JPH0121757B2 - - Google Patents
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- JPH0121757B2 JPH0121757B2 JP59230897A JP23089784A JPH0121757B2 JP H0121757 B2 JPH0121757 B2 JP H0121757B2 JP 59230897 A JP59230897 A JP 59230897A JP 23089784 A JP23089784 A JP 23089784A JP H0121757 B2 JPH0121757 B2 JP H0121757B2
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- yeast
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- flocculating
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
産業上の利用分野
この発明は、優れた凝集性を有する新規酵母に
関するものである。 近年、石油代替エネルギーとして、石油化学に
よらずに得られる発酵アルコールが注目されてい
る。これはさとうきびやこれから採つた糖蜜、さ
つまいも、じやがいも、とうもろこしなどのセル
ロース質またはでん粉質を原料とし、これらを微
生物の働きによつて発酵させることにより製造さ
れる。 一般にアルコール発酵では、アルコールの生産
性は発酵槽内の菌体濃度に比例する。そこで発酵
槽内の菌体濃度を高める手段として、優れた凝集
性を有する酵母を用いることが考えられる。すな
わち、酵母が優れた凝集性を有していると、酵母
の沈降速度が速くなり、そのため固液分離が迅速
かつ容易になし得る。そして例えば回分発酵にお
いては、発酵液を単に静置するだけで菌体を沈降
堆積させることができ、発酵液と菌体の分離を容
易に行なつて菌体を再使用に供することができ
る。また連続発酵においては、小径の流動部とこ
れの上に連設された菌体沈降用の大径の沈降部と
これに内装された菌体沈降部材とを主体とした塔
型発酵槽を用いることにより、培地の供給量が増
大しても菌体を沈降させてその流出を防止するこ
とができる。このように凝集性を有する酵母を用
いると、凝集性を有しない酵母を用いた場合に比
べて多くの利点があり、そのため新規凝集性酵母
が要望せられている。 従来技術およびその問題点 従来から、上記の要望にこたえるべく、凝集性
酵母を取得する試みがなされて来たが、従来の酵
母は自然界から得られた野生株であつて、たとえ
ば土壌を探査し特定の土壌から分離したものであ
つた。 しかしこのように自然界から所望の菌株を見つ
け出して分離する作業は、はなはだ煩わしいもの
であり、また所望の菌株を採取できる確実性の乏
しいものであつた。 この発明は上記のような実情からなされたもの
であつて、優れた凝集性を有しかつ実験室で得る
ことのできる新規凝集性酵母を提供することを目
的とする。 問題点を解決するための手段 この発明は、 ・ DF値４なる凝集性を有し、 ・ 生育にアデニンおよびヒスチジンを要求し、 ・ 球形ないし卵形の形態を成す、 酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）RM―17（微工研
菌寄第7770号）（以下これをRM―17と記す）で
ある。 この明細書において、酵母の凝集性の程度
（Degree of flocculation）は、以下に示すギリ
ランド・テスト（Gilliland test）（European
Journal of Applied Microbiology and
Biotechnology第７巻、第227―234頁、1979年）
により求められたDF値で表示される。すなわち
供試菌株をYPG培地（注１）で30℃で16時間振
盪培養した後、菌体の沈降速度、沈降菌体の容量
および硬さを肉眼観察により対照菌体と比較し、
表１に示すDF値０から５の６段階で凝集の程度
を表示する。
関するものである。 近年、石油代替エネルギーとして、石油化学に
よらずに得られる発酵アルコールが注目されてい
る。これはさとうきびやこれから採つた糖蜜、さ
つまいも、じやがいも、とうもろこしなどのセル
ロース質またはでん粉質を原料とし、これらを微
生物の働きによつて発酵させることにより製造さ
れる。 一般にアルコール発酵では、アルコールの生産
性は発酵槽内の菌体濃度に比例する。そこで発酵
槽内の菌体濃度を高める手段として、優れた凝集
