JPH0456593B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0456593B2 JPH0456593B2 JP60092106A JP9210685A JPH0456593B2 JP H0456593 B2 JPH0456593 B2 JP H0456593B2 JP 60092106 A JP60092106 A JP 60092106A JP 9210685 A JP9210685 A JP 9210685A JP H0456593 B2 JPH0456593 B2 JP H0456593B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- water
- microbial cells
- fibroin
- immobilized
- weight
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は微生物菌体の固定化法に係り、更に詳
細にはポリオール、ポリカルポキシレート、及び
ポリアミドの群より選ばれた水溶性化合物により
水溶液中にフイブロインを析出せしめ該フイブロ
インにより微生物菌体を薄膜状に包括固定化する
方法に関する。 （従来の技術） 微生物の化合物変換や生産能を利用し、有用な
化合物を生産することは、近年益々盛んになつて
いる。また微生物を反復使用可能な形態とし、且
つ、生産物と微生物菌体との分離を容易にする
為、微生物を固定化して用いる研究が活発に行わ
れており、種々の方法が知られている。 従来、微生物の固定化方法としては、微生物が
酵素や抗体等の蛋白質分子と比較して、遥かに大
きいため、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシ
エチルメタクリレート等の合成高分子化合物、ア
ルギン酸、カラギーナン等の天然高分子化合物の
ゲルによる包括固定化が有利であると謂われてい
る。しかし、ポリアクリルアミドゲル等の合成高
分子化合物を用うる方法の場合、モノマーの毒性
に起因して微生物が死滅したり、菌体内酵素の失
活等が生起し易い。更に重合開始剤や光重合架橋
法で用いる増感剤が菌体に損傷を与えたり、この
固定化微生物を用いて食品や医薬品等の製造を行
う場合、生産物にこれ等が混入する等の問題があ
る。更にまた、これ等の架橋性樹脂の多くは、脆
く、膜状等に成型した場合、折傷したり、砕損し
たりする欠点がある。天然高分子化合物ゲル、即
ち、アルギン酸のカルシウムイオン架橋ゲルや、
カラギーナンのカリウムイオンによるゲルで固定
化する方法は、安全な天然物を利用し穏和な条件
下で行う方法があるが、条件によつては経時的に
架橋が切断され解膠して菌体等の漏出が起こるこ
とがある。又、これ等の方法によつて得られるも
のは、所謂、拡散律速型の固定化物となる為、こ
れを薄膜として用いるのが有利であるが、強度が
不十分である。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明者等は、上述の諸欠陥を改良し、効率良
く、且、安全性に優れると共に、十分な強度を有
する微生物の固定化法に就いて鋭意研究の結果、
本発明を完成したものである。 本発明の目的は、微生物菌体に損傷を与えるこ
となく、高活性を保持したまま或いは死滅するこ
となく固定化する事が可能であると共に、経時的
な脱落がない安定な微生物の固定化方法を提供す
るにある。他の目的は、上記特長を備えると共
に、膜強度の物理的性質に優れ、可撓性を有し、
且つ、拡散律速の影響が少ない固定化微生物膜の
製造方法を提供するにある。 （問題点を解決するための手段） 上述の目的は、ポリオール、ポリカルボキシレ
ート、ポリアミドの群より選ばれた少く共１種の
水溶性化合物を含むフイブロイン水溶液に微生物
菌体を混合、分散した後成膜することを特徴とす
る微生物菌体の固定化方法により達成される。 上記本発明方法に於いて微生物とフイブロイン
を含有する水溶液は種々の方法で調整されるが好
ましい調整方法の一例を示すと次の通りである。 生糸、まゆ、生糸屑、キキ、ビス、ブーレツト
