JP2640438B2 - 口蹄疫ビールスの抗原活性を有するカタマー - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は口蹄疫ビールスＡ₁₀亜型
の抗原エピトープまたはその分子トポロジー的同等物で
ある６−カタマーに関する。

【０００２】

【従来の技術】本明細書中に使用される下記にリストア
ップした用語は、以下に述べる意味を有する。 エピトープ：抗体分子と相互作用する領域によって描写
される抗原分子の特定の表面。 カタマー (catamer)：正確に定義された連鎖を有し、か
つ小さい分子の正確な数の縮合によって形成されたポリ
マー分子。この用語は、ポリマー分子において小さい分
子を結合するために異なる種類の縮合反応が用いられて
いる場合を含むことに注意すべきである。

【０００３】用語“カタマー" の前に置かれた数字は、
そのカタマーが示された数の小さい分子の縮合によって
形成されたことを示し、たとえば、８−カタマーは８個
の小さい分子からそのカタマーが形成されていることを
意味する。カタマーの例には、既知のペプチド、および
既知のオリゴ糖類が含まれる。 モノマー：相互に縮合してカタマーを形成することがで
きる多数の小分子の群。

【０００４】この小分子の群には、たとえば通常のＬ−
アミノ酸の群、Ｄ−アミノ酸の群、合成アミノ酸の群、
ヌクレオチドの群およびペントースおよびヘキソースの
群が含まれるが、それらに限定されない。 ペプチド：小分子がα−アミノ酸であり、このα−アミ
ノ酸がペプチド結合で相互に連合しているカタマー。本
明細書中においては、アミノ酸がＬ−光学異性体または
Ｄ−光学異性体であることを知るべきである。 ミモトープ(mimotope)：少なくともその配置の一つに、
擬態であるがエピトープのそれと等価の分子トポロジー
の表面領域を有するカタマー。 相補性：抗体パラトープ(paratope)の反応表面と、その
特定エピトープとの相互組み合わせに関する。これら表
面は、抗体パラトープと、そのエピトープとの結合の
間、組み合わされなければならない。すなわち、パラト
ープおよびそのエピトープは相補性として記述され、更
に特徴となる接触表面は相互に相補性である。 パラトープ(paratope)：特定のエピトープに対して相補
性である抗体の結合部位。

【０００５】以下は、すでに良く知られていることであ
る： １．抗原はタンパク質または多糖類のような巨大分子で
あり、必ずとは云えないが、通常ではヒトおよび動物に
とって異物であり、人体または動物体内に導入された場
合に液素性または細胞性免疫応答、またはその両者を刺
激する； ２．抗体が結合する抗原の特定領域はエピトープとして
知られている； ３．抗原分子上には一つ以上のエピトープが存在する； ４．抗原に対する身体の全体的液素性応答は、抗原の種
々のエピトープに対する抗体を生成することである；個
々の抗体の夫々はモノクロナール抗体であり、定義によ
れば単一の前駆体Ｂ−細胞の増殖および分化によっても
たらされる細胞群から生成される； ５．抗体分子のパラトープは、エピトープと抗体の間の
接触表面である抗体結合部位の分子表面として定義され
る； ６．抗原の所定のエピトープに対して、夫々パラトープ
が異なる一つ以上の抗体が生成される；夫々のパラトー
プは、相補性エピトープへの特異性によって特徴づけら
れる；および ７．抗原による攻撃に対応して生成された抗体は、幾分
かは抗原と結合することによって直接的に中和されるこ
と；他の部分はマクロファージ系によって処理されうる
集合体を形成できること；更になお他の部分は評価しう
る何らの生物学的影響も示すことができないこと。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、口蹄疫
ビールスＡ_１０亜型の抗原エピトープまたはその分子ト
ポロジー的同等物であって、下記アミノ酸連鎖： Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ−Ｘ、 Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ、 Ｘ−Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ、 Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｓ、 Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｇ−Ｈ−Ｓ、および それらの免疫学的に活性な同等物、 （ここでＷ、Ｍ、Ｋ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＧはアミノ
酸の一文字記号を表わし、Ｘはいずれかのアミノ酸を示
す）からなる群から選択される連鎖を含む６−カタマー
を提供することである。

