JPH0121758B2 - - Google Patents
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- JPH0121758B2 JPH0121758B2 JP59230899A JP23089984A JPH0121758B2 JP H0121758 B2 JPH0121758 B2 JP H0121758B2 JP 59230899 A JP59230899 A JP 59230899A JP 23089984 A JP23089984 A JP 23089984A JP H0121758 B2 JPH0121758 B2 JP H0121758B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
- C12N15/04—Fungi
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
産業上の利用分野
この発明は、優れた凝集性と優れたアルコール
発酵能とを兼ね備えた新規酵母に関するものであ
る。 近年、石油代替エネルギーとして、石油化学に
よらずに得られる発酵アルコールが注目されてい
る。これはさとうきびやこれから採つた糖蜜、さ
つまいも、じやがいも、とうもろこしなどのセル
ロース質またはでん粉質を原料とし、これらを微
生物の働きによつて発酵させることにより製造さ
れる。 一般にアルコール発酵では、アルコールの生産
性は発酵槽内の菌体濃度に比例する。そこで発酵
槽内の菌体濃度を高める手段として、優れた凝集
性を有する酵母を用いることが考えられる。すな
わち、酵母が優れた凝集性を有していると、酵母
の沈降速度が速くなり、そのため固液分離が迅速
かつ容易になし得る。そして例えば回分発酵にお
いては、発酵液を単に静置するだけで菌体を沈降
堆積させることができ、発酵液と菌体の分離を容
易に行なつて菌体を再使用に供することができ
る。また連続発酵においては、小径の流動部とこ
れの上に連設された菌体沈降用の大径の沈降部と
これに内装された菌体沈降部材とを主体とした塔
型発酵槽を用いることにより、培地の供給量が増
大しても菌体を沈降させてその流出を防止するこ
とができる。このように凝集性を有する酵母を用
いると、凝集性を有しない酵母を用いた場合に比
べて多くの利点があり、そのため新規凝集性酵母
が要望せられている。 従来技術およびその問題点 従来から、上記の要望にこたえるべく、凝集性
酵母を取得する試みがなされて来たが、従来の酵
母は自然界から得られた野生株（たとえば財団法
人発酵研究所保存菌IFO―2018）であつた。しか
しこのような野生株は、凝集性の点で特に問題な
いとしても、アルコール発酵能の点で満足なもの
ではなかつた（後記する表３参照）。 この発明は、上記のような実情からなされたも
のであつて、優れた凝集性を有しかつアルコール
発酵能においても申し分のない新規酵母を提供す
ることを目的とする。 問題点を解決するための手段 この発明は、 ・ DF値５なる凝集性を有し、 ・ 廃糖蜜340ｇ／と硫酸アンモニウムとピロ
亜硫酸カリウムのPH4.5の混合液を遠心分離
し、得られた上澄液の70mlに菌株の前培養液
７mlを加えて、回分培養を行なうことによ
り、24時間後および48時間後にそれぞれ55.7
ｇ／および56.0ｇ／のエタノールを生成
する。 酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae） FRM17VM2―１（微工研菌寄第7792号）。（以下これ
を「この発明による酵母と記す）である。 この明細書において、酵母の凝集性の程度
（Degree of flocculation）は、以下に示すギリ
ランド・テスト（Gilliland test）（European
Journal of Applied Microbiology and
Biotechnology第７巻、第227―234頁、1979年）
により求められたDF値で表示される。すなわち
供試菌株をYPG培地（注１）で30℃で16時間振
蘯培養した後、菌体の沈降速度、沈降菌体の容量
および硬さを肉眼観察により対照菌体と比較し、
表１に示すDF値０から５の６段階で凝集の程度
を表示する。
発酵能とを兼ね備えた新規酵母に関するものであ
る。 近年、石油代替エネルギーとして、石油化学に
よらずに得られる発酵アルコールが注目されてい
る。これはさとうきびやこれから採つた糖蜜、さ
つまいも、じやがいも、とうもろこしなどのセル
ロース質またはでん粉質を原料とし、これらを微
生物の働きによつて発酵させることにより製造さ
れる。 一般にアルコール発酵では、アルコールの生産
性は発酵槽内の菌体濃度に比例する。そこで発酵
槽内の菌体濃度を高める手段として、優れた凝集
性を有する酵母を用いることが考えられる。すな
わち、酵母が優れた凝集性を有していると、酵母
の沈降速度が速くなり、そのため固液分離が迅速
かつ容易になし得る。そして例えば回分発酵にお
いては、発酵液を単に静置するだけで菌体を沈降
堆積させることができ、発酵液と菌体の分離を容
易に行なつて菌体を再使用に供することができ
る。また連続発酵においては、小径の流動部とこ
れの上に連設された菌体沈降用の大径の沈降部と
