JPH0763373B2 - 新規な組み換え体ｄｎａ及びフォスフォトランスアセチラーゼの製造法 - Google Patents
新規な組み換え体ｄｎａ及びフォスフォトランスアセチラーゼの製造法Info
- Publication number
- JPH0763373B2 JPH0763373B2 JP63329314A JP32931488A JPH0763373B2 JP H0763373 B2 JPH0763373 B2 JP H0763373B2 JP 63329314 A JP63329314 A JP 63329314A JP 32931488 A JP32931488 A JP 32931488A JP H0763373 B2 JPH0763373 B2 JP H0763373B2
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- phosphotransacetylase
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- pta
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フォスフォトランスアセチラーゼの製造に有
用な新規な組み換え体DNA及びフォスフォトランスアセ
チラーゼの製造法に関する。
用な新規な組み換え体DNA及びフォスフォトランスアセ
チラーゼの製造法に関する。
フォスフォトランスアセチラーゼ（Phosphotrans−acet
ylase、EC2.3.1.8、以下PTAと略称する。）は、アセチ
ルリン酸（acetyl phosphate）及びコエンザイムＡ（Co
A）からアセチル−CoA及びリン酸を形成する反応を触媒
する酵素であり、その反応式は下記のとおりである。
ylase、EC2.3.1.8、以下PTAと略称する。）は、アセチ
ルリン酸（acetyl phosphate）及びコエンザイムＡ（Co
A）からアセチル−CoA及びリン酸を形成する反応を触媒
する酵素であり、その反応式は下記のとおりである。
PTAは、アセチル−CoAの製造及び再生に用いることがで
き、また、アセチル−CoA,CoA及びアセチルリン酸の定
量用酵素として極めて有用なものである。
き、また、アセチル−CoA,CoA及びアセチルリン酸の定
量用酵素として極めて有用なものである。
従来、PTAは、例えば、大腸菌（E.coli）Ｂを培地に培
養し、菌体よりPTAを分離、精製することにより製造さ
れている［バイオキム、バイオフィズ．アクタ．（Bioc
him.Biophys.Acta.）,191,p.550〜558（1969年）］。
養し、菌体よりPTAを分離、精製することにより製造さ
れている［バイオキム、バイオフィズ．アクタ．（Bioc
him.Biophys.Acta.）,191,p.550〜558（1969年）］。
しかしながら、上記のPTAの製造法によるときには、該
酵素の収率が著しく低い等の難点があった。
酵素の収率が著しく低い等の難点があった。
そこで、本発明者等は、上記難点を解決すべく種々検討
した結果、PTAをコードする遺伝子を含有するDNAをベク
ターDNAに挿入した組み換え体DNAを得、この組み換え体
をエッシェリシア（Escherichia）属に属する菌株に含
ませたPTA生産能を有する菌株を培地に培養すると、高
収率でPTAが生産されること等の知見を得、本発明を完
成した。
した結果、PTAをコードする遺伝子を含有するDNAをベク
ターDNAに挿入した組み換え体DNAを得、この組み換え体
をエッシェリシア（Escherichia）属に属する菌株に含
ませたPTA生産能を有する菌株を培地に培養すると、高
収率でPTAが生産されること等の知見を得、本発明を完
成した。
すなわち本発明は、フォスフォトランスアセチラーゼを
コードする遺伝子を含有するDNAをベクターDNAに挿入し
たことを特徴とする新規な組み換え体DNAであり、また
本発明は、フォスフォトランスアセチラーゼをコードす
る遺伝子を含有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換
え体DNAを含み、フォスフォトランスアセチラーゼ生産
能を有するエッシェリシア属に属する菌株を培地に培養
し、培養物よりフォスフォトランスアセチラーゼを採取
することを特徴とするフォスフォトランスアセチラーゼ
の製造法である。
コードする遺伝子を含有するDNAをベクターDNAに挿入し
たことを特徴とする新規な組み換え体DNAであり、また
本発明は、フォスフォトランスアセチラーゼをコードす
る遺伝子を含有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換
え体DNAを含み、フォスフォトランスアセチラーゼ生産
能を有するエッシェリシア属に属する菌株を培地に培養
し、培養物よりフォスフォトランスアセチラーゼを採取
することを特徴とするフォスフォトランスアセチラーゼ
の製造法である。
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、PTAをコードする遺伝子を含有するDNAの調製につ
いて述べる。
いて述べる。
PTAをコードする遺伝子を含有するDNAを有する微生物、
例えば、大腸菌（Escherichia coli）1100［マックス−
プランク−インスチチュート（Max−Plank−Institut）
西独、ハイデルベルグより入手］株を通常の固体培養法
で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培
養し、培養物を得る。
例えば、大腸菌（Escherichia coli）1100［マックス−
プランク−インスチチュート（Max−Plank−Institut）
西独、ハイデルベルグより入手］株を通常の固体培養法
で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培
養し、培養物を得る。
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵素
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー
あるいは大豆もしくは小麦▲麩▼の浸出液等の１種以上
の窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２
鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１
種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等
を適宜添加したものが用いられる。
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー
あるいは大豆もしくは小麦▲麩▼の浸出液等の１種以上
の窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２
鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１
種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等
を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発pHは、７〜９に調整するのが適当であ
る。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜24
時間、好ましくは６〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪
培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
る。また培養は30〜42℃、好ましくは37℃前後で４〜24
時間、好ましくは６〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪
培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
この培養物を、例えば3000r.p.m.以上、好ましくは8000
〜10000r.p.m.で５分以上、好ましくは10〜15分間遠心
分離して大腸菌1100株の菌体を得る。
〜10000r.p.m.で５分以上、好ましくは10〜15分間遠心
分離して大腸菌1100株の菌体を得る。
この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法［バイオケム．
バイオフィズ．アクタ．（Biochem.Biophys.Acta.）、
第72巻、第619頁（1963年）］、ケー・エス・カービー
（K.S.Kirby）の方法［バイオケム．ジェイ．（Bioche
m.J.）、第64巻、第405頁（1956年）］等の方法により
染色体DNAを得ることができる。
バイオフィズ．アクタ．（Biochem.Biophys.Acta.）、
第72巻、第619頁（1963年）］、ケー・エス・カービー
（K.S.Kirby）の方法［バイオケム．ジェイ．（Bioche
m.J.）、第64巻、第405頁（1956年）］等の方法により
染色体DNAを得ることができる。
次いで、この染色体DNAに、突出末端を生じさせる制限
酵素、例えばSau3AI（東洋紡績社製）を、温度30℃以
上、好ましくは37℃、酵素濃度１〜10ユニット/mlで20
分以上、好ましくは0.5〜２時間作用させて消化し、種
々の染色体DNA断片混合物を得る。
酵素、例えばSau3AI（東洋紡績社製）を、温度30℃以
上、好ましくは37℃、酵素濃度１〜10ユニット/mlで20
分以上、好ましくは0.5〜２時間作用させて消化し、種
々の染色体DNA断片混合物を得る。
このようにして得たDNA断片混合物から、例えば通常の
アガロースゲル電気泳動法によりDNA断片混合物を得、
更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製し、
また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段により濃
縮し、純化されたDNA断片混合物（この中にPTAをコード
する遺伝子を含有するDNA断片が含まれる）を得る。
アガロースゲル電気泳動法によりDNA断片混合物を得、
更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製し、
また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段により濃
縮し、純化されたDNA断片混合物（この中にPTAをコード
する遺伝子を含有するDNA断片が含まれる）を得る。
一方、本発明において用いることのできるベクターDNA
としては、如何なるものでもよく、例えばプラスミドベ
クターDNA、バクテリオファージベクターDNA等が挙げら
れるが、具体的には例えばプラスミドpBR322DNA［ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research
Laboratories）社製］、プラスミドpUC118DNA（宝酒造
・社・製）などが好ましい。
としては、如何なるものでもよく、例えばプラスミドベ
クターDNA、バクテリオファージベクターDNA等が挙げら
れるが、具体的には例えばプラスミドpBR322DNA［ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research
Laboratories）社製］、プラスミドpUC118DNA（宝酒造
・社・製）などが好ましい。
上記ベクターDNAに、突出末端を生じさせる制限酵素、
例えばBam HI（宝酒造社製）を、温度30℃以上、好まし
くは37℃、酵素濃度10〜1000ユニット/mlで１時間以
上、好ましくは２〜３時間作用させて消化し、切断され
たベクターDNAを得る。
例えばBam HI（宝酒造社製）を、温度30℃以上、好まし
くは37℃、酵素濃度10〜1000ユニット/mlで１時間以
上、好ましくは２〜３時間作用させて消化し、切断され
たベクターDNAを得る。
ついで、上記のようにして得た大腸菌1100由来で、PTA
をコードする遺伝子を含有するDNA断片混合物と、切断
されたベクターDNAを混合し、これに例えば大腸菌DNAリ
ガーゼ（ニュー・イングランド・バイオ・ラブス社
製）、T4DNAリガーゼ（ベーリンガー・マイハイム社
製）など、好ましくはT4DNAリガーゼを、温度４〜37
℃、好ましくは４〜16℃、酵素濃度１〜100ユニットで
１時間以上、好ましくは６〜24時間作用させて組み換え
体DNAを得る。
をコードする遺伝子を含有するDNA断片混合物と、切断
されたベクターDNAを混合し、これに例えば大腸菌DNAリ
ガーゼ（ニュー・イングランド・バイオ・ラブス社
製）、T4DNAリガーゼ（ベーリンガー・マイハイム社
製）など、好ましくはT4DNAリガーゼを、温度４〜37
℃、好ましくは４〜16℃、酵素濃度１〜100ユニットで
１時間以上、好ましくは６〜24時間作用させて組み換え
体DNAを得る。
この組み換え体DNAを用いて、エッシェリヒア属に属す
る菌株例えば大腸菌Ｋ−12、好ましくは大腸菌HB101（A
TCC33694）、大腸菌DHI（ATCC33849）、大腸菌ｘ−1776
（ATCC 31244）、大腸菌1100（Max−Plank−Institut西
独、ハイデルベルグより入手）、大腸菌JM101（ATCC338
76）などを形質転換あるいは形質導入してそれぞれの菌
株を得る。この形質転換はディー・エム・モーリソン
（D.M.Morrison）の方法［メソヅ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）、第68巻、第326〜331
頁（1979年）］により行なうことができる。また形質導
入はビー・ホーン（B.Hohn）の方法［メソヅ・イン・エ