性を有する酵母を用いることが考えられる。すな
わち、酵母が優れた凝集性を有していると、酵母
の沈降速度が速くなり、そのため固液分離が迅速
かつ容易になし得る。そして例えば回分発酵にお
いては、発酵液を単に静置するだけで菌体を沈降
堆積させることができ、発酵液と菌体の分離を容
易に行なつて菌体を再使用に供することができ
る。また連続発酵においては、小径の流動部とこ
れの上に連設された菌体沈降用の大径の沈降部と
これに内装された菌体沈降部材とを主体とした塔
型発酵槽を用いることにより、培地の供給量が増
大しても菌体を沈降させてその流出を防止するこ
とができる。このように凝集性を有する酵母を用
いると、凝集性を有しない酵母を用いた場合に比
べて多くの利点があり、そのため新規凝集性酵母
が要望せられている。 従来技術およびその問題点 従来から、上記の要望にこたえるべく、凝集性
酵母を取得する試みがなされて来たが、従来の酵
母は自然界から得られた野生株であつて、たとえ
ば土壌を探査し特定の土壌から分離したものであ
つた。 しかしこのように自然界から所望の菌株を見つ
け出して分離する作業は、はなはだ煩わしいもの
であり、また所望の菌株を採取できる確実性の乏
しいものであつた。 この発明は上記のような実情からなされたもの
であつて、優れた凝集性を有しかつ実験室で得る
ことのできる新規凝集性酵母を提供することを目
的とする。 問題点を解決するための手段 この発明は、 ・ DF値４なる凝集性を有し、 ・ 生育にアデニンおよびヒスチジンを要求し、 ・ 球形ないし卵形の形態を成す、 酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）RM―17（微工研
菌寄第7770号）（以下これをRM―17と記す）で
ある。 この明細書において、酵母の凝集性の程度
（Degree of flocculation）は、以下に示すギリ
ランド・テスト（Gilliland test）（European
Journal of Applied Microbiology and
Biotechnology第７巻、第227―234頁、1979年）
により求められたDF値で表示される。すなわち
供試菌株をYPG培地（注１）で30℃で16時間振
盪培養した後、菌体の沈降速度、沈降菌体の容量
および硬さを肉眼観察により対照菌体と比較し、
表１に示すDF値０から５の６段階で凝集の程度
を表示する。
【表】
【表】
RM―17は下記の菌学的性質を有する。すなわ
ちRM―17は、 ・ DF値４なる凝集性を有し、液体培養では著
しい沈降性を示す。 ・ 廃糖蜜（たとえば15％の全糖分を含む廃糖
蜜）を発酵し、７〜9vol％のエタノールを生成
する。 ・ 寒天平板上で多少硬い集落を形成する。 ・ 生育にアデニンおよびヒスチジンを要求す
る。 ・ 胞子形成能を有する。 RM―17の培地としては、炭素源、窒素源、無
機イオン、さらに必要ならば有機微量栄養素を含
有する通常の培地が使用できる。炭素源としては
グルコース、ガラクトース、フラクトース、シユ
ークロース、スターチ加水分解物、果汁、セルロ
ース分解物などの炭水化物がよく用いられる。特
に好適な培地は、酵母エキス１ｇ、ポリペプトン
２ｇ、グルコース２ｇ、蒸留水100mlよりなる培
地であり、この培地のPHは無調整で5.5である。 RM―17の培養は温度25〜40℃好ましくは30〜
37℃で、PH3.0〜7.0好ましくはPH3.5〜6.0で行な
われる。 つぎにRM―17の製造法について説明する。 RM―17は、財団法人発酵研究所の保存菌であ
るDF値０の酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）IFO―0224（以下、
単にIFO―0224と記す）を胞子形成処理し、得ら
れた胞子を変異処理し、変異胞子を培養し、得ら
れた集落からレプリカ法によつて変異株を検出
し、これを分離することにより製造される。 胞子形成処理は常法に従つてなされる。通常は
凝集性を有しない酵母をYPG寒天培地（注２）
で培養した後、胞子形成寒天培地（注３）に塗抹
する方法がとられる。また単独胞子由来の細胞を
得るには、酵母細胞壁溶解用の溶菌酵素を用いて
子のうを溶解した後、マイクロマニプユレータを
用いて胞子を分離する方法、または同じく溶菌酵
素で子のうを溶解した後、超音波処理により胞子
を分散させ、胞子を栄養寒天培地で培養する方法
がとられる。 変異処理は、胞子形成により得られた胞子また
は子のうに公知の突然変異処理、たとえば紫外
線、Ｘ線、γ線を照射する物理的方法、エチルメ
タンスルホネート、Ｎ―メチル―N′―ニトロ―