【０００７】ここで「免疫学的に活性な同等物」とは、
アミノ酸連鎖にアセチル保護基を有するもの、および支
持体に支持されたものを意味する。前記した口蹄疫ビー
ルスＡ₁₀亜型抗原のエピトープと同等な短いカタマー連
鎖は、エピトープが結合すると同じ抗体と結合すること
ができる。これらカタマーは、エピトープのミモトープ
である。この情報は、口蹄疫ビールスＡ₁₀亜型に対する
合成カタマーワクチンをデザインする上で、およびすべ
ての特定の診断薬および治療薬をデザインする上ではか
り知れないほど価値がある。

【０００８】相互に縮合してカタマーを形成することが
できる小分子の最も有用な群はα−アミノ酸である。し
かしながら、化学的に矛盾なく選択された他の分子も使
用することができる。たとえばβ−アミノ酸は、カタマ
ーの正確に制御された位置に付加的なＣ−結合スペーサ
ーを付加できる利点があるので使用することができる。

【０００９】本発明によれば、対象の抗体の特定パラト
ープに対して相補性のあるエピトープのトポロジー的同
等物であるモノマーの連鎖が提供される。これらのカタ
マーは下記工程により合成できる。 （１）多数のカタマー標本を合成する工程；ここで該カ
タマー標本の夫々は、各カタマーにおける一つまたはそ
れ以上の指定された位置における構成が知られており、
その他の位置における構成が、限定されたモノマーセッ
トの構成員から無作為に形成されている多数のカタマー
から成り；そして該多数のカタマー標本は、指定された
位置における構成が限定されたモノマーセットからの構
成員を含有するように系統的に変えられている標本から
成り； （２）該多数のカタマー標本を、対象とする抗体と接触
せしめる工程； （３）前記抗体のパラトープに対するミモトープの部分
連鎖を示すために、前記多数のカタマー標本の夫々と前
記抗体との間の結合の存在の有無を検出または決定する
工程、 （４）次に、各カタマー中に前記工程（１）におけるよ
り更に一つまたはそれ以上構成が知られた指定位置を有
する多数のカタマー標本を更に合成する工程；および （５）前記工程（２）および（３）を、前記工程（４）
で合成された多数のカタマー標本に関して繰り返す工
程。

【００１０】工程（４）および（５）の操作は、各カタ
マー標本におけるすべての位置が明らかになるまで繰り
返される；そしてすべての推論されたミモトープが次い
で合成され、対象とする抗体との相対的な反応能力か
ら、どれがこの所定の抗体に対応するエピトープのより
良いミモトープであるか決定される。本発明は、抗体
が、該抗体に対応するエピトープのミモトープであるカ
タマーと特異的に反応することにもとづいている。

【００１１】更に本発明は、免疫学の現代技術によれば
抗体とそのエピトープとの間の反応を、両者が極めて小
量存在する場合も検出することができる知識にもとづく
ものである。抗体とそのエピトープが、約１ｐモルの量
で存在する場合には、結合は検出される。従って、もし
抗体がそのエピトープに対するミモトープであるカタマ
ーとの混合物として存在するならば、その混合物と反応
してミモトープと特異的に結合することが見られよう。

【００１２】最近の指摘によれば、モノマーが一連のα
−アミノ酸に由来する場合には長さが約８モノマーであ
るカタマーによってエピトープが擬態化される。８カタ
マーがエピトープのミモトープとなる能力は、特定のモ
ノマーを有するすべての位置に決定的に依存するもので
はない。しかしながら、本発明は８個のモノマーから形
成された連鎖に限定されないことが理解されるべきであ
る。

【００１３】本発明の実施に際して合成される、要求さ
れる多数のカタマー標本は、既知のカタマー製造法のい
づれかによって製造することができる。モノマーがアミ
ノ酸であるときの好ましい方法は、オーストラリア特許
明細書第25429/84号に記述された固相技術を用いる方法
であり、ここではカタマーの各混合物はポリエチレン支
持体上に合成される。

【００１４】このようにして製造された多数のカタマー
標本を、次いで対象となる特定の抗体と接触させる。抗
体とカタマー標本の成分との間の反応は、次いで通常の
いづれかの方法、たとえば放射線免疫試験（ＲＩＡ）に
よって検出される。しかしながら、抗体−ミモトープ結
合の存在を検出する好ましい方法は、良く知られた酵素
連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用す
ることである。