これに内装された菌体沈降部材とを主体とした塔
型発酵槽を用いることにより、培地の供給量が増
大しても菌体を沈降させてその流出を防止するこ
とができる。このように凝集性を有する酵母を用
いると、凝集性を有しない酵母を用いた場合に比
べて多くの利点があり、そのため新規凝集性酵母
が要望せられている。 従来技術およびその問題点 従来から、上記の要望にこたえるべく、凝集性
酵母を取得する試みがなされて来たが、従来の酵
母は自然界から得られた野生株（たとえば財団法
人発酵研究所保存菌IFO―2018）であつた。しか
しこのような野生株は、凝集性の点で特に問題な
いとしても、アルコール発酵能の点で満足なもの
ではなかつた（後記する表３参照）。 この発明は、上記のような実情からなされたも
のであつて、優れた凝集性を有しかつアルコール
発酵能においても申し分のない新規酵母を提供す
ることを目的とする。 問題点を解決するための手段 この発明は、 ・ DF値５なる凝集性を有し、 ・ 廃糖蜜340ｇ／と硫酸アンモニウムとピロ
亜硫酸カリウムのPH4.5の混合液を遠心分離
し、得られた上澄液の70mlに菌株の前培養液
７mlを加えて、回分培養を行なうことによ
り、24時間後および48時間後にそれぞれ55.7
ｇ／および56.0ｇ／のエタノールを生成
する。 酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae） FRM17VM2―１（微工研菌寄第7792号）。（以下これ
を「この発明による酵母と記す）である。 この明細書において、酵母の凝集性の程度
（Degree of flocculation）は、以下に示すギリ
ランド・テスト（Gilliland test）（European
Journal of Applied Microbiology and
Biotechnology第７巻、第227―234頁、1979年）
により求められたDF値で表示される。すなわち
供試菌株をYPG培地（注１）で30℃で16時間振
蘯培養した後、菌体の沈降速度、沈降菌体の容量
および硬さを肉眼観察により対照菌体と比較し、
表１に示すDF値０から５の６段階で凝集の程度
を表示する。
【表】
この発明による酵母は下記の菌学的性質を有す
る。すなわちこの酵母は、 ・ DF値５なる凝集性を有し、液体培養では著
しい沈降性を示す。 ・ 廃糖蜜（たとえば15％の全糖分を含む廃糖
蜜）を発酵し、７〜9vol％のエタノールを生成
する。 ・ 寒天平板上で多少硬い集落を形成する。 ・ 胞子形成能を有する。 この発明による酵母の培地としては、炭素源、
窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機微量
栄養素を含有する通常の培地が使用できる。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクト
ース、シユークロース、スターチ加水分解物、果
汁、セルロース分解物などの炭水化物がよく用い
られる。特に好適な培地は、酵母エキス１ｇ、ポ
リペプトン２ｇ、グルコース２ｇ、蒸留水100ml
よりなる培地であり、この培地のPHは無調整で
5.5である。 培養は温度25〜40℃好ましくは30〜37℃で、PH
3.0〜7.0好ましくはPH3.5〜6.0で行なわれる。 つぎに、発明による酵母の製造法について説明
する。 この発明による酵母は、凝集性を有する酵母サ
ツカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）RM―17（微工研菌寄第7770号）（以
下、単にRM―17と記す）と、凝集性を有しない
酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）VM―２（微工研
菌寄第7788号）（以下、単にVM―２と記す）と
をプロトプラス融合処理し、融合菌体を培養する
ことにより製造される。 プロトプラスト融合は常法によつて行なわれ
る。通常は細胞数107〜109個／mlの濃度の各菌体
懸濁液を調製し、これら懸濁液を好ましくは等量
混合した後、酵母細胞壁溶解酵素を含むプロトプ
ラスト調製液で混合物を処理するか、または各菌
体懸濁液を同調製液で処理した後これらを混合す
る。 RM―17は財団法人発酵研究所の保存菌である
DF値０の酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）IFO―0224（以下、
単にIFO―0224と記す）を胞子形成処理し、得ら
れた胞子を変異処理し、変異胞子を培養し、得ら
れた集落からレプリカ法によつて変異株を検出
し、これを分離することにより製造される。 胞子形成処理は常法に従つてなされる。通常は
凝集性を有しない酵母をYPG寒天培地（注２）
で培養した後、胞子形成寒天培地（注３）に塗抹
する方法がとられる。また単独胞子由来の細胞を
得るには、酵母細胞壁溶解用の溶菌酵素を用いて
子のうを溶解した後、マイクロマニプユレータを
用いて胞子を分離する方法、または同じく溶菌酵
素で子のうを溶解した後、超音波処理により胞子
を分散させ、胞子を栄養寒天培地で培養する方法
がとられる。 また変異処理は、胞子形成処理により得られた
