JPH0458575B2 - - Google Patents
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- JPH0458575B2 JPH0458575B2 JP58203574A JP20357483A JPH0458575B2 JP H0458575 B2 JPH0458575 B2 JP H0458575B2 JP 58203574 A JP58203574 A JP 58203574A JP 20357483 A JP20357483 A JP 20357483A JP H0458575 B2 JPH0458575 B2 JP H0458575B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
本発明は、リユーマチ性疾病の検査方法および
検査用試験キツトに関するものであり、特に自家
免疫性成分が存在することを特徴とする各種のリ
ユーマチ性疾病を分別して検査する方法に関する
ものである。 自家免疫性疾病は大きく２つに分類される。す
なわち、全身的疾病と臓器疾患とである。全身的
疾病の中には、リユーマチ性疾病として知られて
いるものがある。この中には、全身紅斑性狼瘡
（systemic lupus erythematosus：SLE）、リユ
ーマチ様関節炎（rheumatoid arthritis：RA）
および混合結合織炎（mixed connective tissue
disease：MCTD）などが含まれる。これらの疾
病は全身的なものであるから、３種類の疾病のい
ずれかにかかつた患者は、初期には同様な症状を
呈する。従つて、これらの疾病を区別することは
しばしば非常に困難である。また、これらの
SLE、RAおよびMCTDを早期に分別して検査す
ることは有用なことである。 歴史的には、SLEの診断は、紅斑性狼瘡
（lupus erythematosus：LE）細胞の同定によつ
て行なわれた。この細胞、すなわち多形核白血球
は、患者自身の白血球の核成分からなると通常考
えられている大きい不定形封入体の存在を特徴と
している。この方法による診断は明確とは言い難
く、SLE患者の約80％はLE細胞を有しているが、
一方、「LE細胞陽性」を呈する人の70％以上が
SLEにかかつていない。 免疫体蛍光技術の開発により、SLEに通常関連
している自家抗体群の同定が可能になつた。これ
らの抗体は患者自身の細胞の核を指標として有し
ており、抗核抗体（antinuclear antibodies：
ANA）として知られるようになつた。しかし、
残念ながら全てのSLE患者はANAを示すが、全
てのRA患者およびMCTD患者もまたANAを示
す。 この特異性がないことは、核中に存在する種々
の抗原性指標を考慮すれば驚くには当らない。ヌ
クレオプロテイン、ヌクリアグリコプロテイン、
複ストランドDNA（double−stranded DNA：
dsDNA）、単ストランドDNA（single−stranded
DNA：ssDNA）、複ストランドRNA（double−
stranded RNA：dsRNA）、単ストランドRNA
（single−stranded RNA：ssRNA）、ポリヌクレ
オチド、および抽出可能核抗原（extractable
nuclear antigen：ENA）として知られている抗
原群などの核成分に対する自家抗体はSLE中のみ
に同定されている。 幾つかの核抗原の分子構造は、例えばDNAに
ついてはL.E.Adams他、Amer.J.of Clin.Patn.，
77(1)：54−59（1982）；またRNAについてはM.R.
Lerner他、Science、211巻、400−402（1981）；
およびヒストンについては、A.Aitkaci他、J.
Imm.Meth.，44：311−322（1981）などにより知
られており、その大部分は免疫学的および医化学
的性質により説明されている。特定の細胞作用を
有する蛋白質としてのこれらの抗原の同定は、自
家免疫症の病因を解明すると共に、病気の分別診
断法を提供した。 現在では、SLEなどのリユーマチ性疾病の診断
のための試験の大部分はDNAに対する自家抗体
の同定に基づいている。例えば、 米国特許第4234563号（D.R.Rippe、1980年11
月18日）は、DNAに関連したSLE患者の抗体の
検出法を記載している。DNAを、血清サンプル
と反応させたメチル化ウシ血清アルブミン
（mBSA）と結合し、次に周知の蛍光アンチ−グ
ロブリン法によつて検出する。更に、抗原を
DNAから胸線エキストラクトに変え、抽出可能
核抗原（ENA）の抗体の検出をクレームしてい
る。このENAはそれ自体は同定されず、SLEの
テストはMCTDの検出には使用さず、またその
逆もできない。 米国特許第3897212号（S.A.Leon他、1975年７
月29日）は、SLE患者のDNAに対する抗体の直
接放射線免疫分析について記載しており、血清サ
ンプルを放射性DNAと反応させ、DNAの沈澱お
よび試料血清中の放射能を測定している。 米国特許第3997657号（B.F.Dziobkowski、
1976年12月14日）は、人間の抗核因子の検出にド
ライスライド法を用いることを記載している。同
法においては、試料血清を、あらかじめガラスス
ライドに塗布した胸線細胞抽出物と反応させ、次
に免疫蛍光分析を行なつている。抽出物の成分の
同定は行なつていない。 米国特許第4314987号（R.I.Morris他、1982年
２月９日）は、抗核抗体の蛍光のパターン（即
ち、均質の周縁部、斑点、核仁など）およびその
後の抗−DNAまたは抗−ENA抗体の試験に基づ
いたリユーマチ性疾病の診断法を記載している。
この特許では、SLEとMCTDとを区別できるこ
とをクレームしているが、既存の試験法における
実施法および判断法を述べており、試験自体の精
度は良くない。更に、そのような方法の効果を当
業者が判断するためのデータが示されていない。 蛍光の核仁パターンは不明確であると考えられ
る米国特許第4314987号の技術とは反対に、J.L.