ンザイモロジー第68巻、第299〜309頁（1979年）］によ
って行なうことができる。
る菌株例えば大腸菌Ｋ−12、好ましくは大腸菌HB101（A
TCC33694）、大腸菌DHI（ATCC33849）、大腸菌ｘ−1776
（ATCC 31244）、大腸菌1100（Max−Plank−Institut西
独、ハイデルベルグより入手）、大腸菌JM101（ATCC338
76）などを形質転換あるいは形質導入してそれぞれの菌
株を得る。この形質転換はディー・エム・モーリソン
（D.M.Morrison）の方法［メソヅ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）、第68巻、第326〜331
頁（1979年）］により行なうことができる。また形質導
入はビー・ホーン（B.Hohn）の方法［メソヅ・イン・エ
ンザイモロジー第68巻、第299〜309頁（1979年）］によ
って行なうことができる。
そして、上記菌株よりPTA生産能を有する菌株をスクリ
ーニングすることにより、PTAをコードする遺伝子を含
有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含
み、PTA生産能を有するエッシェリア属に属する菌株を
得ることができる。
ーニングすることにより、PTAをコードする遺伝子を含
有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含
み、PTA生産能を有するエッシェリア属に属する菌株を
得ることができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体DNAを得るには、例えばピー・グーリー（P.Guerr
y）等の方法［ジェイ・バクテリオロジー（J.Bacteriol
ogy）第116巻、第1064〜1066頁（1973年）］、デ・クレ
ウエル（D.B.Cleweel）の方法［ジェー・バクテリオロ
ジー第110巻、第667〜676頁（1972年）］などにより得
ることができる。
換え体DNAを得るには、例えばピー・グーリー（P.Guerr
y）等の方法［ジェイ・バクテリオロジー（J.Bacteriol
ogy）第116巻、第1064〜1066頁（1973年）］、デ・クレ
ウエル（D.B.Cleweel）の方法［ジェー・バクテリオロ
ジー第110巻、第667〜676頁（1972年）］などにより得
ることができる。
上記のようにして得られたPTAをコードする遺伝子を含
有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含
み、PTA生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株
を用いてPTAを生産するには、該菌株を前述と同様にし
て培養し、培養物を得る。
有するDNAをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含
み、PTA生産能を有するエッシェリシア属に属する菌株
を用いてPTAを生産するには、該菌株を前述と同様にし
て培養し、培養物を得る。
培養終了後、該培養物よりPTAを採取するには、通常の
酵素採取手段を用いて得ることができる。
酵素採取手段を用いて得ることができる。
例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下でも振
盪もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外
に排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形
部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、
プロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸し
たのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加し
て分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したの
ち真空乾燥して粗酵素標品を得る。
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下でも振
盪もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外
に排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形
部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、
プロタミン硫酸塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸し
たのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加し
て分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したの
ち真空乾燥して粗酵素標品を得る。
更に、PTAの精製品を得るには、例えばDEAE−セルロー
ス（ジ・エチル・アミノ・エチル・セルロース、米国ブ
ラウン社製）、DEAE−セファデックス（ジ・エチル・ア
ミノ・エチル・セファデックス・スウェーデン国、ファ
ルマシア社製）、QAE−セファデックス（スウェーデン
国、ファルマシア社製）等のイオン交換物質を用いる吸
着溶出法にて精製するか、またセファデックスＧ−200
（スウェーデン国、ファルマシア社製）、セファロース
6B（スウェーデン国、ファルマシア社製）等を用いるゲ
ル濾過法、ハイドロキシルアルパタイト（米国バイオラ
ッド社製、バイオゲルHT）を用いる吸着溶出法、ポリア
クリルアミドゲル等を用いる電気泳動等を適宜選択、組
み合わせて実施することにより、高度に精製されたPTA
標品を得ることができる。
ス（ジ・エチル・アミノ・エチル・セルロース、米国ブ
ラウン社製）、DEAE−セファデックス（ジ・エチル・ア
ミノ・エチル・セファデックス・スウェーデン国、ファ
ルマシア社製）、QAE−セファデックス（スウェーデン
国、ファルマシア社製）等のイオン交換物質を用いる吸
着溶出法にて精製するか、またセファデックスＧ−200
（スウェーデン国、ファルマシア社製）、セファロース
6B（スウェーデン国、ファルマシア社製）等を用いるゲ
ル濾過法、ハイドロキシルアルパタイト（米国バイオラ
ッド社製、バイオゲルHT）を用いる吸着溶出法、ポリア
クリルアミドゲル等を用いる電気泳動等を適宜選択、組
み合わせて実施することにより、高度に精製されたPTA
標品を得ることができる。
上記手段により得られるPTAの理化学的性質は、バイオ
キム．バイオフィズ．アクタ．（Biochem.Biophys.Act
a.）、191、p.550〜558（1969）記載のPTAの理化学的性
質と全く同様である。
