JPS6365310B2 - - Google Patents
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- JPS6365310B2 JPS6365310B2 JP59230895A JP23089584A JPS6365310B2 JP S6365310 B2 JPS6365310 B2 JP S6365310B2 JP 59230895 A JP59230895 A JP 59230895A JP 23089584 A JP23089584 A JP 23089584A JP S6365310 B2 JPS6365310 B2 JP S6365310B2
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- JP
- Japan
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- yeast
- spores
- saccharomyces cerevisiae
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- Prior art date
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
産業上の利用分野
この発明は、優れた凝集性と優れたエタノール
発酵能とを兼ね備えた酵母の製造法に関するもの
である。 近年、石油代替エネルギーとして、石油化学に
よらずに得られる発酵アルコールが注目されてい
る。これはさとうきびやこれから採つた糖蜜、さ
つまいも、じやがいも、とうもろこしなどのセル
ロース質またはでん粉質を原料とし、これらを微
生物の働きによつて発酵させることにより製造さ
れる。 一般にアルコール発酵では、アルコールの生産
性は発酵槽内の菌体濃度に比例する。そこで発酵
槽内の菌体濃度を高める手段として、優れた凝集
性を有する酵母を用いることが考えられる。すな
わち、酵母が優れた凝集性を有していると、酵母
の沈降速度が速くなり、そのため固液分離が迅速
かつ容易になし得る。そして例えば回分発酵にお
いては、発酵液を単に静置するだけで菌体を沈降
堆積させることができ、発酵液と菌体の分離を容
易に行なつて菌体を再使用に供することができ
る。また連続発酵においては、小径の流動部とこ
れの上に連設された菌体沈降用の大径の沈降部と
これに内装された菌体沈降部材とを主体とした塔
型発酵槽を用いることにより、培地の供給量が増
大しても菌体を沈降させてその流出を防止するこ
とができる。このように凝集性を有する酵母を用
いると、凝集性を有しない酵母を用いた場合と比
べて多くの利点があり、そのため新規凝集性酵母
が要望せられている。 従来技術およびその問題点 従来から、上記の要望にこたえるべく、凝集性
酵母を取得する試みがなされて来たが、従来の酵
母は自然界から得られた野生株（たとえば財団法
人発酵研究所保存菌IFO−2018）であつた。しか
しこのような野生株は、凝集性の点では特に問題
ないとしても、アルコール発酵能の点で満足なも
のではなかつた（後記する表３参照）。 この発明は、上記のような実情からなされたも
のであつて、優れた凝集性を有しかつアルコール
発酵能においても申し分のない酵母の製造法を提
供することを目的とする。 問題点を解決するための手段 この発明による凝集性と発酵能を備えた酵母の
製造法は、サツカロマイセス（Saccharomyces）
属に属する凝集性を有しない酵母を胞子形成処理
し、得られた胞子を変異処理し、変異胞子から得
られた優れた凝集性を有する変異酵母と、サツカ
ロマイセス（Saccharomyces）属に属する他の
凝集性を有しない酵母とをプロトプラスト融合さ
せることを特徴とするものである。 この明細書において、酵母の凝集性の程度
（Degree of flocculation）は、以下に示すギリ
ランド・テスト（Gilliland test）（European
Journal of Applied Microbiology and
Biotechnology第７巻、第227−234頁、1979年）
により求められたDF値で表示される。すなわち
供試菌株をYPG培地（注１）で30℃で16時間振
盪培養した後、菌体の沈降速度、沈降菌体の容量
および硬さを肉眼観察により対照菌株と比較し、
表１に示すDF値０から５の６段階で凝集の程度
を表示する。
発酵能とを兼ね備えた酵母の製造法に関するもの
である。 近年、石油代替エネルギーとして、石油化学に
よらずに得られる発酵アルコールが注目されてい
る。これはさとうきびやこれから採つた糖蜜、さ
つまいも、じやがいも、とうもろこしなどのセル
ロース質またはでん粉質を原料とし、これらを微