等の絹原料を常法に従い、セリシンを精錬除去し
たものを、フイブロインを溶解し得る例えばアル
カリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の水溶液ある
いは銅−エチレンジアミン水溶液等に溶融せし
め、更にそれを透析脱塩し、フイブロインの濃度
を通常１〜20重量％、好ましくは５〜15重量％に
調整し、予めフイブロイン水溶液を調整してお
く。 上記のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩
としては、LiCl、LiBr、Nal、LiNO3、MgCl2、
MgBr2、Mg（NO3）2、ZnCl2、Zn（NO3）2等が使
用されるが、溶解性並びにフイブロインの分子量
を出来る限り高く保つためにCaCl2又はCa
（NO3）2の使用が好ましい。 又、該金属塩濃度は５〜80重量％、好ましくは
20〜70重量％、特に好ましくは40〜60重量％であ
る。又溶解性をより一層ならしめる為に、該水溶
液にメチルアルコール、エチルアルコール、プロ
ピルアルコール等のアルコール類の添加が好まし
い。添加時期は、絹の溶解の前又は途中が良く、
又添加量は該金属塩溶液に対し、20〜60重量％、
好ましくは25〜50重量％である。 本発明で固定化する微生物菌体は、酵母、細
菌、放射菌等が適宜用いられ例えばアクロモバク
ター属、フラボバクテリウム属、エスシエリシア
属、アエロバクター属、ブレビバクテリウム属、
ストレプトコツカス属、コリネバクテリウム属、
アルスロバクター属、セラチア属、シユードモナ
ス属、アセトバクター属、ストレプトミセス属、
サツカロマイセス属、ロドトルラ属に属する細
菌、放線菌、酵母が好ましいものとして挙げられ
る。これ等の微生物菌体は、凍結乾燥や有機溶媒
処理を行なつた処理菌体でもよく、又、培養され
た生菌体でもよい。生菌体は、固定化後、培地中
で増殖させることも出来る。 固定化される微生物菌体量は、その目的に応じ
適宜決めればよいが、多過ぎると、得られた固定
化物からの菌体の脱落及び強度の低下が起こる
為、通常フイブロイン蛋白量に対し、乾燥重量に
して好ましくは50重量％以下、特に好ましくは
0.5〜30重量％である。 微生物菌体は、そのまま或いは懸濁液として前
記フイブロイン水溶液と混合する。 本発明においては得られた菌体含有フイブロイ
ン膜を水不溶化する為、成膜以前の段階で予め、
水溶性化合物を添加するのがよい。水溶性化合物
としては例えば、エチレングリコール、プロピレ
ングリコール、ブタンジオール、ジエチレングリ
コール、トリエチレングリコール、テトラエチレ
ングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビ
ニルアルコール等のポリオール類、カルボキシメ
チルセルロース等のポリカルボキシレート類、ポ
リビニルピロリドンのポリアミド類等が使用し得
る。該水溶性化合物を添加せずに成膜した膜は、
水中で半溶解し崩壊する状態を呈する。この様に
して得た膜は、エチルアルコールやメチルアルコ
ール等に浸漬する事により水不溶性膜とする事が
出来るが、同時に微生物菌体が死滅したり損傷を
受ける。又、菌体中の酵素等も著しく失活等の影
響を受ける。 然し、該水溶性化合物を添加して成膜した膜
は、水中で不溶性膜となるばかりでなく、菌体内
酵素の失活は見られず、又、生菌体を固定化した
場合、適当な培地中に膜を浸漬し、培養すると菌
体が増殖する事が確認され、又、保存時に於いて
安定化効果が見られる場合もある。該水溶性化合
物の添加量は、種類によつても異なるが、多過ぎ
ると、成膜以前に分離、凝集が生起したり、得ら
れた固定化膜の強度が低く、場合によつては菌体
の固定化率も低くなる傾向があるので、通常３〜
300重量％が好ましい。そして一般に上記の水溶
性化合物を添加するとフイブロインの結晶化が促
進される。例えばグリセリンを添加して得られた
菌体含有膜は、高い引張り強度を有すると共に耐
水性に優れた膜であり、Ｘ線回折により高い結晶
性が認められる。 本発明の成膜方法は、通常、ガラス板、テフロ
ン板、アクリル板等の上に上記水溶液を流延し、
