JPH07119760B2 - ミモトープを検出または決定する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は抗原のエピトープに相当する。またはエピト
ープに等価の分子トポロジーを有するモノマー分子の連
鎖を検出または決定する方法に関する。

本明細書中に使用される、下記にリストアップした用語
は、以下に述べる意味を有する。

エピトープ（epitope）：抗体分子との相互作用の領域
によって描写される抗原分子の測定の表面。

カタマー（catamer）：小さい分子の正確に定義された
連鎖を有し、かつ小さい分子の正確な数の縮合によって
形成されたポリマー分子。

この用語は、ポリマー分子において小さい分子を結合す
るために異なるタイプの縮合反応が用いられている場合
を含むことに注意すべきである。

用語‘カタマー（catamer）’の前に置かれた数字は、
カタマーが示された数の小さい分子の縮合によって形成
されたことを示し、たとえば、８−カタマーは８箇の小
さい分子からカタマーが形成されていることを意味す
る。

カタマーの例には、既知のペプチド、および既知のオリ
ゴ糖類が含まれる。

モノマー：相互に縮合してカタマーを形成することがで
きる、多数の小分子群。

この小分子の群には、たとえば通常のＬ−アミノ酸の
群、Ｄ−アミノ酸の群、合成アミノ酸の群、ヌクレオチ
ドの群およびペントースおよびヘキソースの群が含まれ
るが、これらに限定されない。

ペプチド：小分子がα−アミノ酸であり、このα−アミ
ノ酸がペプチド結合で相互に連合しているカタマー。

本明細書中においては、アミノ酸がＬ−光学異性体また
はＤ−光学異性体であることを知るべきである。

ミモトープ（mimotope）：少なくともその配置の一つ
に、擬態であるがエピトープのそれと等価の分子トポロ
ジーの表面領域を有するカタマー。

相補性（complementary）：抗体パラトープ（paratop
e）の反応表面と、特定エピトープとの相互組み合わせ
に関する。これら表面は、抗体パラトープと、そのエピ
トープとの結合の間、組み合わされなければならない。
すなわち、パラトープおよびそのエピトープは相補性と
して記述され、更に特徴となる接触表面は相互に相補性
である。

パラトープ（paratope）：特定のエピトープに対して相
補性である抗体の結合部位。

以下は、すでに良く知られていることである： 1.抗原はタンパク質または多糖類のような巨大分子であ
り、必ずとは云えないが、通常ではヒトおよび動物には
異物であり、人体または動物体内に導入されたときに液
素性または細胞性免疫応答、またはこの両者を刺激す
る； 2.抗体が結合する抗原の特定領域は、エピトープとして
知られている； 3.抗原分子上には、一つ以上のエピトープが存在するこ
と； 4.抗原に対する体の全液素性応答は、抗原の種々のエピ
トープに対する抗体を生成することであること； 個々の抗体の夫々は、モノクロナール抗体（monoclonal
antibody）であり、定義により単一のprogenitor B−c
ellの増加および分化によってもたらされる細胞の群か
ら生成される； 5.抗体分子のパラトープは、エピトープと抗体の間の接
触表面である抗体結合部位の分子表面として定義され
る； 6.抗体の与えられたエピトープに対して、夫々パラトー
プにおいて異なる、一つ以上の抗体が生成される； 夫々のパラトープは、相補性エピトープへの特殊性によ
って特徴づけられる；および 7.抗原による攻撃に対応して生成された抗体は、幾分か
は抗原と結合することによって直接的に中和されるこ
と；他の部分はマクロファージ系によって処理されうる
集合体（aggregate）を形成することができること；更
になお他の部分は評価しうる何らの生物学的影響も示す
ことができないこと。

本発明の第１の目的は、抗原のエピトープと同等なモノ
マーの一つ以上の短い連鎖を検出または決定することに
あり、これらの連鎖はエピトープとして同一の抗体と結
合することができる。

これらカタマーは、エピトープのミモトープである。

この情報は、疾病に対する合成カタマーワクチンをデザ
インする上で、およびすべての特定の診断薬および治療
薬をデザインする上ではかり知れないほど価値がある。

相互に縮合してカタマーを形成することができる小分子
の最も有用な群は、α−アミノ酸である。

しかしながら、化学的に矛盾なく選択された他の分子も
使用することができる。たとえばβ−アミノ酸は、カタ
マーの正確に制御された位置に付加的なＣ結合スペーサ
ーを付加できる利点があるので使用することができる。

本発明によれば、対象の抗体の特定パラトープに対して
相補性のあるエピトープのトポロジー的等量であるモノ
マーの連鎖を検出または設定する方法を提供することに
ある。