Ｎ―ニトロソグアニジン、４―ニトロキノリン―
Ｎ―オキサイドなどの変異誘起剤を接触した後に
選択培地に生育する化学的方法のいずれによつて
も行なわれるが、エチルメタンスルホネートを用
いる方法が特に好ましい。 変異株の検出はレプリカ法によつて行なう。す
なわち、変異胞子をYPG寒天培地のような完全
培地で培養することによつて得られた集落のプレ
ートをマスタープレートとし、殺菌した布地など
を用いて、同プレート上の集落を所定の栄養要素
を含まない最少培地のプレート上に移し、同培地
でこれを培養する。上記の栄養要素を必要とする
集落は最少培地のプレート上では発育しないの
で、このプレート上の集落とマスタープレート上
の集落とを比較することによつて、容易に栄養要
求性株を検出することができる。 検出した栄養要求性株をついでマスタープレー
トから釣菌して他の菌株から分離する。こうし
て、所望の凝集性を有する酵母を得る。 RM―17の製造過程における培地および培養条
件は、前述したRM―17自体の培地および培養条
件と同じである。 親酵母であるIFO―0224はDF値０であつて全
く凝集性を示さない。また、RM―17，IFO―
0224などのサツカロマイセス・セルビシエに属す
る酵母は、下記表２に示すごとき諸性質（発酵性
および資化性の有無、生理的性質）を有する。
ちRM―17は、 ・ DF値４なる凝集性を有し、液体培養では著
しい沈降性を示す。 ・ 廃糖蜜（たとえば15％の全糖分を含む廃糖
蜜）を発酵し、７〜9vol％のエタノールを生成
する。 ・ 寒天平板上で多少硬い集落を形成する。 ・ 生育にアデニンおよびヒスチジンを要求す
る。 ・ 胞子形成能を有する。 RM―17の培地としては、炭素源、窒素源、無
機イオン、さらに必要ならば有機微量栄養素を含
有する通常の培地が使用できる。炭素源としては
グルコース、ガラクトース、フラクトース、シユ
ークロース、スターチ加水分解物、果汁、セルロ
ース分解物などの炭水化物がよく用いられる。特
に好適な培地は、酵母エキス１ｇ、ポリペプトン
２ｇ、グルコース２ｇ、蒸留水100mlよりなる培
地であり、この培地のPHは無調整で5.5である。 RM―17の培養は温度25〜40℃好ましくは30〜
37℃で、PH3.0〜7.0好ましくはPH3.5〜6.0で行な
われる。 つぎにRM―17の製造法について説明する。 RM―17は、財団法人発酵研究所の保存菌であ
るDF値０の酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）IFO―0224（以下、
単にIFO―0224と記す）を胞子形成処理し、得ら
れた胞子を変異処理し、変異胞子を培養し、得ら
れた集落からレプリカ法によつて変異株を検出
し、これを分離することにより製造される。 胞子形成処理は常法に従つてなされる。通常は
凝集性を有しない酵母をYPG寒天培地（注２）
で培養した後、胞子形成寒天培地（注３）に塗抹
する方法がとられる。また単独胞子由来の細胞を
得るには、酵母細胞壁溶解用の溶菌酵素を用いて
子のうを溶解した後、マイクロマニプユレータを
用いて胞子を分離する方法、または同じく溶菌酵
素で子のうを溶解した後、超音波処理により胞子
を分散させ、胞子を栄養寒天培地で培養する方法
がとられる。 変異処理は、胞子形成により得られた胞子また
は子のうに公知の突然変異処理、たとえば紫外
線、Ｘ線、γ線を照射する物理的方法、エチルメ
タンスルホネート、Ｎ―メチル―N′―ニトロ―
Ｎ―ニトロソグアニジン、４―ニトロキノリン―
Ｎ―オキサイドなどの変異誘起剤を接触した後に
選択培地に生育する化学的方法のいずれによつて
も行なわれるが、エチルメタンスルホネートを用
いる方法が特に好ましい。 変異株の検出はレプリカ法によつて行なう。す
なわち、変異胞子をYPG寒天培地のような完全
培地で培養することによつて得られた集落のプレ
ートをマスタープレートとし、殺菌した布地など
を用いて、同プレート上の集落を所定の栄養要素
を含まない最少培地のプレート上に移し、同培地
でこれを培養する。上記の栄養要素を必要とする
集落は最少培地のプレート上では発育しないの
で、このプレート上の集落とマスタープレート上
の集落とを比較することによつて、容易に栄養要
求性株を検出することができる。 検出した栄養要求性株をついでマスタープレー
トから釣菌して他の菌株から分離する。こうし
て、所望の凝集性を有する酵母を得る。 RM―17の製造過程における培地および培養条
件は、前述したRM―17自体の培地および培養条
件と同じである。 親酵母であるIFO―0224はDF値０であつて全
く凝集性を示さない。また、RM―17，IFO―