生物の働きによつて発酵させることにより製造さ
れる。 一般にアルコール発酵では、アルコールの生産
性は発酵槽内の菌体濃度に比例する。そこで発酵
槽内の菌体濃度を高める手段として、優れた凝集
性を有する酵母を用いることが考えられる。すな
わち、酵母が優れた凝集性を有していると、酵母
の沈降速度が速くなり、そのため固液分離が迅速
かつ容易になし得る。そして例えば回分発酵にお
いては、発酵液を単に静置するだけで菌体を沈降
堆積させることができ、発酵液と菌体の分離を容
易に行なつて菌体を再使用に供することができ
る。また連続発酵においては、小径の流動部とこ
れの上に連設された菌体沈降用の大径の沈降部と
これに内装された菌体沈降部材とを主体とした塔
型発酵槽を用いることにより、培地の供給量が増
大しても菌体を沈降させてその流出を防止するこ
とができる。このように凝集性を有する酵母を用
いると、凝集性を有しない酵母を用いた場合と比
べて多くの利点があり、そのため新規凝集性酵母
が要望せられている。 従来技術およびその問題点 従来から、上記の要望にこたえるべく、凝集性
酵母を取得する試みがなされて来たが、従来の酵
母は自然界から得られた野生株（たとえば財団法
人発酵研究所保存菌IFO−2018）であつた。しか
しこのような野生株は、凝集性の点では特に問題
ないとしても、アルコール発酵能の点で満足なも
のではなかつた（後記する表３参照）。 この発明は、上記のような実情からなされたも
のであつて、優れた凝集性を有しかつアルコール
発酵能においても申し分のない酵母の製造法を提
供することを目的とする。 問題点を解決するための手段 この発明による凝集性と発酵能を備えた酵母の
製造法は、サツカロマイセス（Saccharomyces）
属に属する凝集性を有しない酵母を胞子形成処理
し、得られた胞子を変異処理し、変異胞子から得
られた優れた凝集性を有する変異酵母と、サツカ
ロマイセス（Saccharomyces）属に属する他の
凝集性を有しない酵母とをプロトプラスト融合さ
せることを特徴とするものである。 この明細書において、酵母の凝集性の程度
（Degree of flocculation）は、以下に示すギリ
ランド・テスト（Gilliland test）（European
Journal of Applied Microbiology and
Biotechnology第７巻、第227−234頁、1979年）
により求められたDF値で表示される。すなわち
供試菌株をYPG培地（注１）で30℃で16時間振
盪培養した後、菌体の沈降速度、沈降菌体の容量
および硬さを肉眼観察により対照菌株と比較し、
表１に示すDF値０から５の６段階で凝集の程度
を表示する。
【表】
この発明による酵母製造法において、凝集性を
有しない酵母としては、アルコール発酵能に優れ
かつ胞子形成能を有する酵母であれば、限定なく
適用できる。 この発明において、胞子形成処理は常法に従つ
てなされる。通常は凝集性を有しない酵母を
YPG寒天培地（注２）で培養した後、胞子形成
寒天培地（注３）に塗抹する方法がとられる。ま
た単独胞子由来の細胞を得るには、酵母細胞壁溶
解用の溶菌酵素を用いて子のうを溶解した後、マ
イクロマニプユレータを用いて胞子を分離する方
法、または同じく溶菌酵素で子のうを溶解した
後、超音波処理により胞子を分散させ、胞子を栄
養寒天培地で培養する方法がとられる。 また変異処理は、胞子形成処理により得られた
胞子または子のうに公知の突然変異処理、たとえ
ば紫外線、Ｘ線、γ線を照射する物理的方法、エ
チルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、４−ニトロキノ
リン−Ｎ−オキサイドなどの変異誘起剤を接触し
た後に選択培地に生育する化学的方法のいずれに
よつても行なわれるが、エチルメタンスルホネー
トを用いる方法が特に好ましい。 またプロトプラスト融合は常法によつて行なわ
れる。通常は細胞数107〜109個／mlの濃度の各菌
体懸濁液を調製し、これら懸濁液を好ましくは等
量混合した後、酵母細胞壁溶解酵素を含むプロト
プラスト調製液で混合液を処理するか、または各
菌体懸濁液を同調製液で処理した後これらを混合
する。 この発明の製造法で用いる培地としては、炭素
源、窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機
微量栄養素を含有する通常の培地が使用できる。
炭素源としてはグルコース、ガラクトース、フラ
クトース、シユークロース、スターチ加水分解
物、果汁、セルロース分解物などの炭水化物がよ
く用いられる。特に好適な培地は、酵母エキス１
ｇ、ポリペプトン２ｇ、グルコース２ｇ、蒸留水
100mlよりなる培地であり、この培地のPHは無調