この方法は下記の工程からなる： （１） 多数のカタマー標体を合成する工程；ここで該
カタマー標本の夫々は、各カタマーにおける一つまたは
それ以上の指定された位置における構成が知られてお
り、残りの位置における構成が所定のモノマーセットの
構成員から無作為に形成されている多数のカタマーから
成り；そして該多数のカタマー標本は、指定された位置
における構成が所定のモノマーセットからの構成員を含
有するように系統的に変えられている標本から成り； （２） 該多数のカタマー標体を、対象とする抗体と接
触せしめる工程； （３） 前記抗体のパラトープに対するミモトープの部
分連鎖を示すために、前記多数のカタマー標本の夫々と
前記抗体との間の結合の存在の有無を検出または決定す
る工程、 （４） 次に、各カタマー中に前記工程（１）における
より更に一つまたはそれ以上構成が知られた指定位置を
有する多数のカタマー標本を更に合成する工程；および （５） 前記工程（２）および（３）を、カタマー標本
におけるすべての位置が明らかになるまで前記工程
（４）で合成された多数のカタマー標本に関して繰り返
す工程。

工程４および５の操作は、各カタマー標本におけるすべ
ての位置が明らかになるまで繰り返される；そしてすべ
ての推論されたミモトープが次いで合成され、この与え
られた抗体に対応するエピトープに対してより良いミモ
トープである対象とする抗体との相対的な反応能力から
決定される。

本発明の方法は、与えられた抗体が、抗体が指向される
エピトープのミモトープであるカタマーと明確に反応す
ることを実現化することにもとづいている。

更に本発明の方法は、免疫学の現代技術によれば抗体
と、そのエピトープとの間の反応を、両者が極めて小量
存在する場合も検出することができる知識にもとづくも
のである。

抗体と、そのエピトープが約1pモルの量で存在する場合
には、結合は検出される。

従って、もしも抗体がそのエピトープに対してミモトー
プであるカタマーとの混合物として存在するならば、そ
の混合物と反応してミモトープと特異的に結合する。

ミモトープの同定は、反応性カタマー標本の指定された
位置における既知のモノマー組成から推論される。

完全なミモトープは、このようにして推定された反応性
成分の幾つかの組合せであると考えられる。

本発明の方法は、抗原の性質について前もっての情報を
必要とせず、特に抗原を形成するモノマーの連鎖と予備
知識を必要としないことが明らかである。

事実、本発明の実施のためには、抗体が指向する抗原源
や本質について知ることを必要としない。

更に本発明は、特定の抗体の生成を刺激するエピトープ
について推論を必要としない。

本発明の方法は、連続したエピトープと同様に非連続的
なミモトープを確認することができる。

本発明の方法の特性の故に、本発明の方法は、一部分
が、または全体が非タンパク質性であり、そのエピトー
プが適当なカタマーによって擬態化されうるいづれの抗
原にも適用できると思われる。

ミモトープは、抗原を形成する同一のモノマーセットの
部分から形成されても良いし、されなくても良い。

好ましくは本発明の方法は、合成された多数のカタマー
標本を、対象とする抗体に対してスクリーニングするこ
とにより行なわれる。

理想的には、抗体は、いづれかの通常の方法によって製
造されたモノクロナール抗体である。

ヒトおよび動物からのポリクロナール抗血清は、モノク
ロナール抗体源が入手できないならば使用することがで
きる。しかしながら、このとき得られたデータの解析
は、観察された反応が一つ以上のモノクロナール抗体か
らの反応であるので、複雑である。

ポリクロナール抗血清を使用する場合には、当該分野で
良く知られた技術、たとえば等電焦点法、HPLGにもとづ
くクロマトグラフィまたは親和カクロマトグラフィを用
いて抗体の多様化を減少させる必要がある。

最近の指摘によれば、モノマーが一連のα−アミノ酸に
由来する場合には長さが約８モノマーであるカタマーに
よってエピトープが擬態化される。

８カタマーがエピトープのミモトープとなる能力は、特
定のモノマーを有するすべての位置に決定的に依存する
ものではない。しかしながら、本発明は８個のモノマー
から形成された連鎖に限定されないことが理解されるべ
きである。

本発明の実施に際して合成される、要求される多数のカ
タマー標本は、既知のカタマー製造法のいづれかによっ
て製造することができる。

モノマーがアミノ酸であるときの好ましい方法は、オー
ストラリア特許明細書第25429/84号に記述された固相技
術を用いる方法であり、ここではカタマーの各混合物は
ポリエチレン支持体上に合成される。

下記は、本発明の態様の一つの詳細な記述である： A.多数のカタマー標本の合成 上述したように、本発明の実施の好ましい方法は、カタ
マーを固体支持体上に合成することである。

本態様においては、多数のカタマーはすべて下記一般式
を有する。

Ｙ−Ｘ−Ｘ−D₂−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕 ここでＸは一連のモノマー中の一つを表わす。

理想的には、各カタマー標本は、このカタマー式におけ
るＸ位のそれぞれが、モノマーセットの各構成員が該カ
タマー標本中にほぼ等モル量にて存在するようにモノマ
ーセットの構成員を表わすカタマーを含むべきである。