キム．バイオフィズ．アクタ．（Biochem.Biophys.Act
a.）、191、p.550〜558（1969）記載のPTAの理化学的性
質と全く同様である。
上述したことらか明らかな如く、本発明の新規な組み換
え体DNAを含むエッシェリシア属に属する菌株を培地に
培養すると、PTAを効率よく得ることができるので、本
発明は産業上極めて有用なものである。
え体DNAを含むエッシェリシア属に属する菌株を培地に
培養すると、PTAを効率よく得ることができるので、本
発明は産業上極めて有用なものである。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
（１） 大腸菌1100株の染色体DNAの調整 大腸菌（Escherichia coli）1100（Max−Plank−Instit
ut西独、ハイデルベルグより入手）株を、Ｔ−Ｙ培地
［１％（W/V）バクト−トリプトン（Bacto−trypton）
〔ディフコ（Difco）・社・製〕、0.5％（W/V）バクト
−イーストエクストラクト（Bactoyeast extract）〔デ
ィフコ（Difco）・社・製〕及び0.5％（W/V）NaCl（pH
7.2）］100mlに接種し、温度37℃で８時間振盪培養し、
培養物を得た。
ut西独、ハイデルベルグより入手）株を、Ｔ−Ｙ培地
［１％（W/V）バクト−トリプトン（Bacto−trypton）
〔ディフコ（Difco）・社・製〕、0.5％（W/V）バクト
−イーストエクストラクト（Bactoyeast extract）〔デ
ィフコ（Difco）・社・製〕及び0.5％（W/V）NaCl（pH
7.2）］100mlに接種し、温度37℃で８時間振盪培養し、
培養物を得た。
この培養物を、10,000r.p.m.で15分間、常法により遠心
分離処理し、湿潤菌体0.5gを得たのち、該菌体から斎
藤、三浦の方法［バイオケム・バイオフィズ．アクタ．
（Biochem.Biophys.Acta.）、第72巻、第619頁（1963
年）］により染色体DNAを得た。
分離処理し、湿潤菌体0.5gを得たのち、該菌体から斎
藤、三浦の方法［バイオケム・バイオフィズ．アクタ．
（Biochem.Biophys.Acta.）、第72巻、第619頁（1963
年）］により染色体DNAを得た。
次いで、この染色体DNA60μｇ及び制限酵素Sau3AI（東
洋紡績・社・製）３ユニットを、10mMトリス−塩酸緩衝
液（50mM NaCl、10mM MgSO4及び1mMジチオスレイトール
含有、pH7.4）に夫々混合し、温度37℃で30分間反応さ
せた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し
たのち、エタノール沈澱処理し、このSau3AIで消化され
たDNA断片が再結合することを防止するために、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）、第133〜
134頁の方法でバクテリアル・アルカリフォスファター
ゼ（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理により、DN
A断片の脱リン酸化を行ない、常法によりフェノール抽
出処理し、更に、エタノール沈澱処理して、Sau3AIで消
化された大腸菌1100株の染色体DNA断片50μｇを得た。
洋紡績・社・製）３ユニットを、10mMトリス−塩酸緩衝
液（50mM NaCl、10mM MgSO4及び1mMジチオスレイトール
含有、pH7.4）に夫々混合し、温度37℃で30分間反応さ
せた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し
たのち、エタノール沈澱処理し、このSau3AIで消化され
たDNA断片が再結合することを防止するために、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）、第133〜
134頁の方法でバクテリアル・アルカリフォスファター
ゼ（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理により、DN
A断片の脱リン酸化を行ない、常法によりフェノール抽
出処理し、更に、エタノール沈澱処理して、Sau3AIで消
化された大腸菌1100株の染色体DNA断片50μｇを得た。
（２） 組み換え体プラスミドpPT100DNAの作製 プラスミドpBR322DNA〔ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ（Bethesda Research Laboratories）・社・製〕
10μｇ及び制限酵素BamHI（宝酒造社製）100ユニットを
50mMトリス−塩酸緩衝液（100mM NaCl、及び10mM MgSO4
含有、pH7.4）に混合し、温度37℃で２時間反応させて
消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタ
ノール沈澱処理して、BamHIで消化されたプラスミドpBR
322DNAを得た。
リーズ（Bethesda Research Laboratories）・社・製〕
10μｇ及び制限酵素BamHI（宝酒造社製）100ユニットを
50mMトリス−塩酸緩衝液（100mM NaCl、及び10mM MgSO4
含有、pH7.4）に混合し、温度37℃で２時間反応させて
消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタ
ノール沈澱処理して、BamHIで消化されたプラスミドpBR
322DNAを得た。
次いで、このBamHIで消化されたプラスミドpBR322DNA10
μｇ、項目（１）で得られたSau3AIで消化された大腸菌
1100株の染色体のDNA断片10μｇ及び５ユニットT4DNAリ
ガーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Manhe
im）・社・製〕を、6.6mM MgCl2、10mMジチオスレイト
ール及び10mMATPを含有する66mMトリス塩酸緩衝液（pH
7.5）に添加し、温度16℃で16時間反応させ、DNAを連結
させ、種々の組み換え体プラスミドDNAを得た。
μｇ、項目（１）で得られたSau3AIで消化された大腸菌
1100株の染色体のDNA断片10μｇ及び５ユニットT4DNAリ
ガーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Manhe
im）・社・製〕を、6.6mM MgCl2、10mMジチオスレイト
ール及び10mMATPを含有する66mMトリス塩酸緩衝液（pH
7.5）に添加し、温度16℃で16時間反応させ、DNAを連結
させ、種々の組み換え体プラスミドDNAを得た。
そして、ディー・エム・モーリソン（D.M.Morrison）の
方法［メソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in E