整で5.5である。 培養は温度25〜40℃好ましくは30〜37℃で、PH
3.0〜7.0好ましくはPH3.5〜6.0で行なわれる。 この発明の好ましい実施態様においては、財団
法人発酵研究所の保存菌であるDF値０の酵母サ
ツカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）IFO−0224（以下、単にIFO−0224と
記す）を胞子形成処理し、得られた胞子を変異処
理し、変異胞子から得られたDF値４の酵母サツ
カロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）RM−17（微工研菌寄第7770号）（以
下、単にRM−17と記す）と、DF値０の酵母サ
ツカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）VM−２（微工研菌寄第7788号）（以
下、単にVM−２と記す）とをプロトプラスト融
合させ、融合酵母を培養することにより、DF値
５の酵母サツカロマイセス（Saccharomyces）
FRM17VM2−１（微工研菌寄第7792号）を得る。 上記実施態様において、出発酵母IFO−0224は
下記表２に示すごとき諸性質（発酵性および資化
性の有無、生理的性質）を有する。
有しない酵母としては、アルコール発酵能に優れ
かつ胞子形成能を有する酵母であれば、限定なく
適用できる。 この発明において、胞子形成処理は常法に従つ
てなされる。通常は凝集性を有しない酵母を
YPG寒天培地（注２）で培養した後、胞子形成
寒天培地（注３）に塗抹する方法がとられる。ま
た単独胞子由来の細胞を得るには、酵母細胞壁溶
解用の溶菌酵素を用いて子のうを溶解した後、マ
イクロマニプユレータを用いて胞子を分離する方
法、または同じく溶菌酵素で子のうを溶解した
後、超音波処理により胞子を分散させ、胞子を栄
養寒天培地で培養する方法がとられる。 また変異処理は、胞子形成処理により得られた
胞子または子のうに公知の突然変異処理、たとえ
ば紫外線、Ｘ線、γ線を照射する物理的方法、エ
チルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、４−ニトロキノ
リン−Ｎ−オキサイドなどの変異誘起剤を接触し
た後に選択培地に生育する化学的方法のいずれに
よつても行なわれるが、エチルメタンスルホネー
トを用いる方法が特に好ましい。 またプロトプラスト融合は常法によつて行なわ
れる。通常は細胞数107〜109個／mlの濃度の各菌
体懸濁液を調製し、これら懸濁液を好ましくは等
量混合した後、酵母細胞壁溶解酵素を含むプロト
プラスト調製液で混合液を処理するか、または各
菌体懸濁液を同調製液で処理した後これらを混合
する。 この発明の製造法で用いる培地としては、炭素
源、窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機
微量栄養素を含有する通常の培地が使用できる。
炭素源としてはグルコース、ガラクトース、フラ
クトース、シユークロース、スターチ加水分解
物、果汁、セルロース分解物などの炭水化物がよ
く用いられる。特に好適な培地は、酵母エキス１
ｇ、ポリペプトン２ｇ、グルコース２ｇ、蒸留水
100mlよりなる培地であり、この培地のPHは無調
整で5.5である。 培養は温度25〜40℃好ましくは30〜37℃で、PH
3.0〜7.0好ましくはPH3.5〜6.0で行なわれる。 この発明の好ましい実施態様においては、財団
法人発酵研究所の保存菌であるDF値０の酵母サ
ツカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）IFO−0224（以下、単にIFO−0224と
記す）を胞子形成処理し、得られた胞子を変異処
理し、変異胞子から得られたDF値４の酵母サツ
カロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）RM−17（微工研菌寄第7770号）（以
下、単にRM−17と記す）と、DF値０の酵母サ
ツカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）VM−２（微工研菌寄第7788号）（以
下、単にVM−２と記す）とをプロトプラスト融
合させ、融合酵母を培養することにより、DF値
５の酵母サツカロマイセス（Saccharomyces）
FRM17VM2−１（微工研菌寄第7792号）を得る。 上記実施態様において、出発酵母IFO−0224は
下記表２に示すごとき諸性質（発酵性および資化
性の有無、生理的性質）を有する。
【表】
表２中、ラフイノースの発酵性は、結合部が切
断されて生じる構成単糖フラクトース、グルコー