【００１５】夫々の試験の最後に、カタマー標本から抗
体を、たとえば８Ｍ尿素、0.１％２−メルカプトエタノ
ールおよび0.１％ナトリウムドデシルサルフェート溶液
で洗浄し、次いでリン酸塩緩衝食塩水で数回洗浄するこ
とにより除去することができる。このようにして、多数
のカタマー標本を多くの他の抗体との試験に使用するこ
とができる。

【００１６】カタマー標本と抗体との試験において、或
る種の棒が抗体と検出可能な結合を示すことが見出され
る。抗体と最も強く結合しているカタマーを選択するこ
とは単純である。このカタマーがエピトープの最良のミ
モトープであることの最終的チエックとして、カタマー
の連鎖がオーストラリア特許明細書第25428/84号に記載
されたような置換ネット(net) の母体連鎖として使用さ
れる。

【００１７】こうして、下記アミノ酸連鎖： Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ−Ｘ、 Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ、 Ｘ−Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ、 Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｓ、 Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｇ−Ｈ−Ｓ、および それらの免疫学的に活性な同等物、 からなる群から選択された連鎖を含む６−カタマーが、
口蹄疫ビールスＡ_１０亜型抗原エピトープまたはその分
子トポロジー的同等物であることが判明した。ここで
Ｗ、Ｍ、Ｋ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＧはアミノ酸の一文
字記号を表わし、Ｘはいずれかのアミノ酸を示す。これ
らカタマーは口蹄疫ビールスＡ_１０亜型の診断薬および
治療薬をデザインする上で価値がある。

【００１８】

【実施例】下記に示す実施例１および参考例１，２にお
いて、限定されたモノマーセットは通常のＬ−α−アミ
ノ酸の組みである。このモノマーのセットは、指定され
た位置および任意の位置（Ｄ₁ , Ｄ₂ およびＸ位置）の
両方のために用いられる。 実施例１ 下記一般式を有する多数の８−カタマー標本が合成され
た。

【００１９】アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｘ−Ｄ₂−Ｄ₁−Ｘ−
Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕 ここでＸは、20個の通常のＬ−α−アミノ酸の群の一員
であり、この結果、この群の各員はカタマー標本におい
てＸ位置にほぼ等モル量存在する；指示された位置Ｄ₁
およびＤ₂ も共に同一のモノマーの群の一員であり；−
ＮＨ−はカタマーの末端アミン基を表わす。

【００２０】８−カタマー標本は一般的にオーストラリ
ア特許明細書第25429/84号に記載されているようにし
て、合成中にＬ−α−アミノ酸を保護するためにＢＯＣ
基を用いて、固体ポリマーのピンまたは棒上に合成され
た。通常のα−アミノ酸の群の各員は、Ｘ位置で下記の
ようにして結合された： １．アミノ酸の混合物を 102mlのジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）に溶解した。この混合物は下記から成る。

【００２１】 ＢＯＣ−Ｌ−アラニン 32 mg ＢＯＣ−メトキシベンジル−Ｌ−システイン 100 mg ＢＯＣ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸 90 mg ＢＯＣ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸 96 mg ＢＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン 61 mg ＢＯＣ−Ｌ−グリシン 27 mg ＢＯＣ−トシル−Ｌ−ヒスチジン 142 mg ＢＯＣ−Ｌ−イソロイシン・1/2Ｈ₂Ｏ 51 mg ＢＯＣ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジン 124 mg ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン・Ｈ₂Ｏ 55 mg ＢＯＣ−Ｌ−メチオニン 54 mg ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン 47 mg ＢＯＣ−Ｌ−プロリン 42 mg ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン 53 mg ＢＯＣ−トシル−Ｌ−アスパラギン・Ｈ₂Ｏ 167 mg ＢＯＣ−ベンジル−Ｌ−セリン 76 mg ＢＯＣ−ベンジル−Ｌ−スレオニン 83 mg ＢＯＣ−Ｌ−バリン 42 mg ＢＯＣ−Ｌ−トリプトファン 78 mg ＢＯＣ−ベンジル−Ｌ−チロシン 116 mg ２．1310mgの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯ
ＢＴ）を34mlのＤＭＦに溶解した溶液を作った。