Pinnas他、J.of.Immunol.、111(4)：996−1004
（1973）の核仁蛍光についての記載は本発明の研
究の端緒となつたものである。 本発明の目的は、全身紅斑性狼瘡（SLE）およ
び混合結合織炎（MCTD）などのリユーマチ性
疾病について、これらの疾病に伴なう自家抗体群
を分析することによつて分別する方法を提供する
ことである。SLE患者またはMCTD患者の血清
を、高度に精製した核仁条の酵素と、そのまま
（全酵素）の状態または変性（サブユニツト）状
態で反応させることによつて自家抗体を同定す
る。酵素（またはそのサブユニツト）は、試料血
清中に存在する酵素特異性抗体に対して、抗原性
指標として作用する。抗原−抗体コンプレツクス
は、各種の分析指示薬により検出することができ
る。試薬の添加および除去を容易にするために、
分析は固相で行なう。 従つて、試料血清中の抗体の特定な反応性を、
種々の酵素のサブユニツトによつて観察すること
により、SLEまたはMCTDの、迅速で正確な分
別的検査を行なうことができる。 現在まで、種々のリユーマチ性自家免疫性疾病
を分別し得る単一の確実な血清学的方法はなかつ
た。従つて、本発明の第一の目的は、そのような
方法を提供することである。本発明の他の目的は
検査用試験キツトの形態に作り易く、かつ、試験
は廉価に準備および実施ができ、更に臨床試験室
で容易に行なうことが可能な試験キツトを提供す
ることである。 実施例において、本発明は以下の要素からなる
ものである。 Ａ 精製RNAポリメラーゼ RNAポリメラーゼは、DNAをRNAにすると
きに触媒作用をする酵素であり、抽出可能核抗原
（ENA）として使用する核抽出物中の多くの蛋白
質中に存在すると考えられる。抗核仁抗体はSLE
患者の血清中に存在すると報告されているので
（J.L.Pinnas他の前記文献参照）、核仁系の特定の
RNAポリメラーゼであるRNAポリメラーゼ
は、前記の抗核仁抗体群の抗原指標として選択さ
れた。 抗−RNAポリメラーゼ抗体は、100％のSLE
患者に検出されたが、100％の通常の患者には検
出されなかつた。抗−RNAポリメラーゼ抗体は、
100％のMCTD患者にやはり検出され、78％のリ
ユーマチ様関節炎患者にも検出された。 しかしRNAポリメーラゼは複合酵素である。
即ち、該酵素は８つの異なつたポリペプチドから
なつている： S1（Mr＝190000）、S2（Mr＝120000）、 S3（Mr＝65000）、S4（Mr＝42000）、 S5（Mr＝25000）、S6（Mr＝21000）、 S7（Mr＝19000）およびS8（Mr＝18000）。 これらのポリペプチドのうち、いずれが指標の
抗原中に含まれているかを決定する方法を発明し
た。抗−RNAポリメラーゼ抗体の特異性は、
酵素の個々のポリペプチドに関し、患者によつて
相違しているが、各種のリユーマチ性疾病につい
て、抗体−ポリペプチド間反応の明確なパターン
が観察された（第１表参照）。
検査用試験キツトに関するものであり、特に自家
免疫性成分が存在することを特徴とする各種のリ
ユーマチ性疾病を分別して検査する方法に関する
ものである。 自家免疫性疾病は大きく２つに分類される。す
なわち、全身的疾病と臓器疾患とである。全身的
疾病の中には、リユーマチ性疾病として知られて
いるものがある。この中には、全身紅斑性狼瘡
（systemic lupus erythematosus：SLE）、リユ
ーマチ様関節炎（rheumatoid arthritis：RA）
および混合結合織炎（mixed connective tissue
disease：MCTD）などが含まれる。これらの疾
病は全身的なものであるから、３種類の疾病のい
ずれかにかかつた患者は、初期には同様な症状を
呈する。従つて、これらの疾病を区別することは
しばしば非常に困難である。また、これらの
SLE、RAおよびMCTDを早期に分別して検査す
ることは有用なことである。 歴史的には、SLEの診断は、紅斑性狼瘡
（lupus erythematosus：LE）細胞の同定によつ
て行なわれた。この細胞、すなわち多形核白血球
は、患者自身の白血球の核成分からなると通常考
えられている大きい不定形封入体の存在を特徴と
している。この方法による診断は明確とは言い難
く、SLE患者の約80％はLE細胞を有しているが、
一方、「LE細胞陽性」を呈する人の70％以上が
SLEにかかつていない。 免疫体蛍光技術の開発により、SLEに通常関連
している自家抗体群の同定が可能になつた。これ
らの抗体は患者自身の細胞の核を指標として有し
ており、抗核抗体（antinuclear antibodies：
ANA）として知られるようになつた。しかし、
残念ながら全てのSLE患者はANAを示すが、全
てのRA患者およびMCTD患者もまたANAを示
す。 この特異性がないことは、核中に存在する種々
の抗原性指標を考慮すれば驚くには当らない。ヌ
クレオプロテイン、ヌクリアグリコプロテイン、
複ストランドDNA（double−stranded DNA：
dsDNA）、単ストランドDNA（single−stranded
DNA：ssDNA）、複ストランドRNA（double−
stranded RNA：dsRNA）、単ストランドRNA
（single−stranded RNA：ssRNA）、ポリヌクレ
オチド、および抽出可能核抗原（extractable
nuclear antigen：ENA）として知られている抗
原群などの核成分に対する自家抗体はSLE中のみ
に同定されている。 幾つかの核抗原の分子構造は、例えばDNAに
ついてはL.E.Adams他、Amer.J.of Clin.Patn.，
77(1)：54−59（1982）；またRNAについてはM.R.
Lerner他、Science、211巻、400−402（1981）；
およびヒストンについては、A.Aitkaci他、J.
Imm.Meth.，44：311−322（1981）などにより知
られており、その大部分は免疫学的および医化学
的性質により説明されている。特定の細胞作用を
有する蛋白質としてのこれらの抗原の同定は、自
家免疫症の病因を解明すると共に、病気の分別診
断法を提供した。 現在では、SLEなどのリユーマチ性疾病の診断
のための試験の大部分はDNAに対する自家抗体
の同定に基づいている。例えば、 米国特許第4234563号（D.R.Rippe、1980年11
月18日）は、DNAに関連したSLE患者の抗体の
検出法を記載している。DNAを、血清サンプル
と反応させたメチル化ウシ血清アルブミン
（mBSA）と結合し、次に周知の蛍光アンチ−グ
ロブリン法によつて検出する。更に、抗原を
DNAから胸線エキストラクトに変え、抽出可能
核抗原（ENA）の抗体の検出をクレームしてい
る。このENAはそれ自体は同定されず、SLEの
テストはMCTDの検出には使用さず、またその
逆もできない。 米国特許第3897212号（S.A.Leon他、1975年７
月29日）は、SLE患者のDNAに対する抗体の直
接放射線免疫分析について記載しており、血清サ
ンプルを放射性DNAと反応させ、DNAの沈澱お
よび試料血清中の放射能を測定している。 米国特許第3997657号（B.F.Dziobkowski、
1976年12月14日）は、人間の抗核因子の検出にド
ライスライド法を用いることを記載している。同
法においては、試料血清を、あらかじめガラスス
ライドに塗布した胸線細胞抽出物と反応させ、次
に免疫蛍光分析を行なつている。抽出物の成分の
同定は行なつていない。 米国特許第4314987号（R.I.Morris他、1982年
２月９日）は、抗核抗体の蛍光のパターン（即
ち、均質の周縁部、斑点、核仁など）およびその
後の抗−DNAまたは抗−ENA抗体の試験に基づ
いたリユーマチ性疾病の診断法を記載している。
この特許では、SLEとMCTDとを区別できるこ
とをクレームしているが、既存の試験法における
実施法および判断法を述べており、試験自体の精
度は良くない。更に、そのような方法の効果を当
業者が判断するためのデータが示されていない。 蛍光の核仁パターンは不明確であると考えられ
る米国特許第4314987号の技術とは反対に、J.L.