胞子または子のうに公知の突然変異処理、たとえ
ば紫外線、Ｘ線、γ線を照射する物理的方法、エ
チルメタンスルホネート、Ｎ―メチル―N′―ニ
トロ―Ｎ―ニトロソグアニジン、４―ニトロキノ
リン―Ｎ―オキサイドなどの変異誘起剤を接触し
た後に選択培地に生育する化学的方法のいずれに
よつても行なわれるが、エチルメタンスルホネー
トを用いる方法が特に好ましい。 変異株の検出はレプリカ法によつて行なう。す
なわち、変異胞子をYPG寒天培地のような完全
培地で培養することによつて得られた集落のプレ
ートをマスタープレートとし、殺菌した布地など
を用いて、同プレート上の集落を所定の栄養要素
を含まない最少培地のプレート上に移し、同培地
でこれを培養する。上記の栄養要素を必要とする
集落は最少培地のプレート上では発育しないの
で、このプレート上の集落とマスタープレート上
の集落とを比較することによつて、容易に栄養要
求性株を検出することができる。 検出した栄養要求性株をついでマスタープレー
トから釣菌して他の菌体から分離する。こうし
て、所望の凝集性を有する酵母を得る。 上記一連の製造過程において、培地および培養
条件は、前述した酵母自体の培地および培養条件
と同じである。 IFO―0224はDF値０であつて全く凝集性を示
さない。また、サツカロマイセス・セルビシエに
属する酵母は、下記表２に示すごとき諸性質（発
酵性および資化性の有無、生理的性質）を有す
る。
る。すなわちこの酵母は、 ・ DF値５なる凝集性を有し、液体培養では著
しい沈降性を示す。 ・ 廃糖蜜（たとえば15％の全糖分を含む廃糖
蜜）を発酵し、７〜9vol％のエタノールを生成
する。 ・ 寒天平板上で多少硬い集落を形成する。 ・ 胞子形成能を有する。 この発明による酵母の培地としては、炭素源、
窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機微量
栄養素を含有する通常の培地が使用できる。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクト
ース、シユークロース、スターチ加水分解物、果
汁、セルロース分解物などの炭水化物がよく用い
られる。特に好適な培地は、酵母エキス１ｇ、ポ
リペプトン２ｇ、グルコース２ｇ、蒸留水100ml
よりなる培地であり、この培地のPHは無調整で
5.5である。 培養は温度25〜40℃好ましくは30〜37℃で、PH
3.0〜7.0好ましくはPH3.5〜6.0で行なわれる。 つぎに、発明による酵母の製造法について説明
する。 この発明による酵母は、凝集性を有する酵母サ
ツカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）RM―17（微工研菌寄第7770号）（以
下、単にRM―17と記す）と、凝集性を有しない
酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）VM―２（微工研
菌寄第7788号）（以下、単にVM―２と記す）と
をプロトプラス融合処理し、融合菌体を培養する
ことにより製造される。 プロトプラスト融合は常法によつて行なわれ
る。通常は細胞数107〜109個／mlの濃度の各菌体
懸濁液を調製し、これら懸濁液を好ましくは等量
混合した後、酵母細胞壁溶解酵素を含むプロトプ
ラスト調製液で混合物を処理するか、または各菌
体懸濁液を同調製液で処理した後これらを混合す
る。 RM―17は財団法人発酵研究所の保存菌である
DF値０の酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）IFO―0224（以下、
単にIFO―0224と記す）を胞子形成処理し、得ら
れた胞子を変異処理し、変異胞子を培養し、得ら
れた集落からレプリカ法によつて変異株を検出
し、これを分離することにより製造される。 胞子形成処理は常法に従つてなされる。通常は
凝集性を有しない酵母をYPG寒天培地（注２）
で培養した後、胞子形成寒天培地（注３）に塗抹
する方法がとられる。また単独胞子由来の細胞を
得るには、酵母細胞壁溶解用の溶菌酵素を用いて
子のうを溶解した後、マイクロマニプユレータを
用いて胞子を分離する方法、または同じく溶菌酵
素で子のうを溶解した後、超音波処理により胞子
を分散させ、胞子を栄養寒天培地で培養する方法
がとられる。 また変異処理は、胞子形成処理により得られた
胞子または子のうに公知の突然変異処理、たとえ
ば紫外線、Ｘ線、γ線を照射する物理的方法、エ
チルメタンスルホネート、Ｎ―メチル―N′―ニ
トロ―Ｎ―ニトロソグアニジン、４―ニトロキノ
リン―Ｎ―オキサイドなどの変異誘起剤を接触し
た後に選択培地に生育する化学的方法のいずれに
よつても行なわれるが、エチルメタンスルホネー
トを用いる方法が特に好ましい。 変異株の検出はレプリカ法によつて行なう。す
なわち、変異胞子をYPG寒天培地のような完全
培地で培養することによつて得られた集落のプレ
ートをマスタープレートとし、殺菌した布地など
を用いて、同プレート上の集落を所定の栄養要素
を含まない最少培地のプレート上に移し、同培地
でこれを培養する。上記の栄養要素を必要とする
集落は最少培地のプレート上では発育しないの
で、このプレート上の集落とマスタープレート上