【００２２】３．Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）1150mgを34mlのＤＭＦに溶解した溶液
を作った。 ４．使用前に、ＨＯＢＴの溶液をアミノ酸の溶液に加
え、混合した。次いでＤＤＣの溶液を加え混合した。次
いで、すでに固体支持体上にあるカタマーまたは結合分
子を、得られた混合物と反応させた。

【００２３】個々のＬ−アミノ酸を、オーストラリア特
許明細書第25429/84号記載の方法に従ってＤ₁ およびＤ
₂ 位置に結合させた。この結果、Ｄ₁ およびＤ₂ 位置で
20の通常のアミノ酸のありうる組み合わせにあたる 400
種のカタマー標本が合成された。多数の８−カタマー標
本をモノクロナール抗体に対してＥＬＩＳＡによって試
験をした。このモノクロナール抗体は、当該分野におい
て良く知られている技術を用いて、口蹄疫ビールス (Ｆ
ＭＤＶ) Ａ₁₀亜型に対して製造された。

【００２４】ＥＬＩＳＡ試験の実施においては、支持体
に支持されたペプチドを、１％オバルブミン／１％ウシ
血清アルブミン／0.１％トウィーン20のリン酸塩緩衝食
塩水（ＰＢＳ）中におけるプリコート溶液中で25℃で１
時間保持して、抗体の非特定的吸収を塞いだ。次いで、
プリコート溶液中のモノクロナール抗体の適当な希釈物
中４℃で１夜保持した後に、0.05％トウィーン（Tween)
20／ＰＢＳ中で３回洗浄した。

【００２５】セイヨウワサビペルオキシダーゼに配合さ
れ、プリコート溶液で希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧと
25℃で１時間反応後にＰＢＳ／トウィーンで十分に洗浄
して過剰の配合体を除去した。抗体の存在は、新たに調
製した酵素基質溶液（ｏ−フエニレンジアミン40mgおよ
びリン酸塩／クエン酸塩緩衝液pH5.0 100ml 中の“120v
ol."過酸化水素18μl ）と45分間反応させ、次に450nm
で検出された発色によって検出した。

【００２６】図１は、この抗体による８−カタマー標本
の試験結果を示す。図１において、20本の線から成る各
群は、ＥＬＩＳＡ試験において 450nmで測定した場合に
発現した色の吸光度の応答を単位で表わす。20本の線の
群における夫々の線は、各群の直下に一文字記号で示さ
れた共通のアミノ酸をＤ₁ 位置に有する。20本の線の各
群の夫々の線は、Ｄ₂ 位置で異なるアミノ酸を表わす−
これらは一文字記号のアルファベット順である。これら
の結果を表１にまとめた（表１および以下の記載を通し
て、アミノ酸の一文字記号が用いられる）。

【００２７】

【表１】 表１から、抗体が多数の８−カタマー標本と強く反応す
ることが明らかである。反応の強さの順に、指示された
位置（−Ｄ₂ −Ｄ₁ −) が−Ｍ−Ｈ−，−Ｍ−Ｋ−，−
Ｋ−Ｋ−，−Ｋ−Ｈ−，−Ｑ−Ｈ−および−Ｈ−Ｈ−で
ある８−カタマー標本が含まれる。

【００２８】更に２種類の多数の８−カタマー標本が合
成された。これらは下記の式を有する。 アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｄ₃−Ｍ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 および アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｘ−Ｍ−Ｋ−Ｄ₄−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 ここでＭはメチオニン残基を示し、Ｋはリジン残基を示
し、Ｄ₃ およびＤ₄ はこれら一連の合成のために新たに
指示された位置を示す。式中で用いられた他の用語は先
に用いられたとおりである。

【００２９】これら８−カタマー標本を、口蹄疫ビール
ス（ＦＭＤＶ）Ａ₁₀に対するモノクロナール抗体に対し
て試験した。図２ＡおよびＢは、図１に示した結果を得
るのに用いたモノクロナール抗体によるＥＬＩＳＡ試験
の結果を示す。図２Ａは、下記一般式の８−カタマー標
本を表わす。