温度２〜70℃下、好ましくは10〜50℃下、放置又
は通風することにより、乾燥固化し膜状に成形す
る。この際、水溶性化合物を加えたフイブロイン
−菌体混合水溶液をそのまま、或いは必要に応じ
てこれに増粘剤を加えて増粘し、各種の形状を有
する面上に塗布、乾燥し、薄膜状に成形すること
も出来る。 次に得られた微生物菌体固定化膜は、必要に応
じて水洗する事により、水溶性化合物を除去する
ことが出来る。 （発明の効果） 本発明は、常温及び中性領域を含む温和な条件
での固定方法である為、固定化による微生物菌体
の損傷はなく、生菌体の場合はその増殖能を保つ
たまま、又処理菌体中の酵素活性も殆んど失われ
ることなく固定化される。 又一般に包括型の固定化の場合、その基質や培
地成分の透過性が問題となり、拡散律速となるが
フイブロイン膜の場合、この影響を受けにくい薄
膜とした場合に於いても可撓性があり、強度が大
きい特長がある。そして、かゝる性質を有するこ
とから膜厚は50μｍ以下が好ましく、特に30μｍ
以下では、低分子基質に対する活性は、元の菌体
と殆んど変わらない。又、生菌体を固定化し増殖
させて用いることが出来るが、この場合、固定化
物の内部では殆んど増殖が見られないことから、
菌体含量によつても異なるが、300μｍ以下程度
の膜厚とするのが効率的である。更に、静止菌体
の場合、固定化物からの菌体脱落は見られず、安
定な活性を示す。 本発明の方法により実質的に無害なフイブロイ
ンのみによる微生物菌体の固定化物が得られる
為、これを食品や医薬品等の製造に用うる事が出
来る。又、センサー等にも有効に利用する事が可
能である。 以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ ブーレツト１Kgをマルセル石けん１重量％水溶
液30中に浸漬し、98℃で１時間撹拌混合し、実
質的にセリシンを完全に除き、充分に乾燥後、70
℃で乾燥した。次いで65重量％の塩化カルシウム
水溶液４Kgとエチルアルコール1.6Kgの入つたニ
ーダー中に前記精練ずみの生糸0.8Kgを投入し、
75〜80℃で45分間撹拌溶解した。得られた粘稠な
溶解液に80℃の温水3.2Kgを加え希釈し、再生セ
ルロース系中空繊維を用いた透析装置により透析
脱塩してフイブロイン水溶液を得た。該フイブロ
イン水溶液のフイブロイン濃度は5.5重量％であ
つた。このフイブロイン水溶液を濃縮し、15.0重
量％とし、この10ｇにグリセリンを0.38ｇ加え均
一に混合後、菌体内にアルカリフオスフアターゼ
を有するエスシエリシア・コリの凍結乾燥菌体
（シグマ社製）30mgを混合し、十分に分散させた
後、アクリル板上に流延し、22℃で24時間、乾燥
成膜した。得られた固定化菌体膜を、菌体中のア
ルカリフオスフアターゼ活性を指標として評価し
た。 活性測定法を以下に示す。 酸素活性測定法 エスシエリシア・コリ菌体含有膜（10mm×20
mm）を100c.c.水中に30分間浸漬、洗浄後PH8.5−緩
衝液２mlに浸漬し、これに0.01M−ｐ−ニトロフ
エニルフオスフエート溶液３mlを基質として加
え、30℃で10分間振盪、反応させた後、サンプリ
ングし、これを等量の0.5N−水酸化ナトリウム
水溶液に加えて混合し、直ちに410nｍの吸取を
測定し、生成ｐ−ニトロフエノールを定量する。
繰り返し測定を行なう場合は、反応後の膜を取り
出し、３回、緩衝液中に浸漬、洗浄した後、次の
測定に供した。又、活性収率は次式により算出し
た。 活性収率（％）＝膜の発現活性／膜中の添加活性計算量
×100 得られた固定化菌体膜の膜厚と活性の関係を第
１表、膜厚50μｍの固定化膜について繰り返し測
定結果を第２表に示す。
細にはポリオール、ポリカルポキシレート、及び
ポリアミドの群より選ばれた水溶性化合物により
水溶液中にフイブロインを析出せしめ該フイブロ
インにより微生物菌体を薄膜状に包括固定化する
方法に関する。 （従来の技術） 微生物の化合物変換や生産能を利用し、有用な
化合物を生産することは、近年益々盛んになつて
いる。また微生物を反復使用可能な形態とし、且
つ、生産物と微生物菌体との分離を容易にする