Pinnas他、J.of.Immunol.、111(4)：996−1004
（1973）の核仁蛍光についての記載は本発明の研
究の端緒となつたものである。 本発明の目的は、全身紅斑性狼瘡（SLE）およ
び混合結合織炎（MCTD）などのリユーマチ性
疾病について、これらの疾病に伴なう自家抗体群
を分析することによつて分別する方法を提供する
ことである。SLE患者またはMCTD患者の血清
を、高度に精製した核仁条の酵素と、そのまま
（全酵素）の状態または変性（サブユニツト）状
態で反応させることによつて自家抗体を同定す
る。酵素（またはそのサブユニツト）は、試料血
清中に存在する酵素特異性抗体に対して、抗原性
指標として作用する。抗原−抗体コンプレツクス
は、各種の分析指示薬により検出することができ
る。試薬の添加および除去を容易にするために、
分析は固相で行なう。 従つて、試料血清中の抗体の特定な反応性を、
種々の酵素のサブユニツトによつて観察すること
により、SLEまたはMCTDの、迅速で正確な分
別的検査を行なうことができる。 現在まで、種々のリユーマチ性自家免疫性疾病
を分別し得る単一の確実な血清学的方法はなかつ
た。従つて、本発明の第一の目的は、そのような
方法を提供することである。本発明の他の目的は
検査用試験キツトの形態に作り易く、かつ、試験
は廉価に準備および実施ができ、更に臨床試験室
で容易に行なうことが可能な試験キツトを提供す
ることである。 実施例において、本発明は以下の要素からなる
ものである。 Ａ 精製RNAポリメラーゼ RNAポリメラーゼは、DNAをRNAにすると
きに触媒作用をする酵素であり、抽出可能核抗原
（ENA）として使用する核抽出物中の多くの蛋白
質中に存在すると考えられる。抗核仁抗体はSLE
患者の血清中に存在すると報告されているので
（J.L.Pinnas他の前記文献参照）、核仁系の特定の
RNAポリメラーゼであるRNAポリメラーゼ
は、前記の抗核仁抗体群の抗原指標として選択さ
れた。 抗−RNAポリメラーゼ抗体は、100％のSLE
患者に検出されたが、100％の通常の患者には検
出されなかつた。抗−RNAポリメラーゼ抗体は、
100％のMCTD患者にやはり検出され、78％のリ
ユーマチ様関節炎患者にも検出された。 しかしRNAポリメーラゼは複合酵素である。
即ち、該酵素は８つの異なつたポリペプチドから
なつている： S1（Mr＝190000）、S2（Mr＝120000）、 S3（Mr＝65000）、S4（Mr＝42000）、 S5（Mr＝25000）、S6（Mr＝21000）、 S7（Mr＝19000）およびS8（Mr＝18000）。 これらのポリペプチドのうち、いずれが指標の
抗原中に含まれているかを決定する方法を発明し
た。抗−RNAポリメラーゼ抗体の特異性は、
酵素の個々のポリペプチドに関し、患者によつて
相違しているが、各種のリユーマチ性疾病につい
て、抗体−ポリペプチド間反応の明確なパターン
が観察された（第１表参照）。
【表】
【表】
確認可能な核からRNAポリメラーゼが得られ
るので、精製酵素源はネズミの腫瘍（モリースヘ
パトーマ3924A）の分離核からのものであるが、
ネズミ酵素は、人間の抗体に対して有効な指標を
与えた。 更に、上記の理由により、ネズミ酵素のみを指
標物質源とするものではない。即ち、人間、哺乳
動物、下位の脊椎動物などの臓器、腫瘍、組織片
培地あるいは細胞線、あるいは各RNAポリメラ
ーゼの遺伝子を含有する遺伝学的化学製品など
を包含するものである。 Ｂ 分析指示薬 試料血清を指標抗原と混合した場合、抗原−抗
体反応の存在が判明しなければならない。この目
的のために、種々の試薬が知られており、本発明
においてはそれらを使用することができる。限定
的意味ではなく、単に説明のために、それらを例
示すれば、フルオレセイン−、酵素−、フエリチ
ン−、あるいは放射性−ラベル抗−人間抗体を含
む複抗体法、黄色ブドウ状球菌
（Staphylococcusaureus）からの125I−または同
様物の放射性ラベル蛋白質Ａ、酵素結合免疫試薬
（enzyme−linkedimmunoassay）、あるいはビオ
チオン化／ストレプトアビジン（biotionized／
streptavidin）あるいはアビジン結合免疫試薬な
どがある。 Ｃ 緩衝液および洗浄液 分析中には反応物を次々に加えるので、成分を
安定化し未反応物を除去するために緩衝液が必要
である。緩衝系については、種々の変法が可能で
あることは明らかである。一つの緩衝系を以下の
実施例に示すが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。 要約すると、RNAポリメラーゼ抗体の試験
は次のようにして行なう。 (1) 患者の血清を変性してないRNAポリメラー
ゼに対して試験する。もし試験結果が陰性で
ある場合には、その人はSLEおよびMCTDの
いずれも持つていない。もし試験結果が陽性の
場合は、患者はSLE、MCTDあるいはRAを有
しているので、第２の試験を行なう。 (2) 第１の試験で抗−RNAポリメラーゼ抗体
を含むことが判明した患者の血清について、各
分離RNAポリメラーゼポリペプチドに対す
る抗体の試験を行なう。S4に対する抗体が検
出された場合はMCTDであることが解る。ま
た、もしS3およびS2および／またはS5（但しS4
ではない）が見出された場合にはSLEを示す。
もし抗−S3抗体のみが存在する場合にはRAで
ある。 RNAポリメラーゼおよびそのポリペプチド
に対する抗体の免疫分析は、次のような有効な検
査法を提供するものである。 (1) 試験法は定性的でありSLE、MCTDおよび
RAの患者に対しては陽性であるが、健康な人