【００３０】アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｄ₃−Ｍ−Ｋ−Ｘ−
Ｘ−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕 図２Ｂは下記一般式の８−カタマー標本を示す。 アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｘ−Ｍ−Ｋ−Ｄ₄−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 図２ＡおよびＢの両方において、Ｄ₃ またはＤ₄ 位置に
おけるアミノ酸を、450nm で測定したときの発色の吸光
度を表わす各線の下に示した。

【００３１】この結果を表２にまとめた。抗体結合活性
を、1.１よりも大きな値を与えるすべての８−カタマー
標本について、指定されたアミノ酸対Ｍ−Ｋを含む８−
カタマー標本について示した。また、逆の対Ｋ−Ｍにつ
いて見出された値も示した。

【００３２】

【表２】 モノクロナール抗体と最も反応性に富む８−カタマー標
本は、指定された位置に下記の連鎖を有することが明ら
かである。図２Ａから、−Ｈ−Ｍ−Ｋ−，−Ｗ−Ｍ−Ｋ
−および−Ｑ−Ｍ−Ｋ−。

【００３３】図２Ｂから、−Ｍ−Ｋ−Ｈ−，−Ｍ−Ｋ−
Ｑ−および−Ｍ−Ｋ−Ｗ−。Ｍ−Ｋで指示された対のい
ずれかの側にヒスチジンの加入によって、最大の抗体結
合活性が得られた。しかしながら、アミノ末端側のヒス
チジンは、トリプトファンよりも著しく良好なわけでは
なく、指定された連鎖Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈを選定して更に評
価した。

【００３４】個々の好ましい延長とＭ−Ｋ対との組み合
わせが最適であると予想される指定された連鎖Ｗ−Ｍ−
Ｋ−Ｈを用いて試験を続行した場合の効果を試験した。
母体連鎖アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ−Ｘ
−Ｘ−Ｓ_S 〔固体支持体〕にもとづくカタマー連鎖を合
成し、四つの指定された位置の各々を19のすべてのアミ
ノ酸で一度に一つづつ置換した。

【００３５】このカタマー標本の組みの、モノクロナー
ル抗体（ＭＡｂ) との結合活性の試験から、Ｑ−Ｍ−Ｒ
−Ｈが好ましい連鎖延長であることが示された (得られ
たＥ ₄₅₀ は；Ａc Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ
_S ＝0.69, Ａc −Ｘ−Ｑ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ
_S ＝1.47, およびＡc −Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｘ−Ｘ−
Ｘ−Ｓ_S ＝1.11, 試験バックグラウンド0.２であっ
た）。

【００３６】指定された連鎖Ｍ−Ｋ−Ｈのアミノ末端側
において、Ｍ−Ｋ対について決定されたように、トリプ
トファンよりもグルタミンが優れていることは、個々に
決定された最適性の相互依存性を示している。次に、下
記一般式の８−カタマー標本を合成した。 アセチル−ＮＨ−Ｄ₅−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 および アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｄ₆−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 最高の抗体結合活性を有する標本は、Ｄ₅ ＝トリプトフ
ァンおよびＤ₆ ＝セリンの場合であり、このことからＷ
−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｓが最適の連鎖であることが示唆さ
れる。この連鎖のいづれかの側にアミノ酸を更に指定す
ることによる抗体結合活性の著るしい改善は得られなか
った。

【００３７】この連鎖のすべての単一アミノ酸置換体か
らなり、ヘキサペプチドとして合成したペプチドのセッ
トの評価から、Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｓが最適のヘキサ
ペプチドに近いことが確認された。ペプチドのアルギニ
ンをグリシンで置換して連鎖Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｇ−Ｈ−Ｓと
なした場合、いくらかの抗体結合活性の増加が示され
た。

【００３８】関連するペプチドの決定された群の、試験
ＭＡｂに対する抗体結合反応の特異性を確認するため
に、ペプチドに対する試験ＭＡｂの滴定数を、マッコウ
クジラ・ミオグロビンまたはＡ型肝炎に対する試験ＭＡ
ｂのそれと比較した（表３）。抗体結合反応の特異性
は、これらペプチドの連鎖を決定するために用いた抗体
である試験ＭＡｂに関して明らかである。