為、微生物を固定化して用いる研究が活発に行わ
れており、種々の方法が知られている。 従来、微生物の固定化方法としては、微生物が
酵素や抗体等の蛋白質分子と比較して、遥かに大
きいため、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシ
エチルメタクリレート等の合成高分子化合物、ア
ルギン酸、カラギーナン等の天然高分子化合物の
ゲルによる包括固定化が有利であると謂われてい
る。しかし、ポリアクリルアミドゲル等の合成高
分子化合物を用うる方法の場合、モノマーの毒性
に起因して微生物が死滅したり、菌体内酵素の失
活等が生起し易い。更に重合開始剤や光重合架橋
法で用いる増感剤が菌体に損傷を与えたり、この
固定化微生物を用いて食品や医薬品等の製造を行
う場合、生産物にこれ等が混入する等の問題があ
る。更にまた、これ等の架橋性樹脂の多くは、脆
く、膜状等に成型した場合、折傷したり、砕損し
たりする欠点がある。天然高分子化合物ゲル、即
ち、アルギン酸のカルシウムイオン架橋ゲルや、
カラギーナンのカリウムイオンによるゲルで固定
化する方法は、安全な天然物を利用し穏和な条件
下で行う方法があるが、条件によつては経時的に
架橋が切断され解膠して菌体等の漏出が起こるこ
とがある。又、これ等の方法によつて得られるも
のは、所謂、拡散律速型の固定化物となる為、こ
れを薄膜として用いるのが有利であるが、強度が
不十分である。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明者等は、上述の諸欠陥を改良し、効率良
く、且、安全性に優れると共に、十分な強度を有
する微生物の固定化法に就いて鋭意研究の結果、
本発明を完成したものである。 本発明の目的は、微生物菌体に損傷を与えるこ
となく、高活性を保持したまま或いは死滅するこ
となく固定化する事が可能であると共に、経時的
な脱落がない安定な微生物の固定化方法を提供す
るにある。他の目的は、上記特長を備えると共
に、膜強度の物理的性質に優れ、可撓性を有し、
且つ、拡散律速の影響が少ない固定化微生物膜の
製造方法を提供するにある。 （問題点を解決するための手段） 上述の目的は、ポリオール、ポリカルボキシレ
ート、ポリアミドの群より選ばれた少く共１種の
水溶性化合物を含むフイブロイン水溶液に微生物
菌体を混合、分散した後成膜することを特徴とす
る微生物菌体の固定化方法により達成される。 上記本発明方法に於いて微生物とフイブロイン
を含有する水溶液は種々の方法で調整されるが好
ましい調整方法の一例を示すと次の通りである。 生糸、まゆ、生糸屑、キキ、ビス、ブーレツト
等の絹原料を常法に従い、セリシンを精錬除去し
たものを、フイブロインを溶解し得る例えばアル
カリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の水溶液ある
いは銅−エチレンジアミン水溶液等に溶融せし
め、更にそれを透析脱塩し、フイブロインの濃度
を通常１〜20重量％、好ましくは５〜15重量％に
調整し、予めフイブロイン水溶液を調整してお
く。 上記のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩
としては、LiCl、LiBr、Nal、LiNO3、MgCl2、
MgBr2、Mg（NO3）2、ZnCl2、Zn（NO3）2等が使
用されるが、溶解性並びにフイブロインの分子量
を出来る限り高く保つためにCaCl2又はCa
（NO3）2の使用が好ましい。 又、該金属塩濃度は５〜80重量％、好ましくは
20〜70重量％、特に好ましくは40〜60重量％であ
る。又溶解性をより一層ならしめる為に、該水溶
液にメチルアルコール、エチルアルコール、プロ
ピルアルコール等のアルコール類の添加が好まし
い。添加時期は、絹の溶解の前又は途中が良く、
又添加量は該金属塩溶液に対し、20〜60重量％、
好ましくは25〜50重量％である。 本発明で固定化する微生物菌体は、酵母、細
菌、放射菌等が適宜用いられ例えばアクロモバク
ター属、フラボバクテリウム属、エスシエリシア
属、アエロバクター属、ブレビバクテリウム属、