0224などのサツカロマイセス・セルビシエに属す
る酵母は、下記表２に示すごとき諸性質（発酵性
および資化性の有無、生理的性質）を有する。
【表】
【表】
表２中、ラフイノースの発酵性は、結合部が切
断されて生じる構成単糖フラクトース、グルコー
スおよびガラクトースのうちいくつの糖を発酵で
きるかにより表示される。すなわち、発酵性1/3
とはフラクトースのみを発酵する場合を、発酵性
２／３とはフラクトースおよびグルコースを発酵す
る場合を、および発酵性3/3とはすべての構成単
糖を発酵する場合をそれぞれ意味する。 なお、サツカロマイセス（Saccharomyces）
属に属する酵母は下記のような菌学的性質を有す
ることが知られている（J.Lodder著「The
Yeasts，Ａ Taxonomic Study」第２版、
North―Holland Publishing社発行、1970年）。 すなわち、この属に属する酵母は、 ・ 多極出芽によつて増殖する。 ・ 子のう胞子を形成する。 ・ 硝酸塩を資化しない。 ・ 真菌糸を欠くかまたはわずかしか形成しな
い。 ・ 成熟子のうは容易に開裂しない。 ・ 胞子の形状は球形ないし卵形である。 ・ グルコースをよく発酵する。 ・ 麦芽汁培地に皮膜を形成しない。 発明の効果 この発明は以上のとおり構成されているので、
優れた凝集性を有する新規酵母を実験室において
創製することができる。したがつて従来のように
自然界から所望の菌株を見つけ出して土壌から分
離するといつた煩わしい作業が必要でない上に、
所望の凝集性酵母を確実に製造することができ
る。そしてこうして得られた凝集性酵母を用いて
アルコール発酵を行なうことにより、冒頭で説明
したように回分発酵においても連続発酵において
もアルコール発酵槽内の菌体濃度を高く維持し
て、エタノールの生産性を大幅に向上することが
できる。 実施例 つぎにこの発明の実施例を示し、上記効果を実
証する。 ａ 製造例 凝集性を有しない酵母サツカロマイセス・セル
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）IFO―
0224をYPG寒天培地（注２）で30℃で24時間培
養し、ついで胞子形成寒天培地（注３）に塗抹
し、30℃で３〜５日間培養を行なつた。こうして
胞子を形成させた。 ついで胞子数が107個／mlになるように、子の
うを無菌水１mlに懸濁させ、集菌後リン酸緩衝液
（注４）で洗浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶
液（注５）２ml中で30℃で１時間振盪して、子の
うを溶解させた。ついで集菌後、遊離した胞子を
無菌水１mlで洗浄してリン酸緩衝液３mlに懸濁さ
せた。 この懸濁液に変異誘起剤としてエチルメタンス
ルホネートを0.1ml添加し、懸濁液を30℃で２時
間振盪した。こうして胞子を変異処理した。つい
で集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液0.2mlに懸濁
させ、懸濁液に５％チオ硫酸ナトリウム水溶液３
mlを添加して、懸濁液を30℃で10分間振盪した。
こうして変異誘起剤を中和した。 集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液１mlで２回洗
浄して同緩衝液５mlに懸濁させ、懸濁液を氷冷下
に３分間超音波処理することにより変異胞子を懸
濁液中に分散させた。ついで集菌後、懸濁液を無
菌水で濃度1/105〜1/106に希釈し、希釈懸濁液
0.1mlをYPG寒天培地（注２）に塗抹して30℃で
48時間培養し、単独胞子由来の集落を得た。 こうして得られた集落のプレートをマスタープ
レートとしてレプリカ法により変異株の検出を行
なつた。すなわち、殺菌したベルベツト布地を用
いて、前記マスタープレートの集落を最小培地
（注６）にレプリカし、同培地で30℃で４日間培
養し、最小培地で増殖できない菌株をマスタープ
レートにおいて検出し、これを栄養要求性変異株
としてマスタープレートから釣菌した。 その結果マスタープレートの菌株25株のうち凝
集性に優れた株サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）RM―17（微工研
菌寄第7770号）を得た。この株はアデニンおよび
ヒスチジン要求性の菌株であつた。 ｂ 凝集性の測定 こうして得られたRM―17について凝集性の程
度すなわちDF値を前述の方法により測定したと
ころ、DF値は４であつた。 ｃ 使用例 （アルコール連続発酵） RM―17を用いてつぎの操作によりアルコール