や癌患者に対しては陰性である。従つて、抗−
ANA抗体は癌患者にも見出されるので、この
試験は、ANAおよび抗−ANA抗体の試験よ
りも有利である。 (2) この試験は非常に特異的であり、SLE、
MCTDおよびRAを分別することができる。こ
のことは現行の他の方法では不可能なことであ
る。 (3) この試験は定量的であり、従つて、病気の経
過の監視に有用である。 (4) この試験は非常に高感度である。微量の抗−
RNAポリメラーゼ抗体を検出すことができ
る。従つて、100％のSLE患者およびMCTD患
者の抗体を見出すことができる。 (5) LEおよびANAの試験とは相違し、この試験
の準備および実施は低廉に行なうことができ、
特別の免疫試験部門や試験経験を持たない臨床
試験室においても容易に実施できる。LE細胞
およびANAの試験は、各患者からの種々の血
清稀釈物を顕微鏡下で試験するための高度に訓
練された技術者が必要であるから、費用と時間
がかかる。更に、試験結果の解釈にはしばしば
個人差がある。 実施例 １ 本実施例においては、入手可能な種々の細胞源
の１つからRNAポリメラーゼを分離する方法
を示す。 ［核の分離］ モーリスヘパトーマ3924A（倍増期間：4.4日）
を接種し、28日間経過した肝臓腫瘍を有するネズ
ミを使用した。壊死組織のない腫瘍を0.9％
NaCl／0.25Mシユークロースの溶液に浮遊させ
た。全ての処理は冷却下で行なつた。腫瘍を細か
く切り、0.25mMのスペルミンと3.3mMのMgCl2
を含む12培量の2.0Mシユークロース溶液中でホ
モジナイズした（２ストローク、テフロン−ガラ
スホモジナイザー使用）。得られたホモゲネート
をチーズクロスで過し、40000×ｇで70分間遠
心分離した。得られたペレツトを、1mM MgCl2
および0.3％（ｖ／ｖ）トリトン（Triton）Ｘ−
100を含む0.34Mシユークロースの溶液に再度懸
濁させた（１ml／ｇ原組織）。この懸濁液をドー
ンスホモジナイザーでホモジナイズし、４℃で５
から10分間静置し、20000×ｇで５分間遠心分離
した。この処理により殆ど酵素活性のロスなしに
腫瘍核を回収した。細胞体原形質の汚染および後
続の酵素抽出を阻害する腫瘍核の脂質を減少させ
るために、トリトンＸ−100の洗浄が必要であつ
た。DNAの回収率は肝臓腫瘍１ｇ当り
1.2mgDNAであつた。 ［RNAポリメラーゼの抽出］ 精製した核を50mMトリス（Tris）−HC1（PH：
8.9）、1mM MgCl2、0.1mM EDTA、2mMジチ
オトレイトール（DTT）、50mM KC1、0.5mM
フエニルメチルスルフオニルフルオライドおよび
40％（ｖ／ｖ）グリセリンを含有するアルカリ性
緩衝液に懸濁させた（1ml／ｇ原組織）。懸濁液
をブランソン超音波粉砕機で、15秒の最大出力
で、核が完全に破砕されたことを監視しながら粉
砕した（約90秒間）。グリセリンを含まない超音
波粉砕緩衝液を添加することによつて、懸濁液を
20％（ｖ／ｖ）グリセリンになるよう稀釈した。
次に抽出物を固体（NH4）2SO4（0.42ｇ／ml）に
よつて沈澱させ、45分間攪拌し、80000×ｇで40
分間遠心分離した。更に、50mMトリス−HC1
（PH：7.9）、25％（ｖ／ｖ）グリセリン、5mM
MgCl2、0.1mM EDTA、および0.5mMジチオト
レイトールを含有する緩衝液（緩衝液）に沈澱
を再懸濁させた。この懸濁液を２部の同一の緩衝
液によつて夜通し透析した。この懸濁液を次に
80000×ｇで40分間遠心分離した。得られた粘稠
なペレツトを緩衝液中に再懸濁させ（0.6ml／
ｇ）、30秒間超音波粉砕し上記のようにして再度
遠心分離した。遠心分離で得られた両方の上澄み
を一緒にしてイオン交換クロマトグラフイーにか
けた。この低−塩分抽出法は、蛋白質と共に沈澱
するクロマチンの再抽出が続き、活性のロスなし
に最良の酵素収率を与える。 ［DEAE−セフアデツクスクロマトグラフイー］ 10mMの（NH4）2SO4を含有する緩衝液中で
あらかじめ平衡化したDEAE−セフアデツクス
A25のカラム（1.3−1.6mlゲル／ｇ組織）に抽出
した酵素を供給した。カラムベツドの容積の1.5
倍量の前記10mMの（NH4）2SO4を含有する緩衝
液を用いて洗浄した後、カラムベツト容積の２
倍量の0.1M（NH4）2SO4を含有する緩衝液を用
いて酵素を溶出した。酵素を含有する区分を集め
一緒にして、50mMトリス−HC1（PH7.9）、30％
（ｖ／ｖ）グリセリン、0.1mM EDTEおよび
0.5mMジチオトレイトールを含有する緩衝液
（緩衝液）によつて夜通し透析した。 ［DNA−セルロースクロマトグラフイー］ 集めたフラクシヨンを50mMトリス−HC1
（PH：7.9）および0.5mMジチオトレイトールを含
有する緩衝液を用いて稀釈し、グリセリンの最終
濃度を15％（ｖ／ｖ）に減じた。稀釈サンプルは
DNA−セルロースカラムに供給した。このカラ
ムは、あらかじめ5mMのNaClを含む緩衝液
（グリセリン濃度を15％（ｖ／ｖ）に減じた他は
緩衝液と同一である）によつて平衡化した。同
緩衝液で洗浄した後、カラムベツド容積の1.5倍
量の0.56MのNaClを含有する緩衝液で酵素を
溶出した。次に酵素を含むフラクシヨンを集め
た。 ［ヘパリン−セフアロースクロマトグラフイー］ 集めたフラクシヨンを25％（ｖ／ｖ）グリセリ
ン濃度に調整し、更に適量の3.0M NH4Clを加え
て塩濃度を0.3Mに調整した。0.3M NH4Clを含
む緩衝液中で平衡化したヘパリン−セフアロー
スカラムにサンプルを直ちに供給した。カラムベ
ツド容積の２倍量の0.3M NH4Cl含有緩衝液に