【００３９】

【表３】 各ＭＡｂについての抗体滴定数はＥＬＩＳＡにより測定
し、試験バックグラウンドの３倍の吸光を生ずる腹水の
相互希釈に相当する。数値は、希釈した夫々の腹水と関
係のないペプチドコントロール（Ａc −Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ
−Ｓ−Ｉ−ＳsおよびＡc −Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｖ−Ｌ−
Ｓs ) との反応によって測定された非特異的吸収に関し
て補正した。

【００４０】試験したモノクロナール抗体は下記のとお
りであった：本書中に記載した試験ＭＡｂである抗−Ｆ
ＭＤＶ，Ａ₁₀型 (全ビールスに対する滴定数1.３×1
0⁶ ）；抗−Ａ型肝炎，反応の位置は未知（Ａ型肝炎ビ
ールスに対する滴定数10⁶ ) ; および抗ミオグロビン
(マッコウクジラ), 反応位置は未知 (マッコウクジラ
・ミオグロビンに対する滴定数10⁶ ) 。 参考例１ 参考例１は、本発明をポリクロナール抗体に適用した場
合を述べる。

【００４１】実施例１に記述したように、下記一般式を
有する多数の８−カタマーを更に合成した。 アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｘ−Ｄ₂−Ｄ₁−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 これらカタマーを、合成ペプチドＣ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−
Ｓ−Ｉ−Ａ−Ｋに対して得られた抗体に対して試験し
た。この合成ペプチドは、メリフィールド(Merrifield)
の固相ペプチド合成の通常の技術を用いて合成した。こ
のペプチドをシステイン部分のスルフヒドリル基を経て
キーホール・リンペット・ヘモシアニンと結合させた。
この結合したペプチドをフロインドの不完全アジュバン
トで製剤化し、ウサギに筋肉内注射した。注射後40日を
経てウサギの血液から抗血清を得た。

【００４２】多数の８−カタマー標本の、抗体によるＥ
ＬＩＳＡ試験の結果を図１と同様な方法で図３に示し
た。図３から、Ｅ（グルタミン酸）をＤ₁ 位置に有する
すべての８−カタマー標本は、抗体と顕著に反応するこ
とが明らかである。抗体と顕著に反応する他の組み合わ
せには、減少する順に、−Ｄ−Ｉ−，−Ｇ−Ｄ−，−Ｉ
−Ｇ−および−Ｄ−Ｖ−が含まれる。

【００４３】上記実施例１で述べたようにして、下記の
式を有する多数の８−カタマー標本を更に合成した。 アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｄ₃−Ｄ−Ｉ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 および アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｘ−Ｄ−Ｉ−Ｄ₄−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 ここでＤはアスパラギン酸であり、Ｉはイソロイシンで
ある。

【００４４】抗体との試験結果を、図２におけると同様
な方法で図４に示した。図４Ａは下記一般式の８−カタ
マー標本を示し、 アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｄ₃−Ｄ−Ｉ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 図４Ｂは下記一般式の８−カタマー標本を示す。 アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｘ−Ｄ−Ｉ−Ｄ₄−Ｘ−Ｘ−Ｘ−
〔固体支持体〕 図４から抗体と反応する８−カタマー標本は、指定され
た位置に下記の連鎖を含むことを示す。

【００４５】−Ｇ−Ｄ−Ｉ−，−Ａ−Ｄ−Ｉ−，−Ｐ−
Ｄ−Ｉ−，−Ｄ−Ｉ−Ｄ−，−Ｄ−Ｉ−Ｍ−および−Ｄ
−Ｉ−Ｔ−。図４ＡとＢとの比較から、−Ｄ−Ｉ−対の
直前の位置は−Ｄ−Ｉ−対の直後の位置よりもはるかに
少ない範囲のアミノ酸が許されることが明白である。下
記母体連鎖にもとづき、カタマー標本における四つの指
定された位置が夫々一度に一つづつ、すべて19の他のア
ミノ酸で置換された８−カタマー標本を合成した。