連続発酵を行ない、そのアルコール発酵能を調べ
た。 発酵装置として、第１図に示すアルコール発酵
装置を用いた。これは実容積700mlのガラス製流
動層型発酵槽１を主体とし、温度制御およびPH制
御できるように構成されている。そして発酵原料
はポンプ２によつて同槽１の底部に供給され、反
応液はポンプ３で同槽の頂部から底部に戻され、
槽頂の菌体沈降部４から流出するようになつてい
る。 500ml坂口フラスコにおいてYPG培地（注１）
100mlを調整し、これを温度121℃で10分間殺菌し
た後、YPG寒天斜面培地（注２）に保存した
RM―17株を１白菌耳植菌し、30℃で１夜培養し
た。こうして活性なRM―17の前培養液を得た。 フイリピン産廃糖蜜培地（注７）700mlが入つ
ている発酵槽１に上記前培養液100mlを入れ、発
酵温度30℃で８時間回分培養を行なつた。ついで
上記廃糖蜜培地を発酵槽１に流量35ml／時（希釈
率＝0.05時-1）で連続的に供給し、培地の供給量
を徐々に増加ていつて連続発酵を行なつた。 その結果、培地供給量を175ml／時（希釈率＝
0.25時-1）に増加しても、RM―17の優れた凝集
性により、槽内に直径１〜４mmのフロツクが形成
されて、槽内の菌体濃度（注８）は47ｇ／とい
う高い値に維持された。また産生アルコールは61
ｇ／という高い濃度で得られ、アルコール生産
性（注９）は第２図に示すように14ｇ／・時と
いう高い値に達した。 ｄ 比較例 酵母としてRM―17の代わりにIFO―0224を用
い、その他の事項を上記使用例と同じにして、上
記操作を繰返した。 その結果、培地供給量が70ml／時（希釈率＝
0.1時-1）を超えると、アルコール生産性（注９）
は第２図に示すように４ｇ／・時から急激に低
下した。 ｅ 培地および試薬 培地および試薬はそれぞれつぎのとおりであ
る。 （注１） YPG培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ （注２） YPG寒天培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒天 20ｇ／ （注３） 胞子形成培地 酢酸ナトリウム ５ｇ／ 寒天 20ｇ／ （注４） リン酸緩衝液 0.1Mリン酸緩衝液 PH＝7.5 （注５） 溶菌酵素溶液 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にザイモリアーゼ
20T（生化学工業社製）を0.05％溶かした溶液２
mlと、２―メルカプトエタノール1.4μとの混合
液。 （注６） 最小培地 Difco―Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒天 20ｇ／ （注７） フイリピン産廃糖蜜培地 フイリピン産廃糖蜜 280ｇ／ 硫酸アンモニウム 2.8ｇ／ ピロ亜硫酸カリウム 0.5ｇ／ 消泡剤 0.2ｇ／ とよりなる混合液を硫酸でPH4.5に調整したもの。 （注８） 菌体濃度 発酵槽内の培養液を一定量とり、遠心分離機で
菌体を集め、洗浄後、これを温度800℃で燃焼し、
焼失した重量を菌体量として算出したもの。 （注９） アルコール生産性 培養液１当り１時間に生産されるアルコール
の重量（ｇ）。
断されて生じる構成単糖フラクトース、グルコー
スおよびガラクトースのうちいくつの糖を発酵で
きるかにより表示される。すなわち、発酵性1/3
とはフラクトースのみを発酵する場合を、発酵性
２／３とはフラクトースおよびグルコースを発酵す
る場合を、および発酵性3/3とはすべての構成単
糖を発酵する場合をそれぞれ意味する。 なお、サツカロマイセス（Saccharomyces）
属に属する酵母は下記のような菌学的性質を有す
ることが知られている（J.Lodder著「The
Yeasts，Ａ Taxonomic Study」第２版、
North―Holland Publishing社発行、1970年）。 すなわち、この属に属する酵母は、 ・ 多極出芽によつて増殖する。 ・ 子のう胞子を形成する。 ・ 硝酸塩を資化しない。 ・ 真菌糸を欠くかまたはわずかしか形成しな
い。 ・ 成熟子のうは容易に開裂しない。 ・ 胞子の形状は球形ないし卵形である。 ・ グルコースをよく発酵する。 ・ 麦芽汁培地に皮膜を形成しない。 発明の効果 この発明は以上のとおり構成されているので、
優れた凝集性を有する新規酵母を実験室において
創製することができる。したがつて従来のように
自然界から所望の菌株を見つけ出して土壌から分
離するといつた煩わしい作業が必要でない上に、
所望の凝集性酵母を確実に製造することができ
る。そしてこうして得られた凝集性酵母を用いて