nzymology）、第68巻、第326〜331頁（1979年）］によ
り、塩化カルシウム処理した大腸菌1100株を、上記のよ
うに連結させた種々の組み換え体プラスミドDNAで形質
転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性
の形質転換株3000株を得た。
方法［メソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in E
nzymology）、第68巻、第326〜331頁（1979年）］によ
り、塩化カルシウム処理した大腸菌1100株を、上記のよ
うに連結させた種々の組み換え体プラスミドDNAで形質
転換し、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性
の形質転換株3000株を得た。
このようにして得られた形質転換株のPTA活性が上昇し
ているか否かを以下のようにして試験した。
ているか否かを以下のようにして試験した。
各菌株を、50μg/mlアンピシリンを含有するＴ−Ｙ培地
1.5mlに接種し、温度30℃で24時間振盪培養して培養液
を得た。これを3,500r.p.m.で10分間遠心分離処理して
湿潤菌体を得、該菌体を10mM MgCl2及び1mMEDTAを含有
する10mMリン酸緩衝液（pH7.5）1mlに懸濁し、これに20
μトルエンを添加し、温度37℃で20分間振盪した。こ
の反応液100μを、5mM MgCl2、0.5mM NAD、0.5mM CoA
（コエンザイムＡ）、5mM L−リンゴ酸、12.5μg/mlマ
レート・デヒドロゲナーゼ、25μg/mlクエン酸シンター
ゼ及び10mMアセチルリン酸を含有する100mMトリス−塩
酸緩衝液（pH8.0）2.9mlに添加し、温度25℃における34
0nmの吸収の変化を測定することにより、PTAの酵素活性
を測定した。340nmの時間当りの吸収量の変化が大きい
ものが、PTA活性が上昇している形質転換株であり、宿
主大腸菌1100株よりPTA活性が上昇している形質転換株
である大腸菌（E.coli）1100（pPT100）株を得た。
1.5mlに接種し、温度30℃で24時間振盪培養して培養液
を得た。これを3,500r.p.m.で10分間遠心分離処理して
湿潤菌体を得、該菌体を10mM MgCl2及び1mMEDTAを含有
する10mMリン酸緩衝液（pH7.5）1mlに懸濁し、これに20
μトルエンを添加し、温度37℃で20分間振盪した。こ
の反応液100μを、5mM MgCl2、0.5mM NAD、0.5mM CoA
（コエンザイムＡ）、5mM L−リンゴ酸、12.5μg/mlマ
レート・デヒドロゲナーゼ、25μg/mlクエン酸シンター
ゼ及び10mMアセチルリン酸を含有する100mMトリス−塩
酸緩衝液（pH8.0）2.9mlに添加し、温度25℃における34
0nmの吸収の変化を測定することにより、PTAの酵素活性
を測定した。340nmの時間当りの吸収量の変化が大きい
ものが、PTA活性が上昇している形質転換株であり、宿
主大腸菌1100株よりPTA活性が上昇している形質転換株
である大腸菌（E.coli）1100（pPT100）株を得た。
（３） 組み換え体プラスミドpPT100DNAの単離 トリプトン１％（W/V）、酵母エキス0.5％（W/V）、及
びNaCl0.5％（W/V）からなる培地１に、該培地を用い
温度37℃で24時間前培養して得た大腸菌（E.coli）1100
（pPT100）株の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間
振盪培養したのち、培養液にクロラムフェニコール0.2g
を添加し、更に同一温度で20時間培養し、培養液を得
た。
びNaCl0.5％（W/V）からなる培地１に、該培地を用い
温度37℃で24時間前培養して得た大腸菌（E.coli）1100
（pPT100）株の培養液20mlを接種し、温度37℃で３時間
振盪培養したのち、培養液にクロラムフェニコール0.2g
を添加し、更に同一温度で20時間培養し、培養液を得
た。
次いで、この培養液を、常法により10,000r.p.m.で10分
間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを20mlの25％
（W/V）ショ糖を含有する50mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10m
g、0.25M EDTA溶液（pH8.0）8ml及び20％（W/V）ドデシ
ル硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加し、温度60℃で30
分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
間遠心分離処理して湿潤菌体を得、これを20mlの25％
（W/V）ショ糖を含有する50mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム10m
g、0.25M EDTA溶液（pH8.0）8ml及び20％（W/V）ドデシ
ル硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加し、温度60℃で30
分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、5M NaCl溶液13mlを添加し、温度４℃で1
6時間処理したものを常法により15,000r.p.m.で30分間
遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出処
理したのち、常法によりエタノール沈澱処理し、沈澱物
を得た。
6時間処理したものを常法により15,000r.p.m.で30分間
遠心分離して抽出液を得、常法によりフェノール抽出処
理したのち、常法によりエタノール沈澱処理し、沈澱物
を得た。
そして、この沈澱物を、常法により減圧乾燥処理したも
のを、1mMEDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液6ml
（pH7.5）に溶解し、更に、これに塩化セシウム6g及び1
0mg/mlエチジウムブロマイド0.2mlを添加したものを、
常法により39,000r.p.m.で42時間超遠心分離機を用いて
平衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミドpP
T100DNAを単離し、また、更に、ｎ−ブタノールを使用
してエチジウムブロマイドを除去したのち、1mMEDTAを
含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に対して透
析を行ない純化された組み換え体プラスミドpPT100DNA
（大きさは、10.0Kbである。）1500μｇを得た。
のを、1mMEDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液6ml