【００４６】アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｄ−Ｉ−Ｄ
−Ｘ−Ｘ−〔固体支持体〕 この標本の組みの、試験抗体との結合活性についての試
験は、この抗体との反応能力を保持するためにはグリシ
ン残基はアラニンによってのみ置換されること；アミノ
末端アスパラギン酸は他のアミノ酸で置換できないこ
と；イソロイシンはバリン，ロイシンまたはスレオニン
または結合活性は減少するが約10の他のアミノ酸で置換
できること；およびカルボキシル末端アスパラギン酸は
事実上いづれのアミノ酸によっても置換でき、この位置
におけるセリンは最も強い結合を与えることを示してい
る。また試験結果は、指定された連鎖Ｇ−Ｄ−Ｉ−Ｓが
鎖延長に好ましいことを示している。

【００４７】上記のような指定連鎖の延長は、アミノ末
端へのトリプトファンおよびカルボキシル末端へのヒス
チジンの加入が好ましいことを示している。しかしなが
ら、いづれの鎖延長も抗体結合活性においては顕著な増
加を示さなかった。好ましい指定された連鎖Ｗ−Ｇ−Ｄ
−Ｉ−Ｓ−Ｈを更に延長することは、更に連鎖を延長す
ることにほとんど利点がないことを示した。

【００４８】この特定の抗体に対して決定されたミモト
ープ、すなわちＷ−Ｇ−Ｄ−Ｉ−Ｓ−Ｈは、抗体を導入
するために使用したペプチド、すなわちＣ−Ｇ−Ｄ−Ｌ
−Ｇ−Ｓ−Ｉ−Ａ−Ｋに対して一時的な類似性を有する
のみであることに注目すべきである。しかしながら、免
疫学的連鎖Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｉにもとづく置換ネッ
トにおける抗体の試験では、導入連鎖Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−
Ｓ−Ｉよりも連鎖Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−Ｄ−Ｉが著るしく好
ましいことを示した (Ｅ₄₅₀ 値は夫々0.16および0.45)
。

【００４９】決定されたミモトープと抗体に結合してい
るペプチドとの間には類似性がある。このことは本発明
の方法を広範囲に適用できる強力な証拠である。 参考例２ この参考例２は多数のカタマー標本の鎖長を８−カタマ
ーよりも短くすることができることを示す。

【００５０】下記一般式を有する４−カタマー標本を合
成した。 アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｄ₂−Ｄ₁−Ｘ−〔固体支持体〕 ここで略記号は実施例１で用いたものと同様であり、合
成方法も実施例１で用いた方法と同一である。この４−
カタマーを当該分野において良く知られている技術を用
いてマッコウクジラ・ミオグロビンに対して生じたモノ
クロナール抗体に対して試験した。

【００５１】この抗体による多数の４−カタマー標本の
ＥＬＩＳＡ試験の結果を、図１と同様な方法で図５に示
す。図５から、下記の一般式を有するカタマー標本のみ
が アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｌ−Ａ−Ｘ−〔固体支持体〕 モノクロナール抗体と反応できることが明らかである。

【００５２】前記実施例１に述べたようにして、更に下
記一般式を有する多数の４−カタマー標本を合成した。 アセチル−ＮＨ−Ｄ₃−Ｌ−Ａ−Ｘ−〔固体支持体〕 および アセチル−ＮＨ−Ｘ−Ｌ−Ａ−Ｄ₄−〔固体支持体〕 表４にモノクロナール抗体によるＥＬＩＳＡ系において
試験をした最も活性なカタマー標本をまとめた。

【００５３】

【表４】 下記母体連鎖に基づくカタマー標本を合成して、参考例
１に述べたような置換ネットを形成した。

【００５４】 アセチル−ＮＨ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−〔固体支持体〕 これらのペプチドのモノクロナール抗体によるＥＬＩＳ
Ａ試験の結果を図６に示す。図６における20個の線の各
群は、母体レスポンス（Ｅ₄₅₀ ＝2.62, バックグラウン
ド0.25) の平均に対して比較したレスポンス％を表わ
す。図６中の20個の線の群の各員は、他のアミノ酸によ
って置換された、下に示したアミノ酸を有する。線の順
序はアミノ酸の一文字記号のアルファベット順である。

【００５５】20個の線の各群における太い線は、母体連
鎖Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑを示す。図６から、カタマー標本が母
体連鎖の少なくとも半分の活性を以てこのモノクロナー
ル抗体と結合しうるには、プロリンはバリン，イソロイ
シン，ロイシン，アラニンまたはセリンで置換できるこ
と；ロイシンはフエニルアラニンのみで置換できるこ
と；アラニンは事実上他のいづれのアミノ酸によっても
置換できること；およびグルタミン残基はアスパラギン
によってのみしか置換可能でないことが明らかである。