スおよびガラクトースのうちいくつの糖を発酵で
きるかにより表示される。すなわち、発酵性1/3
とはフラクトースのみを発酵する場合を、発酵性
２／３とはフラクトースおよびグルコースを発酵す
る場合を、および発酵性3/3とはすべての構成単
糖を発酵する場合をそれぞれ意味する。 また上記実施態様で得られたFRM17VM2−１は、
下記の菌学的性質を有する。すなわちこの酵母
は、 ●DF値５なる凝集性を有し、液体培養では著し
い沈降性を示す。 ●廃糖蜜（たとえば15％の全糖分を含む廃糖蜜）
を発酵し、７〜9vol％のエタノールを生成す
る。 ●寒天平板上で多少硬い集落を形成する。 ●胞子形成能を有する。 またRM−17は生育にアデニンおよびヒスチジ
ンを要求し、VM−２はイソロイシンおよびバリ
ンを要求する。 なお、サツカロマイセス（Saccharomyces）
属に属する酵母は下記のような菌学的性質を有す
ることが知られている（J.Lodder著「The
Yeasts、Ａ Taxonomic Study」第２版、
North−Holland Publishing社発行、1970年）。 すなわち、この属に属する酵母は、 ●多極出芽によつて増殖する。 ●子のう胞子を形成する。 ●硝酸塩を資化しない。 ●真菌糸を欠くかまたはわずかしか形成しない。 ●成熟子のうは容易に開裂しない。 ●胞子の形状は球形ないし卵形である。 ●グルコースをよく発酵する。 ●麦芽汁培地に皮膜を形成しない。 発明の効果 この発明は以上のとおり構成されているので、
野生株以上に優れた凝集性を有しかつアルコール
発酵能においても申し分のない新規酵母を得るこ
とができる。したがつてこうして得られた凝集性
酵母を用いてアルコール発酵を行なうことによ
り、冒頭で説明したように回分発酵においても連
続発酵においてもアルコール発酵槽内に菌体濃度
を高く維持して、エタノールの生産性を大幅に向
上することができる。 実施例 つぎにこの発明の実施例を示し、上記効果を実
証する。 製造例 (a) RM−17の調製 凝集性を有しない酵母サツカロマイセス・
セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
IFO−0224をYPG寒天培地（注２）で30℃
で24時間培養し、ついで胞子形成寒天培地
（注３）に塗抹し、30℃で３〜５日間培養を
行なつた。こうして胞子を形成させた。 ついで胞子数が107個／mlになるように、
子のうを無菌水１mlに懸濁させ、集菌後リン
酸緩衝液（注４）で洗浄した。ついで子のう
を溶菌酵素溶液（注５）２ml中で30℃で１時
間振盪して、子のうを溶解させた。ついで集
菌後、遊離した胞子を無菌水１mlで洗浄して
リン酸緩衝液３mlに懸濁させた。 この懸濁液に変異誘起剤としてエチルメタ
ンスルホネートを0.1ml添加し、懸濁液を30
℃で２時間振盪した。こうして胞子を変異処
理した。ついで集菌後、変異胞子をリン酸緩
衝液0.2mlに懸濁させ、懸濁液に５％チオ硫
酸ナトリウム水溶液３mlを添加して、懸濁液
を30℃で10分間振盪した。こうして変異誘起
剤を中和した。 集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液１mlで２
回洗浄して同緩衝液５mlに懸濁させ、懸濁液
を氷冷下に３分間超音波処理することにより
変異胞子を懸濁液中に分散させた。ついで集
菌後、懸濁液を無菌水で濃度1/105〜1/106に
希釈し、希釈懸濁液0.1mlをYPG寒天培地
（注２）に塗抹して30℃で48時間培養し、単
独胞子由来の集落を得た。 こうして得られた集落のプレートをマスタ
ープレートとしてレプリカ法により変異株の
検出を行なつた。すなわち、殺菌したベルベ
ツト布地を用いて、前記マスタープレートの
集落を最小培地（注６）にレプリカし、同培
地で30℃で４日間培養し、最小培地で増殖で
きない菌株を栄養要求性変異株としてマスタ
ープレートから釣菌した。 その結果マスタープレートの菌株25株のう
ち凝集性に優れた株サツカロマイセス・セル
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）RM
−17（微工研菌寄第7770号）を得た。この株
はアデニンおよびヒスチジン要求性の菌株で
あつた。 (b) VM−２の調製 工業技術院微生物工業技術研究所応用技術
部生物化学工学研究室から分譲を受けた凝集
性を有しない酵母サツカロマイセス・セルビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）EY−１
（微工研菌寄第7793号）をRM−17の調製と
同じ操作で変異処理し、レプリカ法によりイ
ソロイシンおよびバリン要求性の栄養要求性