各Ｘの位置にモノマーの同じ組みを使用する必要がない
ことに注意すべきである。

上記一般式におけるＹは、カタマーの末端基であり、た
とえば水素原子またはアセチル基であるが、これに限定
されない。

D₁およびD₂は、合成された各カタマー標本において、既
知かつ一定のモノマーによって占められた指定位置を示
す。しかしながら、カタマー標本間において、系統的に
変更することができる。

同一のモノマーの組みを各指定位置に使用する必要がな
いことに注目すべきである。

また、カタマーがアミノ酸から合成された場合には、カ
タマーはその−COOH末端基またはアミン末端基を経て固
体支持体と結合することに注目すべきである。

もしもｉがD₁位置において結合されるモノマーの組みに
おける構成モノマーの数であり、ｊがD₂において係合さ
れるモノマーの組みにおける構成モノマーの数であるな
らば、合計ｉ×ｊ個の相異なるカタマー標体が合成され
る。

本態様においては、支持体として棒（rod）が用いら
れ、この棒にモノマーが結合される。

この棒は次いでモノマーの組みの考慮される各構成モノ
マーを含む反応混合物にさらされる。

この結果、第１のＸ位置にモノマーが結合する。

この操作を３回繰り返すと、カタマーのＺ−Ｘ−Ｘ−Ｘ
−Ｘ−〔固体支持体〕が得られ、ここでＺは考慮される
モノマーの組みに対する適切な保護基である。

モノマーがアミノ酸のときのＺの例には、BOCおよびFmo
c基が含まれる。この方法の実施の、この段階までは、
すべての棒は同一の方法で処理される。

D₁位置における結合には、各棒は保護されたアミノ酸な
どのような単一のモノマーのみを含有する反応混合物で
処理されよう。D₁位置において、ｉ個のモノマーのそれ
ぞれがｊ個の棒に結合されよう。D₂位置における結合に
は、各棒はここでもまた保護されたアミノ酸などのよう
な単一のモノマーのみを含有する反応混合物で処理され
る。D₁位置で特定のモノマーを有するｊ個の棒のそれぞ
れは、D₂位置では異なるモノマーが結合されよう。この
ようにして、モノマーの組みの構成員のあらゆる組み合
わせがｉ×ｊ個の棒に見出されよう。

残りのＸ位置へのモノマーの結合は、固体支持体に接近
したＸ位置における結合と同一である。

複数のカタマー標本の合成の後に、保護基側枝が通常の
技術を用いてカタマー標本から除去され、棒に結合した
カタマーは洗浄される。

データの解析を助けるために、一組み以上の多数のカタ
マー標本を合成することが本発明の好ましい態様である
ことが見出された。

すなわち、上述したような下記一般式を有するカタマー
の合成と同様に、 Ｙ−Ｘ−Ｘ−D₂−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕 下記一般式を有するカタマーのセットが更に合成され
た。

Ｙ−Ｘ−Ｘ−D₂−Ｘ−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕 および Ｙ−Ｘ−D₂−Ｘ−Ｘ−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕 他のカタマー標本のセットの合成のために、他の一般式
が選択されることに注目すべきである。

B.カタマー標本の試験 上記Ａにおけるようにして製造された多数のカタマー標
本を、次いで対象となる特定の抗体と接触させる。

抗体とカタマー標本の成分との間の反応は、次いで、通
常のいづれかの方法、たとえば放射線免疫試験（RIA）
によって、検出される。

しかしながら、抗体−ミモトープ結合の存在の好ましい
検出方法は、読む知られた、酵素が連結した免疫溶媒試
験（immunosorbent assay:ELISA）を使用することであ
る。

夫々の試験の最後に、カタマー標本から抗体を、たとえ
ば8M尿素、0.1％２−メルカプトエタノールおよび0.1％
ナトリウムドデシルサルフェート溶液で洗浄し、次いで
リン酸塩緩衝食塩水で数回洗浄することにより除去する
ことができる。

このようにして、多数のカタマー標本を多くの他の抗体
との試験に使用することができる。

C.データの解析 カタマー標本と抗体との試験において、或る種の棒が抗
体と検出可能な結合を示すことが見出される。

かかる反応性の棒に結合したカタマー標本は、位置D₁お
よびD₂にモノマーセットの構成モノマーの定義された結
合を含む。

このモノマーの結合は、抗体に対して相補性のあるエピ
トープに対するミモトープを形成するカタマーの部分を
形成すると思われる。

更にデータの解析は、種々の方法によって行なうことが
できる。

かかる方法には下記が含まれる： 1.これら反応性モノマーの組み合せおよび入れ替えによ
って、エピトープのための一つ以上のミモトープを含む
カタマーのリストを作成する；このリストにおける各カ
タマーは可能なモミトープと考えられる； 2.モノマーの反応性組み合せのリストから最も好ましい
候補物を取り出し（しかし、これらモノマーが最高の抗
体結合活性を示す必要はない）、更にカタマー標本のセ
ットを合成する。このカタマー標本においては、モノマ
ーの既知の反応性組み合せは一定に保たれ、カタマーの
他の位置におけるモノマーは組織的に変化される；すな
わち上記例において、かかるカタマー標本の好適なセッ
トには下記式のカタマーが含まれる。