ストレプトコツカス属、コリネバクテリウム属、
アルスロバクター属、セラチア属、シユードモナ
ス属、アセトバクター属、ストレプトミセス属、
サツカロマイセス属、ロドトルラ属に属する細
菌、放線菌、酵母が好ましいものとして挙げられ
る。これ等の微生物菌体は、凍結乾燥や有機溶媒
処理を行なつた処理菌体でもよく、又、培養され
た生菌体でもよい。生菌体は、固定化後、培地中
で増殖させることも出来る。 固定化される微生物菌体量は、その目的に応じ
適宜決めればよいが、多過ぎると、得られた固定
化物からの菌体の脱落及び強度の低下が起こる
為、通常フイブロイン蛋白量に対し、乾燥重量に
して好ましくは50重量％以下、特に好ましくは
0.5〜30重量％である。 微生物菌体は、そのまま或いは懸濁液として前
記フイブロイン水溶液と混合する。 本発明においては得られた菌体含有フイブロイ
ン膜を水不溶化する為、成膜以前の段階で予め、
水溶性化合物を添加するのがよい。水溶性化合物
としては例えば、エチレングリコール、プロピレ
ングリコール、ブタンジオール、ジエチレングリ
コール、トリエチレングリコール、テトラエチレ
ングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビ
ニルアルコール等のポリオール類、カルボキシメ
チルセルロース等のポリカルボキシレート類、ポ
リビニルピロリドンのポリアミド類等が使用し得
る。該水溶性化合物を添加せずに成膜した膜は、
水中で半溶解し崩壊する状態を呈する。この様に
して得た膜は、エチルアルコールやメチルアルコ
ール等に浸漬する事により水不溶性膜とする事が
出来るが、同時に微生物菌体が死滅したり損傷を
受ける。又、菌体中の酵素等も著しく失活等の影
響を受ける。 然し、該水溶性化合物を添加して成膜した膜
は、水中で不溶性膜となるばかりでなく、菌体内
酵素の失活は見られず、又、生菌体を固定化した
場合、適当な培地中に膜を浸漬し、培養すると菌
体が増殖する事が確認され、又、保存時に於いて
安定化効果が見られる場合もある。該水溶性化合
物の添加量は、種類によつても異なるが、多過ぎ
ると、成膜以前に分離、凝集が生起したり、得ら
れた固定化膜の強度が低く、場合によつては菌体
の固定化率も低くなる傾向があるので、通常３〜
300重量％が好ましい。そして一般に上記の水溶
性化合物を添加するとフイブロインの結晶化が促
進される。例えばグリセリンを添加して得られた
菌体含有膜は、高い引張り強度を有すると共に耐
水性に優れた膜であり、Ｘ線回折により高い結晶
性が認められる。 本発明の成膜方法は、通常、ガラス板、テフロ
ン板、アクリル板等の上に上記水溶液を流延し、
温度２〜70℃下、好ましくは10〜50℃下、放置又
は通風することにより、乾燥固化し膜状に成形す
る。この際、水溶性化合物を加えたフイブロイン
−菌体混合水溶液をそのまま、或いは必要に応じ
てこれに増粘剤を加えて増粘し、各種の形状を有
する面上に塗布、乾燥し、薄膜状に成形すること
も出来る。 次に得られた微生物菌体固定化膜は、必要に応
じて水洗する事により、水溶性化合物を除去する
ことが出来る。 （発明の効果） 本発明は、常温及び中性領域を含む温和な条件
での固定方法である為、固定化による微生物菌体
の損傷はなく、生菌体の場合はその増殖能を保つ
たまま、又処理菌体中の酵素活性も殆んど失われ
ることなく固定化される。 又一般に包括型の固定化の場合、その基質や培
地成分の透過性が問題となり、拡散律速となるが
フイブロイン膜の場合、この影響を受けにくい薄
膜とした場合に於いても可撓性があり、強度が大
きい特長がある。そして、かゝる性質を有するこ
とから膜厚は50μｍ以下が好ましく、特に30μｍ
以下では、低分子基質に対する活性は、元の菌体
と殆んど変わらない。又、生菌体を固定化し増殖
させて用いることが出来るが、この場合、固定化
物の内部では殆んど増殖が見られないことから、
菌体含量によつても異なるが、300μｍ以下程度
の膜厚とするのが効率的である。更に、静止菌体
の場合、固定化物からの菌体脱落は見られず、安
定な活性を示す。 本発明の方法により実質的に無害なフイブロイ
ンのみによる微生物菌体の固定化物が得られる