変異株として酵母サツカロマイセス・セルビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）VM−
２（微工研菌寄第7788号）を得た。 (c) RM−17とVM−２のプロトプラスト融合 RM−17をYPD培地10mlで30℃で16時間
振盪培養し、集菌後無菌水１mlで洗浄した。
ついでこれをプロトプラスト調製液（注７）
約２mlに懸濁させ、懸濁液を30℃で１時間振
盪し、集菌後等張液（注８）１mlで２回洗浄
を行なつた。 VM−２についても上記と同じ操作で処理
を行なつた。 ついでこうして得られたRM−17の処理菌
体とVM−２の処理菌体とを同量（細胞数
108個／mlずつ）とつて混合し、集菌後混合
物を等張液0.1mlに懸濁させ、懸濁液にポリ
エチレングリコール水溶液（注９）２mlを添
加した。この懸濁液を30℃で15分間静置して
プロトプラスト融合を完結した。ついで集菌
後、菌体を等張液１mlに懸濁し、懸濁液を20
℃で15分間静置した。ついで懸濁液を等張液
で濃度1/10〜1/102に希釈し、希釈懸濁液を
最小培地（注６）に塗抹し、重層用培地（注
10）を重層した。この状態で30℃で４日間培
養を行ない、優れた凝集性を有する融合株を
22株分離し、そのうち１株を酵母サツカロマ
イセス（Saccharomyces）FRM17VM2−１
（微工研菌寄第7792号）とした。 なお、プロトプラスト融合に用いた両親株
（RM−17とVM−２）は上記最小培地に生
育できなかつた。 凝集性およびアルコール発酵能の測定 IFO−2018、IFO−0224、RM−17、EY−
１、VM−２およびFRM17VM2−１について、
それぞれ凝集性の程度を示すDF値およびアル
コール発酵能を測定した。 DF値は前述した方法で求めた。 またアルコール発酵能は下記の方法で求め
た。すなわち沖繩産の廃糖蜜340ｇ／に硫酸
アンモニウム3.4ｇ／とピロ亜硫酸カリウム
0.2ｇ／とを混合溶解した後、硫酸でPHを4.5
に調整し、混合液を3000回転／分で10分間遠心
分離機にかけた。こうして得られた上澄液を70
mlずつとり、各液にそれぞれ菌株の前培養液を
７ml加え、これらを30℃で間欠撹拌（30秒間撹
拌と10分間静置の反復）して回分培養を行な
い、24時間後および48時間後の各培養液につい
てそれぞれエタノール生成量をガスクロマトグ
ラフイーにより測定した。 測定結果は下記表３のとおりである。
断されて生じる構成単糖フラクトース、グルコー
スおよびガラクトースのうちいくつの糖を発酵で
きるかにより表示される。すなわち、発酵性1/3
とはフラクトースのみを発酵する場合を、発酵性
２／３とはフラクトースおよびグルコースを発酵す
る場合を、および発酵性3/3とはすべての構成単
糖を発酵する場合をそれぞれ意味する。 また上記実施態様で得られたFRM17VM2−１は、
下記の菌学的性質を有する。すなわちこの酵母
は、 ●DF値５なる凝集性を有し、液体培養では著し
い沈降性を示す。 ●廃糖蜜（たとえば15％の全糖分を含む廃糖蜜）
を発酵し、７〜9vol％のエタノールを生成す
る。 ●寒天平板上で多少硬い集落を形成する。 ●胞子形成能を有する。 またRM−17は生育にアデニンおよびヒスチジ
ンを要求し、VM−２はイソロイシンおよびバリ
ンを要求する。 なお、サツカロマイセス（Saccharomyces）
属に属する酵母は下記のような菌学的性質を有す
ることが知られている（J.Lodder著「The
Yeasts、Ａ Taxonomic Study」第２版、
North−Holland Publishing社発行、1970年）。 すなわち、この属に属する酵母は、 ●多極出芽によつて増殖する。 ●子のう胞子を形成する。 ●硝酸塩を資化しない。 ●真菌糸を欠くかまたはわずかしか形成しない。 ●成熟子のうは容易に開裂しない。 ●胞子の形状は球形ないし卵形である。 ●グルコースをよく発酵する。 ●麦芽汁培地に皮膜を形成しない。 発明の効果 この発明は以上のとおり構成されているので、
野生株以上に優れた凝集性を有しかつアルコール
発酵能においても申し分のない新規酵母を得るこ
とができる。したがつてこうして得られた凝集性
酵母を用いてアルコール発酵を行なうことによ
り、冒頭で説明したように回分発酵においても連
続発酵においてもアルコール発酵槽内に菌体濃度
を高く維持して、エタノールの生産性を大幅に向
上することができる。 実施例 つぎにこの発明の実施例を示し、上記効果を実
証する。 製造例 (a) RM−17の調製 凝集性を有しない酵母サツカロマイセス・
セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
IFO−0224をYPG寒天培地（注２）で30℃