の集落とを比較することによつて、容易に栄養要
求性株を検出することができる。 検出した栄養要求性株をついでマスタープレー
トから釣菌して他の菌体から分離する。こうし
て、所望の凝集性を有する酵母を得る。 上記一連の製造過程において、培地および培養
条件は、前述した酵母自体の培地および培養条件
と同じである。 IFO―0224はDF値０であつて全く凝集性を示
さない。また、サツカロマイセス・セルビシエに
属する酵母は、下記表２に示すごとき諸性質（発
酵性および資化性の有無、生理的性質）を有す
る。
【表】
表２中、ラフイノースの発酵性は、結合部が切
断されて生じる構成単糖フラクトース、グルコー
スおよびガラクトースのうちいくつの糖を発酵で
きるかにより表示される。すなわち、発酵性1/3
とはフラクトースのみを発酵する場合を、発酵性
２／３とはフラクトースおよびグルコースを発酵す
る場合を、および発酵性3/3とはすべての構成単
糖を発酵する場合をそれぞれ意味する。 なお、サツカロマイセス（Saccharomyces）
属に属する酵母は下記のような菌学的性質を有す
ることが知られている（J.Lodder著「The
Yeasts，Ａ Taxonomic Study」第２版、
North―Holland Publishing社発行、1970年）。 すなわち、この属に属する酵母は、 ・ 多極出芽によつて増殖する。 ・ 子のう胞子を形成する。 ・ 硝酸塩を資化しない。 ・ 真菌糸を欠くかまたはわずかしか形成しな
い。 ・ 成熟子のうは容易に開裂しない。 ・ 胞子の形状は球形ないし卵形である。 ・ グルコースをよく発酵する。 ・ 麦芽汁培地に皮膜を形成しない。 発明の効果 この発明は以上のとおり構成されているので、
野生株以上に優れた凝集性を有しかつアルコール
発酵能においても申し分のない新規酵母を得るこ
とができる。したがつてこうして得られた凝集性
酵母を用いてアルコール発酵を行なうことによ
り、冒頭で説明したように回分発酵においても連
続発酵においてもアルコール発酵槽内の菌体濃度
を高く維持して、エタノールの生産性を大幅に向
上することができる。 実施例 つぎにこの発明の実施例を示し、上記効果を実
証する。 製造例 (a) RM―17の調整 凝集性を有しない酵母サツカロマイセス・セル
ビシエ（Saccharomyces cerevisias）IFO―
0224をYPG寒天培地（注２）で30℃で24時間培
養し、ついで胞子形成寒天培地（注３）に塗抹
し、30℃で３〜５日間培養を行なつた。こうして
胞子を形成させた。 ついで胞子数が107個／mlになるように、子の
うを無菌水１mlに懸濁させ、集菌後リン酸緩衝液
（注４）で洗浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶
液（注５）２ml中で30℃で１時間振蘯して、子の
うを溶解させた。ついで集菌後、遊離した胞子を
無菌水１mlで洗浄してリン酸緩衝液３mlに懸濁さ
せた。 この懸濁液に変異誘起剤としてエチルメタンス
ルホネートを0.1ml添加し、懸濁液を30℃で２時
間振蘯した。こうして胞子を変異処理した。つい
で集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液0.2mlに懸濁
させ、懸濁液に５％チオ硫酸ナトリウム水溶液３
mlを添加して、懸濁液を30℃で10分間振蘯した。
こうして変異誘起剤を中和した。 集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液１mlで２回洗
浄して同緩衝液５mlに懸濁させ、懸濁液を氷冷下
に３分間超音波処理することにより変異胞子を懸
濁液中に分散させた。ついで集菌後、懸濁液を集
菌水で濃度1/105〜1/106に希釈し、希釈懸濁液
0.1mlをYPG寒天培地（注２）に塗抹して30℃で
48時間培養し、単独胞子由来の集落を得た。 こうして得られた集落のプレートをマスタープ
レートとしてレプリカ法により変異株の検出を行
なつた。すなわち、殺菌したベルベツト布地を用
いて、前記マスタープレートの集落を最小培地
（注６）にレプリカし、同培地で30℃で４日間培
養し、最小培地で増殖できない菌株をマスタープ
レートにおいて検出し、これを栄養要求性変異株
としてマスタープレートから釣菌した。 その結果マスタープレートの菌株25株のうち凝
集性に優れた株サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）RM―17（微工研
菌寄第7770号）を得た。この株はアデニンおよび
ヒスチジン要求性の菌株であつた。 (b) VM―２の調製 工業技術院微生物工業技術研究所応用技術部生
物化学工学研究室から分譲を受けた凝集性を有し
ない酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）EY―１（微工研菌
寄第7793号）をRM―17の調製と同じ操作で変異
処理し、レプリカ法によりイソロイシンおよびバ
リン要求性の栄養要求性変異株として酵母サツカ
ロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）VM―２（微工研菌寄第7788号）を得