よつて洗浄した後、カラムヘツド容積の３倍量の
1MNH4Clを含む緩衝液によつて酵素を溶出し
た。 ［シユークロース濃度勾配遠心分離］ 集めたフラクシヨンを、0.3M KC1を含む緩衝
液（但しEDTAを含まない）で、真空下で夜
通し透析した。遠心分離の３時間前に、透析用緩
衝液を、５％（ｗ／ｖ）のシユークロースを含む
緩衝液（50mMトリス−HC1（PH：7.9）、5mM
MgCl2、0.3M KC1、0.5mM DTT、および
0.5mMβ−メルカプトエタノール）に変え、透析
した酵素（0.8−1.0ml）を、緩衝液で調製した
10％−30％（ｗ／ｖ）のシユークロース濃度勾配
層（32ml）の上に重ね更に２％（ｗ／ｖ）のシユ
ークロースを含む緩衝液を１ml重ね、デユポン
TV850縦型ローターを使用して、４℃で
49000rpmで４時間遠心分離した。RNAポリメラ
ーゼは、均質な状態で段階16Sから回収され、
その状態で定常的に使用された。 ［ゲル電気泳動（非変性状態）］ 純度を確認するために、RNAポリメラーゼ
を減圧下で50mMトリス−HC1（PH：7.9）、グリ
セリン、5mM MgCl2、0.01mM EDTA、
0.5mM DTTおよび0.15M KC1の溶液により透
析を行ない、電気泳動の準備をした。電気泳動は
50mMトリス−HC1、0.2Mグリシン、10％グリ
セリン、0.1mM DTTおよび1mMチオグリセリ
ンの溶液を用い、線状ポリアクリルアミド（２−
16％）スラブゲル上で、４℃、70Vにおいて６時
間行なつた。精製した酵素は次にゲルから溶出し
た。 実施例 ２ 本実施例においては、RNAポリメラーゼの
サブユニツトの分離について説明する。 実施例１のシユークローズ濃度勾配遠心分離に
よつて調製したRNAポリメラーゼを、ローズ
（Rose）の方法（J.Biol.Chem.，254：10，256−
261（1979））によつて変性し、そして線状（２−
10％）ポリアクリルアミドの勾配ゲル板（８×
7.5×0.3cm）に1.5mg酵素／ゲルの速度で供給し
た。変性した酵素は、レムリ（Laemmli，
Nature，277：680−685（1970））が記載した変性
条件に従つて電気泳動を行なつた。電気泳動は、
125V、20mAmpでトラツキング染料がゲルの端
部へ至るまで行なつた。ゲルは８×0.02cmの片に
スライスし、３mlの2mM EDTA、50mM
NaCl、4M尿素および0.1M DTTを含む10mMト
リス−HC1（PH：7.0）緩衝液中に、25℃で２時間
保持した。スライスは緩衝液Ａ（実施例３参照）
中で洗浄し、ホモジナイズし、６mlの緩衝液Ａ中
で４℃で保持した。その後、ホモジナイズしたス
ライスを120000×ｇで遠心分離してペレツト化
し、各サブユニツトを含む上澄みフラクシヨンを
集めた。 実施例 ３ 本実施例はRNAポリメラーゼおよび抗−
RNAポリメラーゼ抗体コンプレツクスの数あ
る検出法の中の１つを説明する。実施例１におい
てネズミ腫瘍（モーリスヘパトーマ3924A）の分
離核から精製したRNAポリメラーゼを、
25mMリン酸カルシウム（PH：7.5）、150mM
NaClおよび0.01％（ｗ／ｖ）NaN3からなる緩衝
液Ａで、蛋白質の最終濃度が20μｇ／mlになるよ
うに稀釈した。稀釈した酵素（100μl）を400μlの
平底容器（リムーバウエルストリツプス
（Removawell strips）、米国Dynatech
Laboratories，Inc.製）に入れた。湿潤させ、か
つ、緩やかに振盪して、37℃で３時間反応させた
後、溶液を除去し、容器を緩衝液Ａ（４×100μl）
で洗浄した。次に、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液Ａ（150μl）を各容器に入
れ、振盪台の上で室温で１時間反応させた。アル
ブミン含有緩衝液を除去した後、緩衝液Ｂ
［50mMトリス−HCl（PH：7.4）、150mM NaCl、
5mM EDTA、0.05％（ｗ／ｖ）ノニデツト
（nonidet）Ｐ−40、および0.1mMフエニルメチ
ルスルフオニルフルオライド］で1/10に稀釈した
100μlの人またはウサギの血清を添加した。そし
て容器を室温で１時間および４℃で16時間保持し
た。次に、血清を除去し、容器を緩衝液Ｂ（４×
100μl）および緩衝液Ｂ中の125I−ラベル蛋白質Ａ
（Staphy lococcusaureus；30μCi／μｇ）を各容
器へ加えた（100μl／容器；0.01μCi／容器）。室
温で２時間反応させた後、125I−蛋白質Ａの溶液
を除去し100μlの緩衝液Ｃ［50mMトリス−HC1
（PH7.4）、1.0M NaCl、5mM EDTA、0.4％
（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン、0.1mMフエ
ニルメチルスルフオニルフルオライド］で容器を
４回洗浄した。125I−蛋白質Ａの結合を次にガン
マーカウンターで定量した。酵素の存在しない状
態で調製した容器を対照として使用した。酵素な
しで得られた各血清の値を酵素が存在する場合の
値から差引いた（補正cpm）。 実施例 ４ 本実施例は、試料血清とRNAポリメラーゼ
サブユニツトとの反応を説明する。ネズミ肝臓腫
瘍のRNAポリメラーゼを精製した。実施例２
のようにして分離したサブユニツトを、実施例３
における固相放射線免疫分析（RIA）の各抗原と
して用いた。第２表に示す結果は複数の測定値の
平均値である。
るので、精製酵素源はネズミの腫瘍（モリースヘ
パトーマ3924A）の分離核からのものであるが、
ネズミ酵素は、人間の抗体に対して有効な指標を