で24時間培養し、ついで胞子形成寒天培地
（注３）に塗抹し、30℃で３〜５日間培養を
行なつた。こうして胞子を形成させた。 ついで胞子数が107個／mlになるように、
子のうを無菌水１mlに懸濁させ、集菌後リン
酸緩衝液（注４）で洗浄した。ついで子のう
を溶菌酵素溶液（注５）２ml中で30℃で１時
間振盪して、子のうを溶解させた。ついで集
菌後、遊離した胞子を無菌水１mlで洗浄して
リン酸緩衝液３mlに懸濁させた。 この懸濁液に変異誘起剤としてエチルメタ
ンスルホネートを0.1ml添加し、懸濁液を30
℃で２時間振盪した。こうして胞子を変異処
理した。ついで集菌後、変異胞子をリン酸緩
衝液0.2mlに懸濁させ、懸濁液に５％チオ硫
酸ナトリウム水溶液３mlを添加して、懸濁液
を30℃で10分間振盪した。こうして変異誘起
剤を中和した。 集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液１mlで２
回洗浄して同緩衝液５mlに懸濁させ、懸濁液
を氷冷下に３分間超音波処理することにより
変異胞子を懸濁液中に分散させた。ついで集
菌後、懸濁液を無菌水で濃度1/105〜1/106に
希釈し、希釈懸濁液0.1mlをYPG寒天培地
（注２）に塗抹して30℃で48時間培養し、単
独胞子由来の集落を得た。 こうして得られた集落のプレートをマスタ
ープレートとしてレプリカ法により変異株の
検出を行なつた。すなわち、殺菌したベルベ
ツト布地を用いて、前記マスタープレートの
集落を最小培地（注６）にレプリカし、同培
地で30℃で４日間培養し、最小培地で増殖で
きない菌株を栄養要求性変異株としてマスタ
ープレートから釣菌した。 その結果マスタープレートの菌株25株のう
ち凝集性に優れた株サツカロマイセス・セル
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）RM
−17（微工研菌寄第7770号）を得た。この株
はアデニンおよびヒスチジン要求性の菌株で
あつた。 (b) VM−２の調製 工業技術院微生物工業技術研究所応用技術
部生物化学工学研究室から分譲を受けた凝集
性を有しない酵母サツカロマイセス・セルビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）EY−１
（微工研菌寄第7793号）をRM−17の調製と
同じ操作で変異処理し、レプリカ法によりイ
ソロイシンおよびバリン要求性の栄養要求性
変異株として酵母サツカロマイセス・セルビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）VM−
２（微工研菌寄第7788号）を得た。 (c) RM−17とVM−２のプロトプラスト融合 RM−17をYPD培地10mlで30℃で16時間
振盪培養し、集菌後無菌水１mlで洗浄した。
ついでこれをプロトプラスト調製液（注７）
約２mlに懸濁させ、懸濁液を30℃で１時間振
盪し、集菌後等張液（注８）１mlで２回洗浄
を行なつた。 VM−２についても上記と同じ操作で処理
を行なつた。 ついでこうして得られたRM−17の処理菌
体とVM−２の処理菌体とを同量（細胞数
108個／mlずつ）とつて混合し、集菌後混合
物を等張液0.1mlに懸濁させ、懸濁液にポリ
エチレングリコール水溶液（注９）２mlを添
加した。この懸濁液を30℃で15分間静置して
プロトプラスト融合を完結した。ついで集菌
後、菌体を等張液１mlに懸濁し、懸濁液を20
℃で15分間静置した。ついで懸濁液を等張液
で濃度1/10〜1/102に希釈し、希釈懸濁液を
最小培地（注６）に塗抹し、重層用培地（注
10）を重層した。この状態で30℃で４日間培
養を行ない、優れた凝集性を有する融合株を
22株分離し、そのうち１株を酵母サツカロマ
イセス（Saccharomyces）FRM17VM2−１
（微工研菌寄第7792号）とした。 なお、プロトプラスト融合に用いた両親株
（RM−17とVM−２）は上記最小培地に生
育できなかつた。 凝集性およびアルコール発酵能の測定 IFO−2018、IFO−0224、RM−17、EY−
１、VM−２およびFRM17VM2−１について、
それぞれ凝集性の程度を示すDF値およびアル
コール発酵能を測定した。 DF値は前述した方法で求めた。 またアルコール発酵能は下記の方法で求め
た。すなわち沖繩産の廃糖蜜340ｇ／に硫酸
アンモニウム3.4ｇ／とピロ亜硫酸カリウム
0.2ｇ／とを混合溶解した後、硫酸でPHを4.5
に調整し、混合液を3000回転／分で10分間遠心
分離機にかけた。こうして得られた上澄液を70
mlずつとり、各液にそれぞれ菌株の前培養液を
７ml加え、これらを30℃で間欠撹拌（30秒間撹
拌と10分間静置の反復）して回分培養を行な