た。 (c) RM―17とVM―２のプロトプラスト融合 RM―17をYPD培地10mlで30℃で16時間振蘯
培養し、集菌後無菌水１mlで洗浄した。ついでこ
れをプロトプラスト調製液（注７）約２mlに懸濁
させ、懸濁液を30℃で１時間振蘯し、集菌後等張
液（注８）１mlで２回洗浄を行なつた。 VM―２についても上記と同じ操作で処理を行
なつた。 ついでこうして得られたRM―17の処理菌体と
VM―２の処理菌体とを同量（細胞数108個／ml
ずつ）とつて混合し、集菌後混合物を等張液0.1
mlに懸濁させ、懸濁液にポリエチレングリコール
水溶液（注９）２mlを添加した。この懸濁液を30
℃で15分間静置してプロトプラスト融合を完結し
た。ついで集菌後、菌体を等張液１mlに懸濁し、
懸濁液を20℃で15分間静置した。ついで懸濁液を
等張液で濃度1/10〜1/102に希釈し、希釈懸濁液
を最小培地（注６）に塗抹し、重層用培地（注
10）を重層した。この状態で30℃で４日間培養を
行ない、優れた凝集性を有する融合株を22株分離
し、そのうちの１株を酵母サツカロマイセス
（Saccharomyces）FRM17VM2―１（微工研菌寄第
7792号）とした。 なお、プロトプラスト融合に用いた両親株
（RM―17とVM―25は上記最小培地に生育でき
なかつた。 凝集性およびアルコール発酵能の測定 IFO―2018，IFO―0224，RM―17，EY―１，
VM―２およびFRM17VM2―１について、それぞ
れ凝集性の程度を示すDF値およびアルコール発
酵能を測定した。 DF値は前述した方法で求めた。 またアルコール発酵能は下記の方法で求めた。
すなわち沖縄産の廃糖蜜340ｇ／に硫酸アンモ
ニウム3.4ｇ／とピロ亜硫酸カリウム0.2ｇ／
とを混合溶解した後、硫酸でPHを4.5に調整し、
混合物を3000回転／分で10分間遠心分離機にかけ
た。こうして得られた上澄液を70mlずつとり、各
液にそれぞれ菌株の前培養液を７ml加え、これら
を30℃で間欠攪拌（30秒間撹拌と10分間静置の反
復）して回分培養を行ない、24時間後および48時
間後の各培養液についてそれぞれエタノール生成
量をガスクロマトグラフイーにより測定した。 測定結果は下記表３のとおりである。
断されて生じる構成単糖フラクトース、グルコー
スおよびガラクトースのうちいくつの糖を発酵で
きるかにより表示される。すなわち、発酵性1/3
とはフラクトースのみを発酵する場合を、発酵性
２／３とはフラクトースおよびグルコースを発酵す
る場合を、および発酵性3/3とはすべての構成単
糖を発酵する場合をそれぞれ意味する。 なお、サツカロマイセス（Saccharomyces）
属に属する酵母は下記のような菌学的性質を有す
ることが知られている（J.Lodder著「The
Yeasts，Ａ Taxonomic Study」第２版、
North―Holland Publishing社発行、1970年）。 すなわち、この属に属する酵母は、 ・ 多極出芽によつて増殖する。 ・ 子のう胞子を形成する。 ・ 硝酸塩を資化しない。 ・ 真菌糸を欠くかまたはわずかしか形成しな
い。 ・ 成熟子のうは容易に開裂しない。 ・ 胞子の形状は球形ないし卵形である。 ・ グルコースをよく発酵する。 ・ 麦芽汁培地に皮膜を形成しない。 発明の効果 この発明は以上のとおり構成されているので、
野生株以上に優れた凝集性を有しかつアルコール
発酵能においても申し分のない新規酵母を得るこ
とができる。したがつてこうして得られた凝集性
酵母を用いてアルコール発酵を行なうことによ
り、冒頭で説明したように回分発酵においても連
続発酵においてもアルコール発酵槽内の菌体濃度
を高く維持して、エタノールの生産性を大幅に向
上することができる。 実施例 つぎにこの発明の実施例を示し、上記効果を実
証する。 製造例 (a) RM―17の調整 凝集性を有しない酵母サツカロマイセス・セル
ビシエ（Saccharomyces cerevisias）IFO―
0224をYPG寒天培地（注２）で30℃で24時間培
養し、ついで胞子形成寒天培地（注３）に塗抹
し、30℃で３〜５日間培養を行なつた。こうして
胞子を形成させた。 ついで胞子数が107個／mlになるように、子の
うを無菌水１mlに懸濁させ、集菌後リン酸緩衝液
（注４）で洗浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶
液（注５）２ml中で30℃で１時間振蘯して、子の
うを溶解させた。ついで集菌後、遊離した胞子を
無菌水１mlで洗浄してリン酸緩衝液３mlに懸濁さ
せた。 この懸濁液に変異誘起剤としてエチルメタンス
ルホネートを0.1ml添加し、懸濁液を30℃で２時
間振蘯した。こうして胞子を変異処理した。つい
で集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液0.2mlに懸濁
させ、懸濁液に５％チオ硫酸ナトリウム水溶液３
mlを添加して、懸濁液を30℃で10分間振蘯した。
こうして変異誘起剤を中和した。 集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液１mlで２回洗
浄して同緩衝液５mlに懸濁させ、懸濁液を氷冷下
に３分間超音波処理することにより変異胞子を懸