アルコール発酵を行なうことにより、冒頭で説明
したように回分発酵においても連続発酵において
もアルコール発酵槽内の菌体濃度を高く維持し
て、エタノールの生産性を大幅に向上することが
できる。 実施例 つぎにこの発明の実施例を示し、上記効果を実
証する。 ａ 製造例 凝集性を有しない酵母サツカロマイセス・セル
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）IFO―
0224をYPG寒天培地（注２）で30℃で24時間培
養し、ついで胞子形成寒天培地（注３）に塗抹
し、30℃で３〜５日間培養を行なつた。こうして
胞子を形成させた。 ついで胞子数が107個／mlになるように、子の
うを無菌水１mlに懸濁させ、集菌後リン酸緩衝液
（注４）で洗浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶
液（注５）２ml中で30℃で１時間振盪して、子の
うを溶解させた。ついで集菌後、遊離した胞子を
無菌水１mlで洗浄してリン酸緩衝液３mlに懸濁さ
せた。 この懸濁液に変異誘起剤としてエチルメタンス
ルホネートを0.1ml添加し、懸濁液を30℃で２時
間振盪した。こうして胞子を変異処理した。つい
で集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液0.2mlに懸濁
させ、懸濁液に５％チオ硫酸ナトリウム水溶液３
mlを添加して、懸濁液を30℃で10分間振盪した。
こうして変異誘起剤を中和した。 集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液１mlで２回洗
浄して同緩衝液５mlに懸濁させ、懸濁液を氷冷下
に３分間超音波処理することにより変異胞子を懸
濁液中に分散させた。ついで集菌後、懸濁液を無
菌水で濃度1/105〜1/106に希釈し、希釈懸濁液
0.1mlをYPG寒天培地（注２）に塗抹して30℃で
48時間培養し、単独胞子由来の集落を得た。 こうして得られた集落のプレートをマスタープ
レートとしてレプリカ法により変異株の検出を行
なつた。すなわち、殺菌したベルベツト布地を用
いて、前記マスタープレートの集落を最小培地
（注６）にレプリカし、同培地で30℃で４日間培
養し、最小培地で増殖できない菌株をマスタープ
レートにおいて検出し、これを栄養要求性変異株
としてマスタープレートから釣菌した。 その結果マスタープレートの菌株25株のうち凝
集性に優れた株サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）RM―17（微工研
菌寄第7770号）を得た。この株はアデニンおよび
ヒスチジン要求性の菌株であつた。 ｂ 凝集性の測定 こうして得られたRM―17について凝集性の程
度すなわちDF値を前述の方法により測定したと
ころ、DF値は４であつた。 ｃ 使用例 （アルコール連続発酵） RM―17を用いてつぎの操作によりアルコール
連続発酵を行ない、そのアルコール発酵能を調べ
た。 発酵装置として、第１図に示すアルコール発酵
装置を用いた。これは実容積700mlのガラス製流
動層型発酵槽１を主体とし、温度制御およびPH制
御できるように構成されている。そして発酵原料
はポンプ２によつて同槽１の底部に供給され、反
応液はポンプ３で同槽の頂部から底部に戻され、
槽頂の菌体沈降部４から流出するようになつてい
る。 500ml坂口フラスコにおいてYPG培地（注１）
100mlを調整し、これを温度121℃で10分間殺菌し
た後、YPG寒天斜面培地（注２）に保存した
RM―17株を１白菌耳植菌し、30℃で１夜培養し
た。こうして活性なRM―17の前培養液を得た。 フイリピン産廃糖蜜培地（注７）700mlが入つ
ている発酵槽１に上記前培養液100mlを入れ、発
酵温度30℃で８時間回分培養を行なつた。ついで
上記廃糖蜜培地を発酵槽１に流量35ml／時（希釈
率＝0.05時-1）で連続的に供給し、培地の供給量
を徐々に増加ていつて連続発酵を行なつた。 その結果、培地供給量を175ml／時（希釈率＝
0.25時-1）に増加しても、RM―17の優れた凝集
性により、槽内に直径１〜４mmのフロツクが形成
されて、槽内の菌体濃度（注８）は47ｇ／とい
う高い値に維持された。また産生アルコールは61
ｇ／という高い濃度で得られ、アルコール生産
性（注９）は第２図に示すように14ｇ／・時と
いう高い値に達した。 ｄ 比較例 酵母としてRM―17の代わりにIFO―0224を用
い、その他の事項を上記使用例と同じにして、上
記操作を繰返した。 その結果、培地供給量が70ml／時（希釈率＝