与えた。 更に、上記の理由により、ネズミ酵素のみを指
標物質源とするものではない。即ち、人間、哺乳
動物、下位の脊椎動物などの臓器、腫瘍、組織片
培地あるいは細胞線、あるいは各RNAポリメラ
ーゼの遺伝子を含有する遺伝学的化学製品など
を包含するものである。 Ｂ 分析指示薬 試料血清を指標抗原と混合した場合、抗原−抗
体反応の存在が判明しなければならない。この目
的のために、種々の試薬が知られており、本発明
においてはそれらを使用することができる。限定
的意味ではなく、単に説明のために、それらを例
示すれば、フルオレセイン−、酵素−、フエリチ
ン−、あるいは放射性−ラベル抗−人間抗体を含
む複抗体法、黄色ブドウ状球菌
（Staphylococcusaureus）からの125I−または同
様物の放射性ラベル蛋白質Ａ、酵素結合免疫試薬
（enzyme−linkedimmunoassay）、あるいはビオ
チオン化／ストレプトアビジン（biotionized／
streptavidin）あるいはアビジン結合免疫試薬な
どがある。 Ｃ 緩衝液および洗浄液 分析中には反応物を次々に加えるので、成分を
安定化し未反応物を除去するために緩衝液が必要
である。緩衝系については、種々の変法が可能で
あることは明らかである。一つの緩衝系を以下の
実施例に示すが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。 要約すると、RNAポリメラーゼ抗体の試験
は次のようにして行なう。 (1) 患者の血清を変性してないRNAポリメラー
ゼに対して試験する。もし試験結果が陰性で
ある場合には、その人はSLEおよびMCTDの
いずれも持つていない。もし試験結果が陽性の
場合は、患者はSLE、MCTDあるいはRAを有
しているので、第２の試験を行なう。 (2) 第１の試験で抗−RNAポリメラーゼ抗体
を含むことが判明した患者の血清について、各
分離RNAポリメラーゼポリペプチドに対す
る抗体の試験を行なう。S4に対する抗体が検
出された場合はMCTDであることが解る。ま
た、もしS3およびS2および／またはS5（但しS4
ではない）が見出された場合にはSLEを示す。
もし抗−S3抗体のみが存在する場合にはRAで
ある。 RNAポリメラーゼおよびそのポリペプチド
に対する抗体の免疫分析は、次のような有効な検
査法を提供するものである。 (1) 試験法は定性的でありSLE、MCTDおよび
RAの患者に対しては陽性であるが、健康な人
や癌患者に対しては陰性である。従つて、抗−
ANA抗体は癌患者にも見出されるので、この
試験は、ANAおよび抗−ANA抗体の試験よ
りも有利である。 (2) この試験は非常に特異的であり、SLE、
MCTDおよびRAを分別することができる。こ
のことは現行の他の方法では不可能なことであ
る。 (3) この試験は定量的であり、従つて、病気の経
過の監視に有用である。 (4) この試験は非常に高感度である。微量の抗−
RNAポリメラーゼ抗体を検出すことができ
る。従つて、100％のSLE患者およびMCTD患
者の抗体を見出すことができる。 (5) LEおよびANAの試験とは相違し、この試験
の準備および実施は低廉に行なうことができ、
特別の免疫試験部門や試験経験を持たない臨床
試験室においても容易に実施できる。LE細胞
およびANAの試験は、各患者からの種々の血
清稀釈物を顕微鏡下で試験するための高度に訓
練された技術者が必要であるから、費用と時間
がかかる。更に、試験結果の解釈にはしばしば
個人差がある。 実施例 １ 本実施例においては、入手可能な種々の細胞源
の１つからRNAポリメラーゼを分離する方法
を示す。 ［核の分離］ モーリスヘパトーマ3924A（倍増期間：4.4日）
を接種し、28日間経過した肝臓腫瘍を有するネズ
ミを使用した。壊死組織のない腫瘍を0.9％
NaCl／0.25Mシユークロースの溶液に浮遊させ
た。全ての処理は冷却下で行なつた。腫瘍を細か
く切り、0.25mMのスペルミンと3.3mMのMgCl2
を含む12培量の2.0Mシユークロース溶液中でホ
モジナイズした（２ストローク、テフロン−ガラ
スホモジナイザー使用）。得られたホモゲネート
をチーズクロスで過し、40000×ｇで70分間遠
心分離した。得られたペレツトを、1mM MgCl2
および0.3％（ｖ／ｖ）トリトン（Triton）Ｘ−
100を含む0.34Mシユークロースの溶液に再度懸
濁させた（１ml／ｇ原組織）。この懸濁液をドー
ンスホモジナイザーでホモジナイズし、４℃で５
から10分間静置し、20000×ｇで５分間遠心分離
した。この処理により殆ど酵素活性のロスなしに
腫瘍核を回収した。細胞体原形質の汚染および後
続の酵素抽出を阻害する腫瘍核の脂質を減少させ
るために、トリトンＸ−100の洗浄が必要であつ
た。DNAの回収率は肝臓腫瘍１ｇ当り
1.2mgDNAであつた。 ［RNAポリメラーゼの抽出］ 精製した核を50mMトリス（Tris）−HC1（PH：
8.9）、1mM MgCl2、0.1mM EDTA、2mMジチ
オトレイトール（DTT）、50mM KC1、0.5mM
フエニルメチルスルフオニルフルオライドおよび
40％（ｖ／ｖ）グリセリンを含有するアルカリ性
緩衝液に懸濁させた（1ml／ｇ原組織）。懸濁液
をブランソン超音波粉砕機で、15秒の最大出力
で、核が完全に破砕されたことを監視しながら粉
砕した（約90秒間）。グリセリンを含まない超音
波粉砕緩衝液を添加することによつて、懸濁液を
20％（ｖ／ｖ）グリセリンになるよう稀釈した。
次に抽出物を固体（NH4）2SO4（0.42ｇ／ml）に
よつて沈澱させ、45分間攪拌し、80000×ｇで40