濁液中に分散させた。ついで集菌後、懸濁液を集
菌水で濃度1/105〜1/106に希釈し、希釈懸濁液
0.1mlをYPG寒天培地（注２）に塗抹して30℃で
48時間培養し、単独胞子由来の集落を得た。 こうして得られた集落のプレートをマスタープ
レートとしてレプリカ法により変異株の検出を行
なつた。すなわち、殺菌したベルベツト布地を用
いて、前記マスタープレートの集落を最小培地
（注６）にレプリカし、同培地で30℃で４日間培
養し、最小培地で増殖できない菌株をマスタープ
レートにおいて検出し、これを栄養要求性変異株
としてマスタープレートから釣菌した。 その結果マスタープレートの菌株25株のうち凝
集性に優れた株サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）RM―17（微工研
菌寄第7770号）を得た。この株はアデニンおよび
ヒスチジン要求性の菌株であつた。 (b) VM―２の調製 工業技術院微生物工業技術研究所応用技術部生
物化学工学研究室から分譲を受けた凝集性を有し
ない酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）EY―１（微工研菌
寄第7793号）をRM―17の調製と同じ操作で変異
処理し、レプリカ法によりイソロイシンおよびバ
リン要求性の栄養要求性変異株として酵母サツカ
ロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）VM―２（微工研菌寄第7788号）を得
た。 (c) RM―17とVM―２のプロトプラスト融合 RM―17をYPD培地10mlで30℃で16時間振蘯
培養し、集菌後無菌水１mlで洗浄した。ついでこ
れをプロトプラスト調製液（注７）約２mlに懸濁
させ、懸濁液を30℃で１時間振蘯し、集菌後等張
液（注８）１mlで２回洗浄を行なつた。 VM―２についても上記と同じ操作で処理を行
なつた。 ついでこうして得られたRM―17の処理菌体と
VM―２の処理菌体とを同量（細胞数108個／ml
ずつ）とつて混合し、集菌後混合物を等張液0.1
mlに懸濁させ、懸濁液にポリエチレングリコール
水溶液（注９）２mlを添加した。この懸濁液を30
℃で15分間静置してプロトプラスト融合を完結し
た。ついで集菌後、菌体を等張液１mlに懸濁し、
懸濁液を20℃で15分間静置した。ついで懸濁液を
等張液で濃度1/10〜1/102に希釈し、希釈懸濁液
を最小培地（注６）に塗抹し、重層用培地（注
10）を重層した。この状態で30℃で４日間培養を
行ない、優れた凝集性を有する融合株を22株分離
し、そのうちの１株を酵母サツカロマイセス
（Saccharomyces）FRM17VM2―１（微工研菌寄第
7792号）とした。 なお、プロトプラスト融合に用いた両親株
（RM―17とVM―25は上記最小培地に生育でき
なかつた。 凝集性およびアルコール発酵能の測定 IFO―2018，IFO―0224，RM―17，EY―１，
VM―２およびFRM17VM2―１について、それぞ
れ凝集性の程度を示すDF値およびアルコール発
酵能を測定した。 DF値は前述した方法で求めた。 またアルコール発酵能は下記の方法で求めた。
すなわち沖縄産の廃糖蜜340ｇ／に硫酸アンモ
ニウム3.4ｇ／とピロ亜硫酸カリウム0.2ｇ／
とを混合溶解した後、硫酸でPHを4.5に調整し、
混合物を3000回転／分で10分間遠心分離機にかけ
た。こうして得られた上澄液を70mlずつとり、各
液にそれぞれ菌株の前培養液を７ml加え、これら
を30℃で間欠攪拌（30秒間撹拌と10分間静置の反
復）して回分培養を行ない、24時間後および48時
間後の各培養液についてそれぞれエタノール生成
量をガスクロマトグラフイーにより測定した。 測定結果は下記表３のとおりである。
【表】
表３から明らかなように、RM―17およびVM
―２は変異株であるため、アルコール発酵能は野
生型の親株の発酵能より劣るが、融合株である
FRM17VM2―１は野生株以上に優れた凝集性を有
しかつアルコール発酵能においても野生株と比べ
て遜色がない。 使用例（アルコール連続発酵） FRM17VM2―１を用いてつぎの操作によりアル
コール連続発酵を行ない、そのアルコール発酵能
を調べた。 発酵装置として、第１図に示すアルコール発酵
装置を用いた。これは実容積700mlのガラス製流
動層型発酵槽１を主体とし、温度制御およびPH制
御できるように構成されている。そして発酵原料
はポンプ２によつて同槽１の底部に供給され、反
応液はポンプ３で同槽の頂部から底部に戻され、
槽頂の菌体沈降部４から流出するようになつてい
る。 500ml坂口フラスコにおいてYPG培地（注１）
100mlを調整し、これを温度121℃で10分間殺菌し
た後、YPG寒天斜面培地（注２）に保存した
FRM17VM2―１株を１白菌耳植菌し、30℃で１夜
培養した。こうして活性なFRM17VM2―１の前培
養液を得た。 フイリピン産廃糖蜜培地（注11）700mlが入つ
ている発酵槽１に上記前培養液100mlを入れ、発
酵温度30℃で８時間回分培養を行なつた。ついで
上記廃糖蜜培地を発酵槽１に流量35ml／時（希釈
率＝0.05時-1）で連続的に供給し、培地の供給量