0.1時-1）を超えると、アルコール生産性（注９）
は第２図に示すように４ｇ／・時から急激に低
下した。 ｅ 培地および試薬 培地および試薬はそれぞれつぎのとおりであ
る。 （注１） YPG培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ （注２） YPG寒天培地 酵母エキス 10ｇ／ ポリペプトン 20ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒天 20ｇ／ （注３） 胞子形成培地 酢酸ナトリウム ５ｇ／ 寒天 20ｇ／ （注４） リン酸緩衝液 0.1Mリン酸緩衝液 PH＝7.5 （注５） 溶菌酵素溶液 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にザイモリアーゼ
20T（生化学工業社製）を0.05％溶かした溶液２
mlと、２―メルカプトエタノール1.4μとの混合
液。 （注６） 最小培地 Difco―Yeast Nitrogen Base Ｗ／Ｏ
Amino acid（Difco社製） 6.7ｇ／ グルコース 20ｇ／ 寒天 20ｇ／ （注７） フイリピン産廃糖蜜培地 フイリピン産廃糖蜜 280ｇ／ 硫酸アンモニウム 2.8ｇ／ ピロ亜硫酸カリウム 0.5ｇ／ 消泡剤 0.2ｇ／ とよりなる混合液を硫酸でPH4.5に調整したもの。 （注８） 菌体濃度 発酵槽内の培養液を一定量とり、遠心分離機で
菌体を集め、洗浄後、これを温度800℃で燃焼し、
焼失した重量を菌体量として算出したもの。 （注９） アルコール生産性 培養液１当り１時間に生産されるアルコール
の重量（ｇ）。
第１図は連続発酵のフローシート、第２図は希
釈率とアルコール生産性の関係を示すグラフであ
る。
釈率とアルコール生産性の関係を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ・ DF値４なる凝集性を有し、 ・ 生育にアデニンおよびヒスチジンを要求し、 ・ 球形ないし卵形の形態を成す、 酵母サツカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）RM―17（微工研
菌寄第7770号）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59230897A JPS61108384A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 新規凝集性酵母 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59230897A JPS61108384A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 新規凝集性酵母 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61108384A JPS61108384A (ja) | 1986-05-27 |
| JPH0121757B2 true JPH0121757B2 (ja) | 1989-04-24 |
Family
ID=16915009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59230897A Granted JPS61108384A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 新規凝集性酵母 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61108384A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63156597A (ja) * | 1986-12-19 | 1988-06-29 | Tax Adm Agency | 廃水処理方法 |
| JP5127525B2 (ja) * | 2007-03-30 | 2013-01-23 | 三井造船株式会社 | アルコール連続生産方法 |
-
1984
- 1984-10-31 JP JP59230897A patent/JPS61108384A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61108384A (ja) | 1986-05-27 |
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