【００５６】マッコウクジラ・ミオグロビン連鎖のすべ
ての重複する４−カタマーのセットを、実施例１におい
て指定された位置について述べた方法を用いて合成し
た。これらのカタマーをＥＬＩＳＡ試験によりモノクロ
ナール抗体と反応させた。結果を図７に示す。各線はＥ
ＬＩＳＡ試験において450nm で読んだ発色を示す。各線
に付した番号は、特定のカタマーのアミノ末端における
残基がマッコウクジラ・ミオグロビン連鎖におけると同
一番号を有するように付けた。

【００５７】図７から、モノクロナール抗体と反応する
唯一の４−カタマーは、マッコウクジラ連鎖の88〜91残
基から成ることが明白である。この連鎖はＰ−Ｌ−Ａ−
Ｑである。明らかに、モノクロナール抗体はマッコウク
ジラ・ミオグロビン上のこの特定の決定基を認識してい
る。下記一般式を有する一連の５−カタマーを合成して
指定された連鎖に対する最上の鎖延長を決定した。

【００５８】アセチル−ＮＨ−Ｄ₅−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−
〔固体支持体〕 および アセチル−ＮＨ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−Ｄ₆ −〔固体支持
体〕 最上の結合性標本は、 アセチル−ＮＨ−Ｋ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−〔固体支持体〕 アセチル−ＮＨ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑ−Ｙ−〔固体支持体〕 であった。

【００５９】連鎖Ｋ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｑは残基87〜91にお
けるマッコウクジラ・ミオグロビンの連鎖と相同である
ことに注目すべきである。更に、この参考例は本発明技
術の適用可能性を示している。

【００６０】

【発明の効果】口蹄疫ビールスＡ₁₀型抗原エピトープま
たはその分子トポロジー的同等物であるアミノ酸連鎖お
よびそれらの免疫学的に活性な同等物が提供される。こ
れらを用いて口蹄疫の診断および治療に有用な試薬をデ
ザインできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＭＤＶ Ａ₁₀に対するモノクローナル抗体と
８−カタマーとの反応のＥＬＩＳＡ試験結果を示す。

【図２】Ａ、Ｂ共にＦＭＤＶ Ａ₁₀に対するモノクロー
ナル抗体と８−カタマーとの反応のＥＬＩＳＡ試験結果
を示す。

【図３】合成ペプチドＣ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｉ−Ａ
−Ｋに対する抗体と８−カタマーとの反応のＥＬＩＳＡ
試験結果を示す。

【図４】Ａ、Ｂ共に合成ペプチドＣ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−
Ｓ−Ｉ−Ａ−Ｋに対する抗体と８−カタマーとの反応の
ＥＬＩＳＡ試験結果を示す。

【図５】マッコウクジラ・ミオグロビンに対するモノク
ローナル抗体と４−カタマーとの反応のＥＬＩＳＡ試験
結果を示す。

【図６】マッコウクジラ・ミオグロビンに対するモノク
ローナル抗体と４−カタマーとの反応のＥＬＩＳＡ試験
結果を示す。

【図７】マッコウクジラ・ミオグロビンに対するモノク
ローナル抗体と、マッコウクジラ・ミオグロビン連鎖に
由来するすべての４−カタマーとの反応のＥＬＩＳＡ試
験結果を示す。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 口蹄疫ビールスＡ_１０亜型の抗原エピト
   ープまたはその分子トポロジー的同等物であって、下記
   アミノ酸連鎖： Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ−Ｘ、 Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ−Ｘ、 Ｘ−Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｋ−Ｈ、 Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｒ−Ｈ−Ｓ、 Ｗ−Ｑ−Ｍ−Ｇ−Ｈ−Ｓ、および それらの免疫学的に活性な同等物、 （ここでＷ、Ｍ、Ｋ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＧはアミノ
   酸の一文字記号を表わし、Ｘはいずれかのアミノ酸を示
   す）からなる群から選択される連鎖を含む６−カタマ
   ー。