（pH7.5）に溶解し、更に、これに塩化セシウム6g及び1
0mg/mlエチジウムブロマイド0.2mlを添加したものを、
常法により39,000r.p.m.で42時間超遠心分離機を用いて
平衡密度勾配遠心処理を行ない組み換え体プラスミドpP
T100DNAを単離し、また、更に、ｎ−ブタノールを使用
してエチジウムブロマイドを除去したのち、1mMEDTAを
含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に対して透
析を行ない純化された組み換え体プラスミドpPT100DNA
（大きさは、10.0Kbである。）1500μｇを得た。
（４） 新規な組み換え体プラスミドpPT200DNAの作製 プラスミドpUC118DNA（宝酒造・社・製）0.2μｇ並びに
制限酵素KpnI（宝酒造・社・製）10ユニットを10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（10mM MgCl2、及び1mMジチオスレイト
ール含有、pH7.4）に混合し、温度37℃で１時間反応さ
せたのち、更に、50mM NaClとなるようにNaClを添加
し、制限酵素Hind III（宝酒造・社・製）10ユニットを
加え、37℃で１時間反応させて消化液を得、該液を常法
によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理して、Kp
nI及びHind IIIで消化されたプラスミドpUC118DNAを得
た。
制限酵素KpnI（宝酒造・社・製）10ユニットを10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（10mM MgCl2、及び1mMジチオスレイト
ール含有、pH7.4）に混合し、温度37℃で１時間反応さ
せたのち、更に、50mM NaClとなるようにNaClを添加
し、制限酵素Hind III（宝酒造・社・製）10ユニットを
加え、37℃で１時間反応させて消化液を得、該液を常法
によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理して、Kp
nI及びHind IIIで消化されたプラスミドpUC118DNAを得
た。
次いで、項目（３）で得られた組み換え体プラスミドpP
T100DNA1μｇ並びにKpnI10ユニットを10mMトリス−塩酸
緩衝液（10mM MgCl2、及び1mMジチオスレイトール含
有、pH7.4）に混合し、温度37℃で１時間反応させたの
ち、更に最終濃度50mMとなるようにNaClを添加したもの
に、制限酵素Hind III10ユニットを加え、温度37℃で１
時間反応させて消化液を得た。
T100DNA1μｇ並びにKpnI10ユニットを10mMトリス−塩酸
緩衝液（10mM MgCl2、及び1mMジチオスレイトール含
有、pH7.4）に混合し、温度37℃で１時間反応させたの
ち、更に最終濃度50mMとなるようにNaClを添加したもの
に、制限酵素Hind III10ユニットを加え、温度37℃で１
時間反応させて消化液を得た。
該消化液を、0.7％（W/V）アガロースゲル電気泳動した
ものより3.3KbのDNA断片をアール・シー・エイ・ヤング
（R.C.A.Yang）等の方法［メソズ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Euzymology）、第68巻、第176〜182
頁（1979年）］により溶出して溶出物を得、常法により
フェノール抽出及びエタノール沈澱処理してDNA断片0.3
μｇを得た。
ものより3.3KbのDNA断片をアール・シー・エイ・ヤング
（R.C.A.Yang）等の方法［メソズ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Euzymology）、第68巻、第176〜182
頁（1979年）］により溶出して溶出物を得、常法により
フェノール抽出及びエタノール沈澱処理してDNA断片0.3
μｇを得た。
上記のようにして得た0.3μｇのKpnI及びHind IIIで消
化したプラスミドpUC118DNA及び0.3μｇのpPT100プラス
ミドDNA由来の3.3KbpのkpnI/Hind IIIで消化したDNA断
片を、夫々７μの水に溶解し、これに、混液〔77mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.4）/15mM MgCl2/15mMジチオス
レイトール/0.15mMATP〕13μ及び１ユニットのT4DNA
リガーゼを添加し、温度８℃で18時間連結反応を行なっ
た。この反応液を用い、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（Journal of Bacteriology）、第119巻、第1072
〜1074頁（1974年）記載の形質転換法により、大腸菌JM
1100株（ATCC33876）を形質転換し、薬剤耐性（アンピ
シリン耐性）及び、β−ガラクトシダーゼ活性を検討
し、形質転換株を得、その株の含有する組み換え体プラ
スミドDNAをpPT200と命名した。このようにして形質転
換して得られた大腸菌JM1100（pPT200）は、工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研条寄第2195号（FERM BP
−2195）として寄託されている。
化したプラスミドpUC118DNA及び0.3μｇのpPT100プラス
ミドDNA由来の3.3KbpのkpnI/Hind IIIで消化したDNA断
片を、夫々７μの水に溶解し、これに、混液〔77mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.4）/15mM MgCl2/15mMジチオス
レイトール/0.15mMATP〕13μ及び１ユニットのT4DNA
リガーゼを添加し、温度８℃で18時間連結反応を行なっ
た。この反応液を用い、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（Journal of Bacteriology）、第119巻、第1072
〜1074頁（1974年）記載の形質転換法により、大腸菌JM
1100株（ATCC33876）を形質転換し、薬剤耐性（アンピ
シリン耐性）及び、β−ガラクトシダーゼ活性を検討
し、形質転換株を得、その株の含有する組み換え体プラ
スミドDNAをpPT200と命名した。このようにして形質転
換して得られた大腸菌JM1100（pPT200）は、工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研条寄第2195号（FERM BP
−2195）として寄託されている。
（５） 大腸菌JM1100（pPT200）の培養及び粗酵素液の
調製 項目（４）で得た大腸菌JM1100（pPT200）（FERM BP−2