Ｙ−Ｘ−D₃−D₂−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕 および Ｙ−Ｘ−Ｘ−D₂−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕 ここでD₁およびD₂はモノマーの反応性組合せを構成し、
D₃およびD₄はモノマーの組みの構成モノマーの夫々が組
織的に変化する、他の指定された位置である；および 3.多数のカタマー標本のセットの一つ以上からの結果を
組み合せ、解読してモノマーの単一連鎖、または対象と
するエピトープを模擬する、かかる連鎖の極めて少数を
得る； これは、上述した態様を用いて、相互に隣接する場合の
モノマーの反応性組合せ、一つの位置によって分離され
た、モノマーの反応性組合せ、および最後に二つの位置
によって分離されたモノマーの反応性組合せをすべて知
ることができるからである；これらのデータは容易に解
説することができ、ミモトープの連鎖を得る；この方法
は、多数のカタマー標識の試験に用いた抗体がモノクロ
ナール抗体の場合に最も有利である。

D.選択されたミモトープの合成 選択されたミモトープは、オーストラリア特許明細書第
25429/84号に記載された方法と類似の方法を用いて合成
することができる。選択されたカタマーが合成された後
に、これらカタマーは対象とする抗体と反応せしめられ
る。

抗体と最も強く結合しているカタマーを選択することは
単純である。このカタマーがエピトープの最良のミモト
ープであることの最終的チエックとして、カタマーの連
鎖がオーストラリア特許明細書第25429/84号に記載され
たような置換ネット（net）の母体連鎖として用いられ
る。

下記に示す実施例1,2および３において、限定されたモ
ノマーセットは通常のＬ−α−アミノ酸の組みである。

このモノマーのセットは、指定された位置および任意の
位置（上述した一般式において用いたようなD₁,D₂およ
びＸ位置）の両方のために用いられる。

更に、これら実施例において、カタマーの末端基（Ｙ
基）はアセチル基である。

実施例１ 下記一般式を有する多数の８−カタマー標体が合成され
た。

アセチル−NH−Ｘ−Ｘ−D₂−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 ここでＸは、20の通常のα−アミノ酸の群の一員であ
り、この結果、この群の各員はカタマー標本においてＸ
位置にほぼ等モル量存在する；指示された位置D₁および
D₂も共に同一のモノマーの群の一員であり；−NH−はカ
タマーの末端アミン基を表わす。

８−カタマー標本は一般的にオーストラリア特許明細書
第25429/84号に記載されているように、合成中にα−ア
ミノ酸を保護するためにBOC基を用いて、固体ポリマー
のピンまたは棒上に合成された。

通常のα−アミノ酸の群の各員は、Ｘ位置に下記のよう
にして結合された： 1.アミノ酸の混合物を120mlのジメチルホルムアミド（D
MF）に溶解した。この混合物は下記から成る。

BOC−Ｌ−アラニン 32 mg BOC−メトキシベンジル−Ｌ−システィン 100 mg BOC−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸 90 mg BOC−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸 96 mg BOC−Ｌ−フェニルアラニン 61 mg BOC−Ｌ−グリシン 27 mg BOC−トシル−Ｌ−ヒスチジン 142 mg BOC−Ｌ−イソロイシン・1/2H₂O 51 mg BOC−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジン 124 mg BOC−Ｌ−ロイシン・H₂O 55 mg BOC−Ｌ−メチオニン 54 mg BOC−Ｌ−アスパラギン 47 mg BOC−Ｌ−プロリン 42 mg BOC−Ｌ−グルダミン 53 mg BOC−トシル−Ｌ−アスパラギン・H₂O 167 mg BOC−ベンジル−Ｌ−セリン 76 mg BOC−ベンジル−Ｌ−スレオニン 83 mg BOC−Ｌ−バリン 42 mg BOC−Ｌ−トリプトファン 78 mg BOC−ベンジル−Ｌ−チロシン 116 mg 2.1310mgの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）
を34mlのDMFに溶解した溶液を作った。

3.N,N′−ジクロヘキシルカルボジイミド（DCC）1150mg
を34mlのDMFに溶解した溶液を作った。

4.使用前に、HOBTの溶液をアミノ酸の溶液に加え、混合
した。次いで、DDCの溶液を加え混合した。次いで、す
でに固体支持体上のカタマーまたは結合分子を、得られ
た混合物と反応させた。