為、これを食品や医薬品等の製造に用うる事が出
来る。又、センサー等にも有効に利用する事が可
能である。 以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ ブーレツト１Kgをマルセル石けん１重量％水溶
液30中に浸漬し、98℃で１時間撹拌混合し、実
質的にセリシンを完全に除き、充分に乾燥後、70
℃で乾燥した。次いで65重量％の塩化カルシウム
水溶液４Kgとエチルアルコール1.6Kgの入つたニ
ーダー中に前記精練ずみの生糸0.8Kgを投入し、
75〜80℃で45分間撹拌溶解した。得られた粘稠な
溶解液に80℃の温水3.2Kgを加え希釈し、再生セ
ルロース系中空繊維を用いた透析装置により透析
脱塩してフイブロイン水溶液を得た。該フイブロ
イン水溶液のフイブロイン濃度は5.5重量％であ
つた。このフイブロイン水溶液を濃縮し、15.0重
量％とし、この10ｇにグリセリンを0.38ｇ加え均
一に混合後、菌体内にアルカリフオスフアターゼ
を有するエスシエリシア・コリの凍結乾燥菌体
（シグマ社製）30mgを混合し、十分に分散させた
後、アクリル板上に流延し、22℃で24時間、乾燥
成膜した。得られた固定化菌体膜を、菌体中のア
ルカリフオスフアターゼ活性を指標として評価し
た。 活性測定法を以下に示す。 酸素活性測定法 エスシエリシア・コリ菌体含有膜（10mm×20
mm）を100c.c.水中に30分間浸漬、洗浄後PH8.5−緩
衝液２mlに浸漬し、これに0.01M−ｐ−ニトロフ
エニルフオスフエート溶液３mlを基質として加
え、30℃で10分間振盪、反応させた後、サンプリ
ングし、これを等量の0.5N−水酸化ナトリウム
水溶液に加えて混合し、直ちに410nｍの吸取を
測定し、生成ｐ−ニトロフエノールを定量する。
繰り返し測定を行なう場合は、反応後の膜を取り
出し、３回、緩衝液中に浸漬、洗浄した後、次の
測定に供した。又、活性収率は次式により算出し
た。 活性収率（％）＝膜の発現活性／膜中の添加活性計算量
×100 得られた固定化菌体膜の膜厚と活性の関係を第
１表、膜厚50μｍの固定化膜について繰り返し測
定結果を第２表に示す。
【表】
【表】
【表】
固定化物からの微生物菌体の脱落はなく、更に
30μｍ以下の薄膜では、殆んど拡散抵抗の影響は
なくなるが、十分使用に耐える強度を有するもの
であつた。 実施例 ２ ロドトルラ・グルチニス、IFO0559をモルト・
エキス１％、酵母エキス0.1％、Ｌ−フエニルア
ラニン0.1％、ポリペプトン１％を含む滅菌培地
１中で、30℃、48時間振盪培養した後、遠心分
離集菌した。得られた菌体を0.05M−トリス塩酸
緩衝液／トルエン（１容／５容）中に加え、50℃
で５分間振盪し、処理菌体を再び集菌し、同緩衝
液で３度洗浄した。 一方、実施例１と同様にして得たフイブロイン
水溶液を濃縮し16.0重量％とした。この10ｇに、
平均分子量300のポリエチレングリコールを0.6ｇ
加え、次に、菌体を添加量を変えて混合し、十分
に分散させた後、アクリル板上に流延し、20℃、
相対温度60で24時間送風乾燥成膜した。固定化菌
体膜片（10mm×20mm）３枚を桂皮酸50ｍＭ濃度の
アンモニアー塩酸緩衝液（6.5M、PH10）３mlに
浸漬した後、30℃で20時間振盪し、桂皮酸からＬ
−フエニルアラニンへの転換率を測定により求め
た。結果を第３表に示す。上記において反応は、
サンプリング液を100培希釈し、290nｍの吸光度
で桂皮酸の減少を追跡し、等速電気泳動法により
Ｌ−フエニルアラニンの同定を行なつた。 又、このアルカリ性条件下に於いて、対照とし
て実験を行なつたアルギン酸カルシウム架橋法に
より菌体を包括固定化した膜は容易に解膠し、溶
解したが、フイブロインによる本発明の固定化膜
は全く劣化や菌体の漏出は認められず、反応に用
うることが出来た。
30μｍ以下の薄膜では、殆んど拡散抵抗の影響は
なくなるが、十分使用に耐える強度を有するもの
であつた。 実施例 ２ ロドトルラ・グルチニス、IFO0559をモルト・
エキス１％、酵母エキス0.1％、Ｌ−フエニルア
ラニン0.1％、ポリペプトン１％を含む滅菌培地