分間遠心分離した。更に、50mMトリス−HC1
（PH：7.9）、25％（ｖ／ｖ）グリセリン、5mM
MgCl2、0.1mM EDTA、および0.5mMジチオト
レイトールを含有する緩衝液（緩衝液）に沈澱
を再懸濁させた。この懸濁液を２部の同一の緩衝
液によつて夜通し透析した。この懸濁液を次に
80000×ｇで40分間遠心分離した。得られた粘稠
なペレツトを緩衝液中に再懸濁させ（0.6ml／
ｇ）、30秒間超音波粉砕し上記のようにして再度
遠心分離した。遠心分離で得られた両方の上澄み
を一緒にしてイオン交換クロマトグラフイーにか
けた。この低−塩分抽出法は、蛋白質と共に沈澱
するクロマチンの再抽出が続き、活性のロスなし
に最良の酵素収率を与える。 ［DEAE−セフアデツクスクロマトグラフイー］ 10mMの（NH4）2SO4を含有する緩衝液中で
あらかじめ平衡化したDEAE−セフアデツクス
A25のカラム（1.3−1.6mlゲル／ｇ組織）に抽出
した酵素を供給した。カラムベツドの容積の1.5
倍量の前記10mMの（NH4）2SO4を含有する緩衝
液を用いて洗浄した後、カラムベツト容積の２
倍量の0.1M（NH4）2SO4を含有する緩衝液を用
いて酵素を溶出した。酵素を含有する区分を集め
一緒にして、50mMトリス−HC1（PH7.9）、30％
（ｖ／ｖ）グリセリン、0.1mM EDTEおよび
0.5mMジチオトレイトールを含有する緩衝液
（緩衝液）によつて夜通し透析した。 ［DNA−セルロースクロマトグラフイー］ 集めたフラクシヨンを50mMトリス−HC1
（PH：7.9）および0.5mMジチオトレイトールを含
有する緩衝液を用いて稀釈し、グリセリンの最終
濃度を15％（ｖ／ｖ）に減じた。稀釈サンプルは
DNA−セルロースカラムに供給した。このカラ
ムは、あらかじめ5mMのNaClを含む緩衝液
（グリセリン濃度を15％（ｖ／ｖ）に減じた他は
緩衝液と同一である）によつて平衡化した。同
緩衝液で洗浄した後、カラムベツド容積の1.5倍
量の0.56MのNaClを含有する緩衝液で酵素を
溶出した。次に酵素を含むフラクシヨンを集め
た。 ［ヘパリン−セフアロースクロマトグラフイー］ 集めたフラクシヨンを25％（ｖ／ｖ）グリセリ
ン濃度に調整し、更に適量の3.0M NH4Clを加え
て塩濃度を0.3Mに調整した。0.3M NH4Clを含
む緩衝液中で平衡化したヘパリン−セフアロー
スカラムにサンプルを直ちに供給した。カラムベ
ツド容積の２倍量の0.3M NH4Cl含有緩衝液に
よつて洗浄した後、カラムヘツド容積の３倍量の
1MNH4Clを含む緩衝液によつて酵素を溶出し
た。 ［シユークロース濃度勾配遠心分離］ 集めたフラクシヨンを、0.3M KC1を含む緩衝
液（但しEDTAを含まない）で、真空下で夜
通し透析した。遠心分離の３時間前に、透析用緩
衝液を、５％（ｗ／ｖ）のシユークロースを含む
緩衝液（50mMトリス−HC1（PH：7.9）、5mM
MgCl2、0.3M KC1、0.5mM DTT、および
0.5mMβ−メルカプトエタノール）に変え、透析
した酵素（0.8−1.0ml）を、緩衝液で調製した
10％−30％（ｗ／ｖ）のシユークロース濃度勾配
層（32ml）の上に重ね更に２％（ｗ／ｖ）のシユ
ークロースを含む緩衝液を１ml重ね、デユポン
TV850縦型ローターを使用して、４℃で
49000rpmで４時間遠心分離した。RNAポリメラ
ーゼは、均質な状態で段階16Sから回収され、
その状態で定常的に使用された。 ［ゲル電気泳動（非変性状態）］ 純度を確認するために、RNAポリメラーゼ
を減圧下で50mMトリス−HC1（PH：7.9）、グリ
セリン、5mM MgCl2、0.01mM EDTA、
0.5mM DTTおよび0.15M KC1の溶液により透
析を行ない、電気泳動の準備をした。電気泳動は
50mMトリス−HC1、0.2Mグリシン、10％グリ
セリン、0.1mM DTTおよび1mMチオグリセリ
ンの溶液を用い、線状ポリアクリルアミド（２−
16％）スラブゲル上で、４℃、70Vにおいて６時
間行なつた。精製した酵素は次にゲルから溶出し
た。 実施例 ２ 本実施例においては、RNAポリメラーゼの
サブユニツトの分離について説明する。 実施例１のシユークローズ濃度勾配遠心分離に
よつて調製したRNAポリメラーゼを、ローズ
（Rose）の方法（J.Biol.Chem.，254：10，256−
261（1979））によつて変性し、そして線状（２−
10％）ポリアクリルアミドの勾配ゲル板（８×
7.5×0.3cm）に1.5mg酵素／ゲルの速度で供給し
た。変性した酵素は、レムリ（Laemmli，
Nature，277：680−685（1970））が記載した変性
条件に従つて電気泳動を行なつた。電気泳動は、
125V、20mAmpでトラツキング染料がゲルの端
部へ至るまで行なつた。ゲルは８×0.02cmの片に
スライスし、３mlの2mM EDTA、50mM
NaCl、4M尿素および0.1M DTTを含む10mMト
リス−HC1（PH：7.0）緩衝液中に、25℃で２時間
保持した。スライスは緩衝液Ａ（実施例３参照）
中で洗浄し、ホモジナイズし、６mlの緩衝液Ａ中
で４℃で保持した。その後、ホモジナイズしたス
ライスを120000×ｇで遠心分離してペレツト化
し、各サブユニツトを含む上澄みフラクシヨンを
集めた。 実施例 ３ 本実施例はRNAポリメラーゼおよび抗−
RNAポリメラーゼ抗体コンプレツクスの数あ
る検出法の中の１つを説明する。実施例１におい
てネズミ腫瘍（モーリスヘパトーマ3924A）の分
離核から精製したRNAポリメラーゼを、
25mMリン酸カルシウム（PH：7.5）、150mM