個々のＬ−アミノ酸を、オーストラリア特許明細書第25
429/84号記載の方法に従ってD₁およびD₂位置に結合させ
た。

この結果、400のカタマー標本の合成において、20の通
常のアミノ酸をD₁およびD₂位置に結合させることができ
た。

多数の８−カタマー標本をモノクロナール抗体に対して
BLISAによって試験をした。このモノクロナール抗体
は、当該分野において良く知られている技術を用いて、
口蹄疫ビールス（Foot−and−Mouth Disease Virus;FMD
V）亜型A₁₀に対して製造された。

BLISA試験の実施においては、支持体に支持されたペプ
チドを、１％オバルブミン/1％牛血清アルブミン/0.1％
トウィーン（Tween）20のリン酸塩緩衝食塩水（PBS）か
ら成るプリコート溶液中で25℃で１時間保持して、抗体
の非特定的な吸収を塞いだ。

次いで、４℃で１夜、適当に希釈したプリコート溶液中
でモノクロナール抗体を保持した後に、0.05％トウィー
ン（Tween）20/PBS溶液で３回洗浄した。

25℃で１時間、ワサビ（horseradish）ペルオキシダー
ゼに配合され、プリコート溶液で希釈されたgood anti
−mouse IgGと反応後に、PBS/トウィーンで十分に洗浄
して過剰の配合体を除去した。

抗体の存在は、新らたに調整した酵素基質溶液（ｏ−フ
エニレンジアミン40mgおよび18μの“120vol." 過酸化水素のリン酸塩／クエン酸塩緩衝液に100ml溶
液、pH5.0）との45分間の反応および450nmにおいて検出
された発色によって検出した。

第１図は、この抗体による８−カタマー標本の試験結果
を示す。第１図において、20の線から成る各群は、ELIS
A試験において、450nmで測定したときに発現した色の吸
光度の単位における応答を表わす。

20の線の群における夫々の線は、各群の直下に一つの文
字記号で与えられた共通のアミノ酸をD₁位置に有する。

20の線の各群の夫々の線は、D₂位置に異なるアミノ酸を
表わす−これらは単一文字記号のアルファベット順であ
る。これらの結果を第１表にまとめた（第１表および残
りの実施例を通して、アミノ酸への単一文字記号が用い
られる）。

第１表から、抗体は多数の８−カタマー標本と強く反応
することが明らかである。反応の強さの順に、指示され
た位置（−D₂−D₁−）が−Ｍ−Ｈ−，−Ｍ−Ｋ−，−Ｋ
−Ｋ−，−Ｋ−Ｈ−，−Ｑ−Ｈ−および−Ｈ−Ｈ−であ
る８−カタマー標本が含まれる。

更に二種の多数の８−カタマー標本が合成された。これ
らは下記の式を有する。

アセチル−NH−Ｘ−D₃−Ｍ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 および アセチル−NH−Ｘ−Ｘ−Ｍ−Ｋ−D₄−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 ここでＭはメチオニン残基を示し、Ｋはリジン残基を示
し、D₃およびD₄は、これら一連の合成のために新らたに
指示された位置を示す。式中で用いられた他の用語はす
でに用いられたとおりである。

これら８−カタマー標本は、FMDVA₁₀に対するモノクロ
ナール抗体に対して試験された。

第2A図および第2B図は、第１図に示した結果を得るのに
用いたモノクロナール抗体によるELISA試験の結果を示
す。第2A図は、下記一般式の８−カタマー標本を表わ
す。

アセチル−NH−Ｘ−D₃−Ｍ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 第2B図は下記一般式の８−カタマー標本を示す。

アセチル−NH−Ｘ−Ｘ−Ｍ−Ｋ−D₄−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 第2A図および第2B図の両方において、D₃またはD₄位置に
おけるアミノ酸を、450nmで測定したときの発色の吸光
度を表わす各線の下に示した。

この結果を第２表にまとめた。抗体結合活性を、1.1よ
りも大きな値を与えるすべての８−カタマー標本につい
て、指定されたアミノ酸対Ｍ−Ｋを含む８−カタマー標
本について示した。また、逆のＫ−Ｍについて見出され
た値も示した。

モノクロナール抗体と最も反応性に富む８−カタマー標
本は、指定された位置に下記の連鎖を有することが明ら
かである。第2A図から、−Ｈ−Ｍ−Ｋ−，−Ｗ−Ｍ−Ｋ
−および−Ｑ−Ｍ−Ｋ−。

第2B図から、−Ｍ−Ｋ−Ｈ−，−Ｍ−Ｋ−Ｑ−および−
Ｍ−Ｋ−Ｗ−。

Ｍ−Ｋで指示された対のいずれかの側にヒスチジンの加
入によって、最大の抗体結合活性が得られた。

しかしながら、アミノ末端側のヒスチジンは、トリプト
ファンよりも著るしく良好ではなく、指定された連鎖Ｗ
−Ｍ−Ｋ−Ｈが更に評価するために選定された。

指定され、個々の好ましい延長とＭ−Ｋ対との組み合わ
せが最適であると予想される連鎖Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈを先行
させたときの効果を試験した。