を徐々に増加ていつて連続発酵を行なつた。 その結果、培地供給量を175ml／時（希釈率＝
0.25時-1）に増加しても、本酵母の優れた凝集性
により、槽内に直径１〜４mmのフロツクが形成さ
れて、槽内の菌体濃度（注12）は47ｇ／という
高い値に維持された。また産生アルコールは61
ｇ／という高い濃度で得られ、アルコール生産
性（注13）は第２図に示すように16ｇ／・時と
いう高い値に達した。 比較例 酵母としてFRM17VM2―１の代わりにEY―１を
用い、その他の事項を上記使用例と同じにして、
上記操作を繰返した。 その結果、培地供給量が70ml／時（希釈率＝
0.1時-1）を超えると、アルコール生産性（注13）
は第２図に示すように４ｇ／・時から急激に低
下した。 培地および試薬 培地および試薬はそれぞれつぎのとおりであ
る。 （注１） YPG培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ （注２） YPG寒天培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グリコース 20ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注３） 胞子形成培地 酢酸ナトリウム ５ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注４） リン酸緩衝液 0.1Mリン酸緩衝液 PH＝7.5 （注５） 溶菌酵素溶液 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にザイモリア
ーゼ20T（生化学工業社製）を0.05％溶か
した溶液２mlと、２―メルカプトエタノー
ル1.4μとの混合液 （注６） 最小培地 Difco―Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注７） プロトプラスト調製液 1.5M塩化カリウム0.8mlと、２／15Mリン
酸緩衝液（PH7.5）1.0mlと、２―メルカプ
トエタノール1.4μと、ザイモリアーゼ
20T（生化学工業社製）を0.1Mリン緩衝液
（PH7.5）に0.25％溶かした溶液0.2mlとの混
合物 （注８） 等張液 0.6M塩化カリウム水溶液 （注９） ポリエチレングリコール水溶液 塩化カルシウム 5.6ｇ／ ポリエチレングリコール（PEG―6000）
300ｇ／ （注10） 重層用培地 グルコース 20ｇ／ Difco―Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ Difco―Bact Agar（Difco社製） 30ｇ／ （注11） フイリピン産廃糖蜜培地 フイリピン産廃糖蜜 280ｇ／ 硫酸アンモニウム 2.8ｇ／ ピロ亜硫酸カリウム 0.5ｇ／ 消泡剤 0.2ｇ／ とよりなる混合液を硫酸でPH4.5に調整したもの （注12） 菌体濃度 発酵槽内の培養液を一定量とり、遠心分離
機で菌体を集め、洗浄後、これを温度800
℃で燃焼し、焼失した重量を菌体量として
算出したもの （注13） アルコール生産性 培養液１当り１時間に生産されるアルコ
ールの重量（ｇ）
―２は変異株であるため、アルコール発酵能は野
生型の親株の発酵能より劣るが、融合株である
FRM17VM2―１は野生株以上に優れた凝集性を有
しかつアルコール発酵能においても野生株と比べ
て遜色がない。 使用例（アルコール連続発酵） FRM17VM2―１を用いてつぎの操作によりアル
コール連続発酵を行ない、そのアルコール発酵能
を調べた。 発酵装置として、第１図に示すアルコール発酵
装置を用いた。これは実容積700mlのガラス製流
動層型発酵槽１を主体とし、温度制御およびPH制
御できるように構成されている。そして発酵原料
はポンプ２によつて同槽１の底部に供給され、反
応液はポンプ３で同槽の頂部から底部に戻され、
槽頂の菌体沈降部４から流出するようになつてい
る。 500ml坂口フラスコにおいてYPG培地（注１）
100mlを調整し、これを温度121℃で10分間殺菌し
た後、YPG寒天斜面培地（注２）に保存した
FRM17VM2―１株を１白菌耳植菌し、30℃で１夜
培養した。こうして活性なFRM17VM2―１の前培
養液を得た。 フイリピン産廃糖蜜培地（注11）700mlが入つ
ている発酵槽１に上記前培養液100mlを入れ、発
酵温度30℃で８時間回分培養を行なつた。ついで
上記廃糖蜜培地を発酵槽１に流量35ml／時（希釈
率＝0.05時-1）で連続的に供給し、培地の供給量
を徐々に増加ていつて連続発酵を行なつた。 その結果、培地供給量を175ml／時（希釈率＝
0.25時-1）に増加しても、本酵母の優れた凝集性
により、槽内に直径１〜４mmのフロツクが形成さ
れて、槽内の菌体濃度（注12）は47ｇ／という
高い値に維持された。また産生アルコールは61
ｇ／という高い濃度で得られ、アルコール生産
性（注13）は第２図に示すように16ｇ／・時と
いう高い値に達した。 比較例 酵母としてFRM17VM2―１の代わりにEY―１を
用い、その他の事項を上記使用例と同じにして、
上記操作を繰返した。 その結果、培地供給量が70ml／時（希釈率＝
0.1時-1）を超えると、アルコール生産性（注13）