195）を、LB−amp培地〔バクトトリプトン１％（W/
V）、酵母エキス0.5％（W/V）、NaCl0.5％（W/V）及び
アンピシリン50（μg/ml）〕3mlにて温度37℃で18時間
振盪培養を行なって得た培養液0.5mlを、10mlのイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド1mMを含む上記LB−a
mp培地に接種し、温度37℃で６時間振盪培養したのち、
3,500r.p.m.で10分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、
該菌体を、10mM MgCl2及び1mMEDTAを含有する10mMリン
酸緩衝液（pH7.5）1mlに懸濁し、常法により超音波破壊
処理し、粗酵素液を得た。このようにして得られた粗酵
素液中のPTA活性の測定は、下記の方法により行なっ
た。
調製 項目（４）で得た大腸菌JM1100（pPT200）（FERM BP−2
195）を、LB−amp培地〔バクトトリプトン１％（W/
V）、酵母エキス0.5％（W/V）、NaCl0.5％（W/V）及び
アンピシリン50（μg/ml）〕3mlにて温度37℃で18時間
振盪培養を行なって得た培養液0.5mlを、10mlのイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド1mMを含む上記LB−a
mp培地に接種し、温度37℃で６時間振盪培養したのち、
3,500r.p.m.で10分間遠心分離処理して湿潤菌体を得、
該菌体を、10mM MgCl2及び1mMEDTAを含有する10mMリン
酸緩衝液（pH7.5）1mlに懸濁し、常法により超音波破壊
処理し、粗酵素液を得た。このようにして得られた粗酵
素液中のPTA活性の測定は、下記の方法により行なっ
た。
上記粗酵素液100μを、5mM MgCl2、0.5mMNAD、0.5mM
CoA、5mM L−リンゴ酸、12.5μg/mlマレート・デヒドロ
ゲナーゼ、25μg/mlクエン酸シンターゼ及び10mMアセチ
ルリン酸を含有する100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）
2.9mlに添加し、温度25℃における340nmの吸収の変化よ
り、生成したNADHの量を算出した値を下表に示した。
CoA、5mM L−リンゴ酸、12.5μg/mlマレート・デヒドロ
ゲナーゼ、25μg/mlクエン酸シンターゼ及び10mMアセチ
ルリン酸を含有する100mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）
2.9mlに添加し、温度25℃における340nmの吸収の変化よ
り、生成したNADHの量を算出した値を下表に示した。
また、比較のため、プラスミドpUC118DNAを有する大腸
菌JM1100株〔大腸菌JM1100（pUC118）〕についても同様
にPTA活性を測定した結果を下表に示した。
菌JM1100株〔大腸菌JM1100（pUC118）〕についても同様
にPTA活性を測定した結果を下表に示した。
上表より明らかな如く、本発明により得られる粗酵素値
は、対照の粗酵素液に比して、NADPH生成量が著しく増
加しており、PTAが発現されていることが判る。
は、対照の粗酵素液に比して、NADPH生成量が著しく増
加しており、PTAが発現されていることが判る。
（６） PTA遺伝子を含む組み換え体プラスミドpPT200D
NAの調製 上記項目（５）で得られた大腸菌1100（pPT200）株（FE
RM BP−2195）を、トリプトン１％（W/V）、酵母エキス
0.5％（W/V）及びNaCl 0.5％（W/V）からなる培地１
に、該培地を用い、温度37℃で24時間前培養して得られ
た大腸菌1100（pPT200）株の培養液20mlを接種し、温度
37℃で３時間振盪培養したのち、0.2gのクロラムフェニ
コールを添加し、更に同一温度で20時間同培養を行な
い、培養液を得た。
NAの調製 上記項目（５）で得られた大腸菌1100（pPT200）株（FE
RM BP−2195）を、トリプトン１％（W/V）、酵母エキス
0.5％（W/V）及びNaCl 0.5％（W/V）からなる培地１
に、該培地を用い、温度37℃で24時間前培養して得られ
た大腸菌1100（pPT200）株の培養液20mlを接種し、温度
37℃で３時間振盪培養したのち、0.2gのクロラムフェニ
コールを添加し、更に同一温度で20時間同培養を行な
い、培養液を得た。
次いで、この培養液を、常法により6,000r.p.m.で10分
間遠心分離処理して湿潤菌体2gを得、これを20mlの25％
（W/V）ショ糖を含有する350mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁したのち、更に、これにリゾチーム（シグ
マ・社・製）10mg、0.25mMEDTA溶液（pH8.0）8ml及び20
％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加
し、温度60℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、5M NaCl水溶液13mlを添加し、温度４℃
で16時間処理したものを常法により、15,000r.p.m.で30
分間遠心分離して得た抽出液を、常法によりフェノール
抽出処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得
た。
間遠心分離処理して湿潤菌体2gを得、これを20mlの25％
（W/V）ショ糖を含有する350mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）に懸濁したのち、更に、これにリゾチーム（シグ
マ・社・製）10mg、0.25mMEDTA溶液（pH8.0）8ml及び20
％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウム溶液8mlを夫々添加
し、温度60℃で30分間保温して溶菌し、溶菌液を得た。
この溶菌液に、5M NaCl水溶液13mlを添加し、温度４℃
で16時間処理したものを常法により、15,000r.p.m.で30
分間遠心分離して得た抽出液を、常法によりフェノール
抽出処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得
た。
次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
1mMEDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）6m
lに溶解し、更に、これに塩化セシウム6g及びエチジウ
ムブロマイド（19mg/ml）0.2mlを添加したものを、常法
により39,000r.p.m.で42時間超遠心分離機を用いて平衡
密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体プラスミド