母体連鎖アセチル−NH−Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ−Ｘ−
Ｘ−S_S〔固体支持体〕にもとづくカタマー連鎖を合成
し、四つの指定された位置の各々を19のすべてのアミノ
酸で一度に一つづつ置換した。

このカタマー標本の組みのモノクロナール抗体（MAb）
との結合活性の試験から、Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈが好ましい連
鎖延長であることが示された（得たれたE₄₅₀は;AcX−Ｗ
−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−S_S＝0.69,Ac−Ｘ−Ｑ−Ｍ
−Ｋ−Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−S_S＝1.47,およびAc−Ｘ−Ｗ−
Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−S_S＝1.11,試験バックグラウ
ンド0.2であった）。

指定された連鎖Ｍ−Ｋ−Ｈのアミノ末端側において、Ｍ
−Ｋ対について決定されたように、トリプトファンより
もグルタミンが優れていることは、個々に決定された最
適性の相互依存性を示している。

次に、下記一般式の８−カタマー標本を合成した。

アセチル−NH−D₅−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 および アセチル−NH−Ｘ−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−D₆−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 最高の抵抗結合決性を有する標本は、D₅＝トリプトファ
ンおよびD₆＝セリンの場合であり、このことからＷ−Ｑ
−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｓが最適の連鎖であることが示唆され
る。

この連鎖のいづれかの側にアミノ酸を更に指定すること
による抗体結合活性の著るしい改善は達成されなかっ
た。

この連鎖のすべての単一アミノ酸置換からなり、ヘキサ
ペプチドとして合成したペプチドのセットの評価から、
Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｓが最適のヘキサペプチドに近い
ことが確認された。

ペプチドのアルギニンをグリシンで置換して連鎖Ｗ−Ｑ
−Ｍ−Ｇ−Ｈ−Ｓを与えるときに、いくらかの抗体結合
活性の増加が示された。

関連するペプチドの決定された群の試験MAbに対する抗
体結合反応の特異性を確認するために、ペプチド数に対
する試験MAbの滴定数を、マッコウクジラ・ミオグロビ
ンまたはヘパチティス（hepatitis）Ａに対する試験MAb
のそれと比較した（第３表）。

抗体結合反応の特異性は、これらペプチドの連鎖を決定
するために用いた抗体のMAb試験から明らかである。

各MAbについての抗体滴定数はELISAにより決定され、バ
ックグラウンド試験の３倍の吸光を与える腹水の相互希
釈に相当する。

数値は、希釈した夫々の腹水と関係のないペプチドコン
トロール（Ac−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｉ−S_SおよびAc−
Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｌ−S_S）との反応によって決定さ
れた非特定的吸収により補正した。

モノクロナール抗体試験は、下記のようであった： 本書中に記載したような試験MAb,抗−FMDV,タイプA
₁₀（全ビールスに対する滴定数1.3×10⁶）； 抗ヘプチティスA,反応の位置は未知（ヘパチティスＡビ
ールスに対する滴定数10⁶）；および抗ミオグロビン
（マッコウクジラ），反応位置は未知（マッコウクジラ
・ミオグロビンに対する滴定数10⁶）。

実施例２ 実施例２は、本発明をポリクロナール抗体に適用した場
合を述べる。

実施例１に記述したように、下記一般式を有する多数の
８−カタマーを更に合成した。

アセチル−NH−Ｘ−Ｘ−D₂−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 これらカタマーを、合成ペプチドＣ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−
Ｓ−Ｉ−Ａ−Ｋに対して得られた抗体に対して試験し
た。

この合成ペプチドは、メリーフィールド（Merrifield）
の固相ペプチド合成の通常の技術を用いて合成した。

このペプチドをシスティン残基のスルフヒドリル基を経
てKeyhole Limpet Haemocyaminと結合させた。

この結合したペプチドをフロインド（Freund）の不完全
補助薬（incomplete adjuvant）で組織化し、兎に筋肉
内注射した。

注射後40日を経て兎の血液から抗血清を得た。

多数の８−カタマー標本の抗体によるELISA試験の結果
を、第１図と同様な方法で第３図に示した。

第３図から、Ｅ（グルタミン酸）をD₁位置に有する、す
べての８−カタマー標本は、抗体と顕著に反応すること
が明らかである。抗体と顕著に反応する他の組み合わせ
には、減少する順に、−Ｄ−Ｉ−，−Ｇ−Ｄ−，−Ｉ−
Ｇ−および−Ｄ−Ｖ−が含まれる。

上記実施例１で述べたようにして、下記の式を有する多
数の８−カタマー標本を更に合成した。

アセチル−NH−Ｘ−D₃−Ｄ−Ｉ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 および アセチル−NH−Ｘ−Ｘ−Ｄ−Ｉ−D₄−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 ここでＤはアスパラギン酸であり、Ｉはイソロイシンで
ある。