い、24時間後および48時間後の各培養液につい
てそれぞれエタノール生成量をガスクロマトグ
ラフイーにより測定した。 測定結果は下記表３のとおりである。
【表】
表３から明らかなように、RM−17および
VM−２は変異株であるため、アルコール発酵
能は野生型の親株の発酵能より劣るが、融合株
であるFRM17VM2−１は野性株以上に優れた凝
集性を有しかつアルコール発酵能においても野
生株と比べて遜色がない。 培地および試薬 培地および試薬はそれぞれつぎのとおりであ
る。 （注１） YPG培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ （注２） YPG寒天培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注３） 胞子形成培地 酢酸ナトリウム ５ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注４） リン酸緩衝液 0.1Mリン酸緩衝液 PH＝7.5 （注５） 溶菌酵素溶液 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にザイモリア
ーゼ20T（生化学工業社製）を0.05％溶かし
た溶液２mlと、２−メルカプトエタノール
1.4μとの混合液 （注６） 最小培地 Difco−Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注７） プロトプラスト調製液 1.5M塩化カリウム0.8mlと、2/15Ｍリン酸
緩衝液（PH7.5）1.0mlと、２−メルカプトリ
ン酸緩衝液1.4μと、ザイモリアーゼ20T
（生化学工業社製）を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）に0.25％溶かした溶液0.2mlとの混合液 （注８） 等張液 0.6M塩化カリウム水溶液 （注９） ポリエチレングリコール水溶液 塩化カルシウム 5.6ｇ／ ポリエチレングリコール（PEG−6000）
300ｇ／ （注10） 重層用培地 グルコース 20ｇ／ Difco−Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ Difco−Bact Agar（Difco社製） 30ｇ／
VM−２は変異株であるため、アルコール発酵
能は野生型の親株の発酵能より劣るが、融合株
であるFRM17VM2−１は野性株以上に優れた凝
集性を有しかつアルコール発酵能においても野
生株と比べて遜色がない。 培地および試薬 培地および試薬はそれぞれつぎのとおりであ
る。 （注１） YPG培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ （注２） YPG寒天培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注３） 胞子形成培地 酢酸ナトリウム ５ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注４） リン酸緩衝液 0.1Mリン酸緩衝液 PH＝7.5 （注５） 溶菌酵素溶液 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にザイモリア
ーゼ20T（生化学工業社製）を0.05％溶かし
た溶液２mlと、２−メルカプトエタノール
1.4μとの混合液 （注６） 最小培地 Difco−Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注７） プロトプラスト調製液 1.5M塩化カリウム0.8mlと、2/15Ｍリン酸
緩衝液（PH7.5）1.0mlと、２−メルカプトリ
ン酸緩衝液1.4μと、ザイモリアーゼ20T
（生化学工業社製）を0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）に0.25％溶かした溶液0.2mlとの混合液 （注８） 等張液 0.6M塩化カリウム水溶液 （注９） ポリエチレングリコール水溶液 塩化カルシウム 5.6ｇ／ ポリエチレングリコール（PEG−6000）
300ｇ／ （注10） 重層用培地 グルコース 20ｇ／ Difco−Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ Difco−Bact Agar（Difco社製） 30ｇ／
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ サツカロマイセス（Saccharomyces）属に
属する凝集性を有しない酵母を胞子形成処理し、
得られた胞子を変異処理し、変異胞子から得られ