は第２図に示すように４ｇ／・時から急激に低
下した。 培地および試薬 培地および試薬はそれぞれつぎのとおりであ
る。 （注１） YPG培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ （注２） YPG寒天培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グリコース 20ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注３） 胞子形成培地 酢酸ナトリウム ５ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注４） リン酸緩衝液 0.1Mリン酸緩衝液 PH＝7.5 （注５） 溶菌酵素溶液 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にザイモリア
ーゼ20T（生化学工業社製）を0.05％溶か
した溶液２mlと、２―メルカプトエタノー
ル1.4μとの混合液 （注６） 最小培地 Difco―Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒 天 20ｇ／ （注７） プロトプラスト調製液 1.5M塩化カリウム0.8mlと、２／15Mリン
酸緩衝液（PH7.5）1.0mlと、２―メルカプ
トエタノール1.4μと、ザイモリアーゼ
20T（生化学工業社製）を0.1Mリン緩衝液
（PH7.5）に0.25％溶かした溶液0.2mlとの混
合物 （注８） 等張液 0.6M塩化カリウム水溶液 （注９） ポリエチレングリコール水溶液 塩化カルシウム 5.6ｇ／ ポリエチレングリコール（PEG―6000）
300ｇ／ （注10） 重層用培地 グルコース 20ｇ／ Difco―Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ Difco―Bact Agar（Difco社製） 30ｇ／ （注11） フイリピン産廃糖蜜培地 フイリピン産廃糖蜜 280ｇ／ 硫酸アンモニウム 2.8ｇ／ ピロ亜硫酸カリウム 0.5ｇ／ 消泡剤 0.2ｇ／ とよりなる混合液を硫酸でPH4.5に調整したもの （注12） 菌体濃度 発酵槽内の培養液を一定量とり、遠心分離
機で菌体を集め、洗浄後、これを温度800
℃で燃焼し、焼失した重量を菌体量として
算出したもの （注13） アルコール生産性 培養液１当り１時間に生産されるアルコ
ールの重量（ｇ）
第１図は連続発酵のフローシート、第２図は希
釈率とアルコール生産性の関係を示すグラフであ
る。
釈率とアルコール生産性の関係を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ・ DF値５なる凝集性を有し、 ・ 廃糖蜜340ｇ／と硫酸アンモニウムとピ
ロ亜硫酸カリウムのPH4.5の混合液を遠心分
離し、得られた上澄液の70mlに菌株の前培養
液７mlを加えて、回分培養を行なうことによ
り、24時間後および48時間後にそれぞれ55.7
ｇ／および56.0ｇ／のエタノールを生成
する 酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae） FRM17VM2―１（微工研菌寄第7792号）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59230899A JPS61108379A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 新規凝集性酵母 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59230899A JPS61108379A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 新規凝集性酵母 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61108379A JPS61108379A (ja) | 1986-05-27 |
| JPH0121758B2 true JPH0121758B2 (ja) | 1989-04-24 |
Family
ID=16915040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59230899A Granted JPS61108379A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 新規凝集性酵母 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61108379A (ja) |
-
1984
- 1984-10-31 JP JP59230899A patent/JPS61108379A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61108379A (ja) | 1986-05-27 |
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