ｇに得られた菌体1.8ｇ
（乾燥重量330mg）を混合し、よく分散させた後ア
クリル板上に流延し、18℃相対湿度60％で24時間
乾燥成膜した。撹拌回転数と、膜の性質、の関係を第４表に示
す。

【表】上記の方法で2000rpmで撹拌して得た膜厚50μ
ｍの固定化膜片（10mm×20mm）３枚を桂皮酸50ｍ
Ｍ濃度のアンモニア−塩酸緩衝液（6.5M、PH10）
３mlに浸漬し、30℃で20時間振盪したところ、桂
皮酸の65％がＬ−フエニルアラニンに転換した。
但し、反応は、サンプリング液を100倍希釈し、
290nｍの吸光度で桂皮酸の減少により追跡し、
等速電気泳動法によりＬ−フエニルアラニンの同
定を行つた。実施例３サツカロミセス・セレビジエIFO−0234をモル
トエキス0.3％、酵母エキス0.3％、ペプトン0.5
％、グルコース１％を含むPH5.0の減菌培地500ml
中で30℃、１日振盪培養した後、遠心分離で集菌
し、減菌生理食塩水で３回洗浄した。実施例１と同様に、濃度15.0重量％のフイブロ
イン水溶液、150ｇをホモミキサーを用いて
2500rpmで時間を変えて撹拌した後、この12.5ｇ
に上記で得た湿潤菌体３ｇ（乾燥重量0.75ｇ）を
混合し、アルキル板上に流延した。22℃で20時間
乾燥成膜した。膜厚120μｍとした特、ホモミキサー撹拌時間
が30秒、60秒の場合は、共に水不溶性の固定化膜
を得ることが出来が、撹拌しない場合は、水中で
崩壊した。又、150秒撹拌すると、析出が起こり、
成膜不能であつた。撹拌時間を60秒として得た固定化膜（１cm×２
cm）５枚を滅菌した10％グルコース水溶液10mlに
入れ、30℃で１日静置し、生成エタノール量をガ
スクロマトグラフイー測定した結果、水溶液中に
4.3重量％のエタノールが認められた。実施例４実施例３で得たサツカロミセス・セレビジエ固
定化膜を酵母エキス0.15％、NH₄Cl0.25％、
HK₂PO₄0.55％、MgSO₄・7H₂O0.025％、
CaCl₂0.001％、クエン酸0.3％、NaCl0.25％．グ
ルコース10％を含むPH5.0の滅菌培地中に浸漬し、
30℃で１日振盪した。この固定化膜（１cm×２cm）５枚をNaCl0.9％
を含む10％グルコース水溶液10mlに入れ、30℃で
１日静置し、生成エタノール量を測定した。膜を滅菌水で生成した後、新たなグルコース水
溶液10mlに入れる方法で繰り返し実験を行つた。
結果を第５表に示す。菌体の脱落は認められなか
つた。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１剪断力を作用し、結晶域を配向せしめたフイ
ブロインと、微生物菌体とを分散した水溶液を、
水溶液中へのフイブロインの析出或いは水溶液の
凝固が起こる前に、成形工程に付すことを特徴と
する固定化微生物の製造法。２微生物菌体が生菌体である特許請求の範囲第
１項に記載の固定化微生物の製造方法。３成型工程がフイルム成形である特許請求の範
囲第１項に記載の固定化微生物の製造方法。４フイルムが膜厚300μｍ以下のものである特
許請求の範囲第３項に記載の固定化微生物の製造
方法。５フイルムが膜厚50μｍ以下のものである特許
請求の範囲第３項に記載の固定化微生物の製造方
法。