抗体との試験結果を、第２図と同様な方法で第４図に示
した。第4A図は下記一般式の８−カタマー標本を示し、 アセチル−NH−Ｘ−D₃−Ｄ−Ｉ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 第4B図は下記一般式の８−カタマー標本を示す。

アセチル−NH−Ｘ−Ｘ−Ｄ−Ｉ−D₄−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 第４図から抗体と反応する８−カタマー標本は、指定さ
れた位置に下記の連鎖を含むことを示す。

−Ｇ−Ｄ−Ｉ−，−Ａ−Ｄ−Ｉ−，−Ｐ−Ｄ−Ｉ−，−
Ｄ−Ｉ−Ｄ−，−Ｄ−Ｉ−Ｍ−および−Ｄ−Ｉ−Ｔ−。

第4A図と第4B図との比較から、−Ｄ−Ｉ−対の直線の位
置は、−Ｄ−Ｉ−対の直後の位置よりも、はるかに少な
い範囲のアミノ酸が許されることが明白である。

下記母体連鎖にもとづき、カタマー標本における四つの
指定された位置が夫々、一度に一つづつ、すべて19の他
のアミノ酸で置換された８−カタマー標本を合成した。

アセチル−NH−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｘ−Ｘ−〔固
体支持体〕 この標本の組みの、試験抗体との結合活性についての試
験は、この抗体との反応能力を保持するためにはグリシ
ン残基はアラニンによってのみ置換されること； アミノ末端アスパラギン酸は他のアミノ酸で置換され得
ないこと；イソロイシンはバリン，ロイシンまたはスレ
オニンまたは結合活性は減少するが約10の他のアミノ酸
で置換できること；およびカルボキシル末端アスパラギ
ン酸は事実上いづれのアミノ酸によっても置換すること
ができ、この位置におけるセリンは最も強い結合を与え
ることを示している。

また試験結果は、指定された連鎖Ｇ−Ｄ−Ｉ−Ｓが鎖延
長のためには好ましいことを示している。

上記のような指定連鎖の延長は、アミノ末端へのトリプ
トファンおよびカルボキシル末端へのヒスチジンの加入
が好ましいことを示している。

しかしながら、いづれの鎖延長も抗体結合活性において
は顕著な増加を示さなかった。

好ましい指定された連鎖Ｗ−Ｇ−Ｄ−Ｉ−Ｓ−Ｈを更に
延長することは、更に連鎖を延長することに、ほとんど
利点がないことを示した。

この特定の抗体に対して決定されたミモトープ、すなわ
ちＷ−Ｇ−Ｄ−Ｉ−Ｓ−Ｈは、抗体を導入するために使
用したペプチド、すなわちＣ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｉ
−Ａ−Ｋに対して一時的な類似性を有するのであること
を注目すべきである。

しかしながら、免疫学的連鎖Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｉに
もとづく置換ネットにおける抗体の試験は、連鎖Ｇ−Ｄ
−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｉ（E₄₅₀値は夫々0.45および0.16）を導
入するよりも連鎖Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｉが著るしく好まし
いことを示した。

決定されたミモトープと抗体に結合しているペプチドと
の間には類似性がある。このことは本発明の方法を広範
囲に適用できる強力な証拠である。

実施例３ この実施例３は多数のカタマー標本の鎖長を８−カタマ
ーよりも短くすることができることを示す。

下記一般式を有する４−カタマー標本を合成した。

アセチル−NH−Ｘ−D₂−D₁−Ｘ−〔固体支持体〕 ここで略記号は実施例１で用いたものと同様であり、合
成方法も実施例１で用いた方法と同一である。

この４−カタマーを当該分野において良く知られている
技術を用いてマッコウクジラ・ミオグロビンに対して生
じたモノクロナール抗体に対して試験した。

この抗体による多数の４−カタマー標本のELISA試験の
結果を、第１図と同様な方法で第５図に示す。

第５図から、下記の一般式を有するカタマー標本のみが アセチル−NH−Ｘ−Ｌ−Ａ−Ｘ−〔固体支持体〕 モノクロナール抗体と反応することができることが明ら
かである。

前記実施例１に述べたようにして、更に下記一般式を有
する多数の４−カタマー標本を合成した。

アセチル−NH−D₃−Ｌ−Ａ−Ｘ−〔固体支持体〕 および アセチル−NH−Ｘ−Ｌ−Ａ−D₄−〔固体支持体〕 第４表にモノクロナール抗体によるELISA系において試
験をした最も活性的なカタマー標本をまとめた。

下記母体連鎖に基づくカタマー標本を合成して、実施例
２に述べたような置換ネットを形成した。

アセチル−NH−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−〔固体支持体〕 これらのペプチドのモノクロナール抗体によるELISA試
験の結果を第６図に示す。