pPT200DNAを単離し、また更に、ｎ−ブタノールを使用
してイチジウムブロマイドを除去したのち、1mMEDTAを
含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に対して透
析を行ない純化された組み換え体プラスミドpPT200DNA6
00μｇを得た。
1mMEDTAを含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）6m
lに溶解し、更に、これに塩化セシウム6g及びエチジウ
ムブロマイド（19mg/ml）0.2mlを添加したものを、常法
により39,000r.p.m.で42時間超遠心分離機を用いて平衡
密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体プラスミド
pPT200DNAを単離し、また更に、ｎ−ブタノールを使用
してイチジウムブロマイドを除去したのち、1mMEDTAを
含有する10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に対して透
析を行ない純化された組み換え体プラスミドpPT200DNA6
00μｇを得た。
該組み換え体プラスミドpPT200DNAを制限酵素EcoRI、Kp
nI、BamHI、EcoRV及びHind III（いずれも宝酒造・社・
製）を用い、単一消化及び二重消化して得られたDNA断
片を、アガロース電気泳動法により、移動度パターンを
分析し、得られた移動度パターンとバクテリオファージ
λDNA（宝酒造・社・製）をHindIIIにより消化して得ら
れたDNA断片の標準移動度パターンとを対比することに
より得られた制限酵素開裂地図は、第１図に示すとおり
であった。
nI、BamHI、EcoRV及びHind III（いずれも宝酒造・社・
製）を用い、単一消化及び二重消化して得られたDNA断
片を、アガロース電気泳動法により、移動度パターンを
分析し、得られた移動度パターンとバクテリオファージ
λDNA（宝酒造・社・製）をHindIIIにより消化して得ら
れたDNA断片の標準移動度パターンとを対比することに
より得られた制限酵素開裂地図は、第１図に示すとおり
であった。
第１図は、実施例でえられた新規な組み換え体pPT200プ
ラスミドDNAの制限酵素開裂地図である。
ラスミドDNAの制限酵素開裂地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】下記の制限酵素地図で表されるフォスフォ
トランスアセチラーゼをコードする遺伝子を含有するDN
Aを、ベクターDNAに挿入したことを特徴とする新規な組
み換え体DNA。 - 【請求項２】フォスフォトランスアセチラーゼをコード
する遺伝子を含有するDNAが、エッシェリシア・コリ110
0株由来のDNAである請求項１記載の新規な組み換え体DN
A。 - 【請求項３】ベクターDNAが、プラスミドpBR322又はpUC
118DNAである請求項１記載の新規な組み換え体DNA。 - 【請求項４】下記の制限酵素地図で表されるフォスフォ
トランスアセチラーゼをコードする遺伝子を含有するDN
AをベクターDNAに挿入した組み換え体DNAを含み、フォ
スフォトランスアセチラーゼ生産能を有するエッシェリ
シア属に属する菌株を、培地に培養し、培養物よりフォ
スフォトランスアセチラーゼを採取することを特徴とす
るフォスフォトランスアセチラーゼの製造法。 - 【請求項５】フォスフォトランスアセチラーゼをコード
する遺伝子を含有するDNAが、エッシェリア・コリ1100
株由来のDNAある請求項４記載のフォスフォトランスア
セチラーゼの製造法。 - 【請求項６】ベクターDNAが、プラスミドpBR322又はpUC
118DNAである請求項４記載のフォスフォトランスアセチ
ラーゼの製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63329314A JPH0763373B2 (ja) | 1988-12-28 | 1988-12-28 | 新規な組み換え体ｄｎａ及びフォスフォトランスアセチラーゼの製造法 |
| US07/452,388 US5175104A (en) | 1988-12-28 | 1989-12-19 | Recombinant DNA and a process for producing phosphotransacetylase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63329314A JPH0763373B2 (ja) | 1988-12-28 | 1988-12-28 | 新規な組み換え体ｄｎａ及びフォスフォトランスアセチラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02177888A JPH02177888A (ja) | 1990-07-10 |
| JPH0763373B2 true JPH0763373B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=18220077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63329314A Expired - Fee Related JPH0763373B2 (ja) | 1988-12-28 | 1988-12-28 | 新規な組み換え体ｄｎａ及びフォスフォトランスアセチラーゼの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5175104A (ja) |
| JP (1) | JPH0763373B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5316932A (en) * | 1989-03-24 | 1994-05-31 | Duke University | Homogeneous denatured human 06-guanine alkyltransferase prepared by immunoaffinity chromatography using monoclonal antibody specific for enzyme |
-
1988
- 1988-12-28 JP JP63329314A patent/JPH0763373B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-12-19 US US07/452,388 patent/US5175104A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02177888A (ja) | 1990-07-10 |
| US5175104A (en) | 1992-12-29 |
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