１中で、30℃、48時間振盪培養した後、遠心分
離集菌した。得られた菌体を0.05M−トリス塩酸
緩衝液／トルエン（１容／５容）中に加え、50℃
で５分間振盪し、処理菌体を再び集菌し、同緩衝
液で３度洗浄した。 一方、実施例１と同様にして得たフイブロイン
水溶液を濃縮し16.0重量％とした。この10ｇに、
平均分子量300のポリエチレングリコールを0.6ｇ
加え、次に、菌体を添加量を変えて混合し、十分
に分散させた後、アクリル板上に流延し、20℃、
相対温度60で24時間送風乾燥成膜した。固定化菌
体膜片（10mm×20mm）３枚を桂皮酸50ｍＭ濃度の
アンモニアー塩酸緩衝液（6.5M、PH10）３mlに
浸漬した後、30℃で20時間振盪し、桂皮酸からＬ
−フエニルアラニンへの転換率を測定により求め
た。結果を第３表に示す。上記において反応は、
サンプリング液を100培希釈し、290nｍの吸光度
で桂皮酸の減少を追跡し、等速電気泳動法により
Ｌ−フエニルアラニンの同定を行なつた。 又、このアルカリ性条件下に於いて、対照とし
て実験を行なつたアルギン酸カルシウム架橋法に
より菌体を包括固定化した膜は容易に解膠し、溶
解したが、フイブロインによる本発明の固定化膜
は全く劣化や菌体の漏出は認められず、反応に用
うることが出来た。
【表】
実施例 ３
サツカロミセス・セレビジエ IFO−0234をモ
ルト・エキス0.3％、酵母エキス0.3％、ペプトン
0.5％、グルコース１％を含むPH5.0の滅菌培地
500c.c.中で、30℃１日振盪培養した後、遠心分離
で集菌し、滅菌生理食塩水で３回洗浄した。 実施例１と同様にして調整したフイブロイン水
溶液を濃縮し、15.5重量％とした。この10ｇに分
子量300のポリエチレングリコール0.53ｇを加え、
次に上記で得た湿潤菌体2.4ｇ（乾燥重量0.6ｇ）
を混合し、十分に分散させた後、アクリル板上に
流延し引き続いて22℃で20時間送風下、乾燥成膜
した。 膜厚100μｍの固定化膜（１cm×２cm）５枚を
滅菌した10％グルコース水溶液10mlに入れ、30℃
で１日静置し、生成エタノール量をガスクロマト
グラフイーにより測定したところ、水溶液中に
4.2重量％のエタノールが認められた。 実施例 ４ 実施例１と同様の方法で、ポリエチレングリコ
ールの代りにグリセリンを用いて調製した厚さ
100μｍのサツカロミセス・セレビジエ固定化膜
を酵母エキス0.15％、NH4Cl0.25％、
HK2PO40.55％、MgSO4・7H2O0.025％、
CaCl20.001％、クエン酸0.3％、NaCl0.25％、グ
ルコース10％を含むPH5.0の滅菌培地中に浸漬し、
30℃で１日振盪した。この固定化膜（１cm×２
cm）５枚をNaCl0.9％を含む10％グルコース水溶
液10mlに入れ、30℃で１日静置し、生成エタノー
ル量を測定した。 膜を滅菌水で洗浄した後、新たなグルコース水
溶液10mlに入れる方法で繰り返し実験を行なつ
た。結果を第４表に示す。菌体の脱落は認められ
なかつた。一方、最初に培地中に固定化膜を入
れ、培養する処理を行わないと、繰り返し実験に
於いて、５回目以降のエタノール生成量が低下
し、3.5〜2.5重量％となつた。
ルト・エキス0.3％、酵母エキス0.3％、ペプトン
0.5％、グルコース１％を含むPH5.0の滅菌培地
500c.c.中で、30℃１日振盪培養した後、遠心分離
で集菌し、滅菌生理食塩水で３回洗浄した。 実施例１と同様にして調整したフイブロイン水
溶液を濃縮し、15.5重量％とした。この10ｇに分
子量300のポリエチレングリコール0.53ｇを加え、
次に上記で得た湿潤菌体2.4ｇ（乾燥重量0.6ｇ）
を混合し、十分に分散させた後、アクリル板上に
流延し引き続いて22℃で20時間送風下、乾燥成膜
した。 膜厚100μｍの固定化膜（１cm×２cm）５枚を
滅菌した10％グルコース水溶液10mlに入れ、30℃
で１日静置し、生成エタノール量をガスクロマト
グラフイーにより測定したところ、水溶液中に
4.2重量％のエタノールが認められた。 実施例 ４ 実施例１と同様の方法で、ポリエチレングリコ
ールの代りにグリセリンを用いて調製した厚さ