第６図における20の線の各群は、母体レスポンス（E₄₅₀
＝2.62,バックグラウンド0.25）の平均に対して比較し
たレスポンス％を表わす。

第６図において、20の線の群の各員は、他のアミノ酸に
よって置換された、下に示したアミノ酸を有する。

線の順序はアミノ酸の単一文字記号のアルファベット順
である。

20の線の各群における太い線は、母体連鎖Ｐ−Ｌ−Ａ−
Ｑを示す。この第６図から、母体連鎖の少なくとも半分
の活性を有するこのモノクロナール抗体に結合しうるカ
タマー標本のためには、バリン，イソロイシン，ロイシ
ン，アラニンまたはセリンによってプロリンを置換でき
ること；ロイシンをフエニルアラニンのみで置換できる
こと；アラニンを他のいづれかのアミン酸で実質的に置
換できること；およびグルタミン残基はアスパラギンに
よってのみ置換可能であることが明らかである。

マッコウクジラ・ミオグロビン連鎖のすべての重複する
４−カタマーのセットを、実施例１において指定された
位置について述べた方法を用いて合成した。これらのカ
タマーをELISA試験によりモノクロナール抗体と反応さ
せた。結果を第７図に示す。各線はELISA試験において4
50nmで読んだ発色を示す。

各線に番号を示した。この結果、特定のカタマーのアミ
ノ末端における残基はマッコウクジラ・ミオグロビン連
鎖におけると同一数を有する。

第７図から、モノクロナール抗体と反応する唯一の４−
カタマーは、マッコウクジラ連鎖の88〜91残基から成る
ことが明白である。この連鎖はＰ−Ｌ−Ａ−Ｑである。
明らかに、モノクロナール抗体はマッコウクジラ・ミオ
グロビンの特定の決定因子を認めている。

下記一般式を有する一連の５−カタマーを合成して指定
された連鎖に対する最上の鎖延長を決定した。

アセチル−NH−D₅−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−〔固体支持体〕 および アセチル−NH−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−D₆−〔固体支持体〕 最上の結合性標本は、 セチル−NH−Ｋ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−〔固体支持体〕 アセチル−NH−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−Ｙ−〔固体支持体〕 であった。

連鎖Ｋ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑは残基87〜91におけるマッコウ
クジラ・ミオグロビンの連鎖と同類であることに注目す
べきである。更にこの実施例は本発明の技術が適用可能
であることを示している。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】対象とする抗体の特定のパラトープと相補
   性であるエピトープのトポロジー的同等物であるモノマ
   ーの連鎖を検出または決定する方法であって、下記工
   程： （１） 多数のカタマー標体を合成する工程；ここで該
   カタマー標本の夫々は、各カタマーにおける一つまたは
   それ以上の指定された位置における構成が知られてお
   り、残りの位置における構成が所定のモノマーセットの
   構成員から無作為に形成されている多数のカタマーから
   成り；そして該多数のカタマー標本は、指定された位置
   における構成が所定のモノマーセットからの構成員を含
   有するように系統的に変えられている標本から成り； （２） 該多数のカタマー標体を、対象とする抗体と接
   触せしめる工程；そして （３） 前記抗体のパラトープに対するミモトープの部
   分連鎖を示すために、前記多数のカタマー標本の夫々と
   前記抗体との間の結合の存在の有無を検出または決定す
   る工程、 （４） 次に、各カタマー中に前記工程（１）における
   より更に一つまたはそれ以上構成が知られた指定位置を
   有する多数のカタマー標本を更に合成する工程；および （５） 前記工程（２）および（３）を、カタマー標本
   におけるすべての位置が明らかになるまで前記工程
   （４）で合成された多数のカタマー標本に関して繰り返
   す工程、 からなる方法。
2. 【請求項２】前記多数のカタマー標本の夫々が、一連の
   α−アミノ酸から形成される請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. 【請求項３】前記多数のカタマー標本の夫々が、多数の
   ４〜８−カタマーからなる請求の範囲第２項記載の方
   法。
4. 【請求項４】前記多数のカタマー標本の夫々が固体支持
   体上に合成され、下記一般式： Ｙ−Ｘ−Ｘ−D₂−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持
   体〕、 Ｙ−Ｘ−Ｘ−D₂−Ｘ−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕
   または Ｙ−Ｘ−D₂−Ｘ−Ｘ−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持
   体〕、 （ここでＸはα−アミノ酸セットの構成員であり、かか
   る多数のカタマーは、該アミノ酸セットの各構成員がＸ
   位置でほぼ等モル量にて存在しそしてD₂およびD₁はα−
   アミノ酸セットの指定された構成員であり、Ｙはカタマ
   ーの末端基である）を有する請求の範囲第１項記載の方
   法。
5. 【請求項５】前記多数のカタマーの夫々が下記一般式： アセチル−NH−Ｘ−Ｘ−D₂−D₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固
   体支持体〕、 を有する請求の範囲第４項記載の方法。