NaClおよび0.01％（ｗ／ｖ）NaN3からなる緩衝
液Ａで、蛋白質の最終濃度が20μｇ／mlになるよ
うに稀釈した。稀釈した酵素（100μl）を400μlの
平底容器（リムーバウエルストリツプス
（Removawell strips）、米国Dynatech
Laboratories，Inc.製）に入れた。湿潤させ、か
つ、緩やかに振盪して、37℃で３時間反応させた
後、溶液を除去し、容器を緩衝液Ａ（４×100μl）
で洗浄した。次に、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液Ａ（150μl）を各容器に入
れ、振盪台の上で室温で１時間反応させた。アル
ブミン含有緩衝液を除去した後、緩衝液Ｂ
［50mMトリス−HCl（PH：7.4）、150mM NaCl、
5mM EDTA、0.05％（ｗ／ｖ）ノニデツト
（nonidet）Ｐ−40、および0.1mMフエニルメチ
ルスルフオニルフルオライド］で1/10に稀釈した
100μlの人またはウサギの血清を添加した。そし
て容器を室温で１時間および４℃で16時間保持し
た。次に、血清を除去し、容器を緩衝液Ｂ（４×
100μl）および緩衝液Ｂ中の125I−ラベル蛋白質Ａ
（Staphy lococcusaureus；30μCi／μｇ）を各容
器へ加えた（100μl／容器；0.01μCi／容器）。室
温で２時間反応させた後、125I−蛋白質Ａの溶液
を除去し100μlの緩衝液Ｃ［50mMトリス−HC1
（PH7.4）、1.0M NaCl、5mM EDTA、0.4％
（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン、0.1mMフエ
ニルメチルスルフオニルフルオライド］で容器を
４回洗浄した。125I−蛋白質Ａの結合を次にガン
マーカウンターで定量した。酵素の存在しない状
態で調製した容器を対照として使用した。酵素な
しで得られた各血清の値を酵素が存在する場合の
値から差引いた（補正cpm）。 実施例 ４ 本実施例は、試料血清とRNAポリメラーゼ
サブユニツトとの反応を説明する。ネズミ肝臓腫
瘍のRNAポリメラーゼを精製した。実施例２
のようにして分離したサブユニツトを、実施例３
における固相放射線免疫分析（RIA）の各抗原と
して用いた。第２表に示す結果は複数の測定値の
平均値である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ リユーマチ性疾病の患者の血清を、電気泳動
により精製したRNAポリメラーゼまたはその
サブユニツトからなる核蛋白質抗原と反応させ、
生成する抗原−抗体コンプレツクスを検出するこ
とによつて、血清中のリユーマチ性疾病に関連す
る自家抗体を分別的に同定することからなる検査
方法。 ２ 以下の工程からなる特許請求の範囲第１項に
記載の検査方法。 (a) 固体支持体上に載置した精製した核蛋白質抗
原を、前記抗体を含む血清と共に、充分な時間
反応させ、特定の抗原−抗体コンプレツクスを
生成する； (b) 前記コンプレツクスを分析指示薬と充分な時
間反応させて、抗原と抗体と分析指示薬との三
元コンプレツクスを生成して未反応の血清を除
去した後、前記抗原−抗体コンプレツクスを検
出し； (c) 前記三元コンプレツクス中の抗体の量に比例
するコンプレツクス化した分析指示薬の量を測
定する。 ３ 前記蛋白質の原料は、人間、哺乳動物、非哺
乳類脊椎動物の細胞である特許請求の範囲第１項
または第２項に記載の検査方法。 ４ 前記細胞は、臓器、組織、腫瘍、細胞線、組
織片培地あるいは遺伝学的合成化合物から得たも
のである特許請求の範囲第３項に記載の検査方
法。 ５ 前記分析指示薬は、フルオレセイン−、フエ
リチン−、酵素−あるいは放射性−ラベル抗−人
間抗体、酵素結合イムノソルベント試薬
（ELISA）、放射性ラベルイムノグロブリン結合
蛋白質、あるいはビオチオン化ストレプトアビジ
ンあるいはアビジン結合免疫試薬からなる群から
選択されたものである特許請求の範囲第１項から
第４項のいずれかに記載の検査方法。 ６ 前記試薬は、黄色ブドウ状球菌（Staphylo
−coccus aureus）からの125I−蛋白質Ａである
特許請求の範囲第５項に記載の検査方法。 ７ 前記血清は、SLE患者またはMCTD患者か
ら得たものである特許請求の範囲第１項から第６
項のいずれかに記載の検査方法。 ８ 以下の要素からなるリユーマチ性疾病の分別
的検査用試験キツト、 (a) 前記疾病患者の血清中の抗体と反応して抗体
−抗原コンプレツクスを生成する、RNAポリ
メラーゼまたは少なくとも１つのRNAポリ
メラーゼのサブユニツトからなる精製核蛋白
質抗原、および (b) 前記抗体−抗原コンプレツクス検出用の分析
指示薬。 ９ 前記要素に、抗体−抗原コンプレツクスを生
成するための緩衝液を加えてなる特許請求の範囲
第８項に記載のリユーマチ性疾病の分別的検査用
試験キツト。 １０ 前記分析指示薬は、フルオレセイン−、フ
エリチン−酵素−あるいは放射性−ラベル抗−人
間抗体、酵素結合イムノソルベント試薬
（ELISA）、放射性ラベルイムノグロブリン結合
蛋白質、あるいはビオチオン化ストレプトアビジ
ンあるいはアビジン結合免疫試薬のうちのいずれ
か１つである特許請求の範囲第８項または第９項
に記載のリユーマチ性疾病の分別的検査用試験キ
ツト。 １１ 前記試薬は黄色ブドウ状球菌（Staphylo
−coccus aureus）からの125I−蛋白質Ａである
特許請求の範囲第１０項に記載のリユーマチ性疾
病の分別的検査用試験キツト。
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