た優れた凝集性を有する変異酵母と、サツカロマ
イセス（Saccharomyces）属に属する他の凝集
性を有しない酵母とをプロトプラスト融合させる
ことを特徴とする、優れた凝集性と優れたアルコ
ール発酵能とを兼ね備えた酵母の製造法。 ２ DF値０の酵母サツカロマイセス・セルビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）IFO−0224を
胞子形成処理し、得られた胞子を変異処理し、変
異胞子から得られた優れた凝集性を有する変異酵
母と、サツカロマイセス（Saccharomyces）属
に属する他の凝集性を有しない酵母とをプロトプ
ラスト融合させて、優れた凝集性と優れたアルコ
ール発酵能とを兼ね備えた酵母を得る、特許請求
の範囲第１項記載の酵母の製造法。 ３ DF値０の酵母サツカロマイセス・セルビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）IFO−0224を
胞子形成処理し、得られた胞子を変異処理し、変
異胞子から得られたDF値４の酵母サツカロマイ
セス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
RM−17（微工研菌寄第7770号）と、DF値０の酵
母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）VM−２（微工研
菌寄第7788号）とをプロトプラスト融合させ、優
れた凝集性と優れたアルコール発酵能とを兼ね備
えた酵母を得る、特許請求の範囲第１項記載の製
造法。 ４ DF値０の酵母サツカロマイセス・セルビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）IFO−0224を
胞子形成処理し、得られた胞子を変異処理し、変
異胞子から得られたDF値４の酵母サツカロマイ
セス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
RM−17（微工研菌寄第7770号）と、DF値０の酵
母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）VM−２（微工研
菌寄第7788号）とをプロトプラスト融合させ、
DF値５の酵母サツカロマイセス
（Saccharomyces）FRM17VM2−１（微工研菌寄第
7792号）を得る、特許請求の範囲第１項記載の製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59230895A JPS61108376A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 凝集性と発酵能を備えた酵母の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59230895A JPS61108376A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 凝集性と発酵能を備えた酵母の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61108376A JPS61108376A (ja) | 1986-05-27 |
| JPS6365310B2 true JPS6365310B2 (ja) | 1988-12-15 |
Family
ID=16914978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59230895A Granted JPS61108376A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 凝集性と発酵能を備えた酵母の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61108376A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6344880A (ja) * | 1986-08-12 | 1988-02-25 | Hitachi Zosen Corp | 新規凝集性酵母、その製造法およびこれを用いるアルコ−ル発酵法 |
-
1984
- 1984-10-31 JP JP59230895A patent/JPS61108376A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61108376A (ja) | 1986-05-27 |
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