100μｍのサツカロミセス・セレビジエ固定化膜
を酵母エキス0.15％、NH4Cl0.25％、
HK2PO40.55％、MgSO4・7H2O0.025％、
CaCl20.001％、クエン酸0.3％、NaCl0.25％、グ
ルコース10％を含むPH5.0の滅菌培地中に浸漬し、
30℃で１日振盪した。この固定化膜（１cm×２
cm）５枚をNaCl0.9％を含む10％グルコース水溶
液10mlに入れ、30℃で１日静置し、生成エタノー
ル量を測定した。 膜を滅菌水で洗浄した後、新たなグルコース水
溶液10mlに入れる方法で繰り返し実験を行なつ
た。結果を第４表に示す。菌体の脱落は認められ
なかつた。一方、最初に培地中に固定化膜を入
れ、培養する処理を行わないと、繰り返し実験に
於いて、５回目以降のエタノール生成量が低下
し、3.5〜2.5重量％となつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ポリオール、ポリカルボキシレート及びポリ
アミドの群より選ばれた少なく共１種の水溶性化
合物とフイブロインと、微生物菌体とを水に分散
せしめた後、成膜することを特徴とする微生物菌
体の固定化法。 ２ 水溶性化合物がグリセリン、ポリアルキレン
グリコール又はポリビニルアルコールである特許
請求の範囲第１項記載の微生物菌体の固定化法。 ３ 水溶性化合物が、カルボキシメチルセルロー
スである特許請求の範囲第１項記載の微生物菌体
の固定化法。 ４ 水溶性化合物がポリビニルピロリドンである
特許請求の範囲第１項記載の微生物菌体の固定化
法。 ５ 水溶性化合物がフイブロインに対して３〜
300重量％添加されるものである特許請求の範囲
第１項乃至第４項の何れかに記載の微生物菌体の
固定化法。 ６ 微生物菌体が乾燥重量に換算して、フイブロ
インに対して0.5〜50重量％添加されるものであ
る特許請求の範囲第１項乃至第５項の何れかに記
載の微生物菌体の固定化法。 ７ 成膜が300μｍ以下で行われるものである特
許請求の範囲第１項乃至第６項の何れかに記載の
微生物菌体の固定化法。 ８ 成膜が50μｍ以下で行われるものである特許
請求の範囲第１項乃至第６項の何れかに記載の微
生物菌体の固定化法。 ９ 水溶性化合物が成膜後水洗除去されるもので
ある特許請求の範囲第１項乃至第８項の何れかに
記載の微生物菌体の固定化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60092106A JPS61249392A (ja) | 1985-04-27 | 1985-04-27 | 微生物菌体の固定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60092106A JPS61249392A (ja) | 1985-04-27 | 1985-04-27 | 微生物菌体の固定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61249392A JPS61249392A (ja) | 1986-11-06 |
| JPH0456593B2 true JPH0456593B2 (ja) | 1992-09-08 |
Family
ID=14045183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60092106A Granted JPS61249392A (ja) | 1985-04-27 | 1985-04-27 | 微生物菌体の固定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61249392A (ja) |
-
1985
- 1985-04-27 JP JP60092106A patent/JPS61249392A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61249392A (ja) | 1986-11-06 |
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