JPH0371115B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酢酸菌ベクターとしてきわめて有用な
プラスミドpTA5001(B)に関するものである。

更に詳細には、本発明は、制限酵素Xhoによ
る認識部位をただ１ケ所有し、かつ酢酸菌への移
入が容易なプラスミドpTA5001(B)に関するもの
である。

従来、酢酸菌由来のプラスミドに関しては、ア
セトバクター・アセチNo.1023が分子量17×10⁶ダ
ルトンのプラスミドpTA5001（Agric.Biol.
Chem.46（２）、381〜389、1982）を持つこと及び
グルコノバクター属細菌（醗酵工学雑誌、61
（１）、15−18、1983）の持つプラスミドなどの報
告があつた。

本発明者らは、このプラスミドpTA5001を詳
細に研究したところ、実際は２ケのプラスミドの
混在物であることを知り、更に２ケのプラスミド
の制限酵素開裂地図の作成を完成させ、その用途
を詳細に検討したところ、いずれのプラスミドも
制限酵素Xhoによる認識部位をただ１ケ所有
し、かつ酢酸菌への移入の容易なすぐれたベクタ
ーであることを確認し、本発明を完成するに至つ
た。

本発明は22.5Kbの分子量で、第２図の制限酵
素開裂地図で示されるプラスミドpTA5001(B)に
関する。

本発明のプラスミドpTA5001(B)とプラスミド
pTA5001(A)は同時にアセトバクター・アセチNo.
1023に存在し、該菌よりまず両者の混在物として
分離することができる。

アセトバクター・アセチNo.1023は酢酸醗酵醪か
ら単離・同定されたものであり（Agric.Biol.
Chem.，44（12），2901〜2906，1980）、プラスミ
ドpTA5001(A)及びプラスミドpTA5001(B)を含ん
だまま微工研にFERM Ｐ−7122として寄託され
ている。

アセトバクター・アセチNo.1023は菌学的性質に
おいてバージイ第８版のアセトバクター・アセチ
の菌学的性質の記載とよく一致し、更に酢酸耐性
及びエタノール酸化能を有することで特徴的であ
り、Acetobacter aceti No.1023（Ace^r，Eth⁺⁺）
と表示されることもある。

アセトバクター・アセチNo.1023は、例えば通常
的には下記のYPG培地で培養され、また形質転
換株の検出にはYPG培地に抗生物質等の薬剤を
適当な濃度となるように、例えばアンピシリンを
50μｇ／mlの濃度となるように、添加したものを
用いて培養される。

（YPG培地） イースト エキストラクト 0.5％ ポリペプトン 0.2％ グルコース 3.0％ 寒天（固体培地の場合） 2.0％ PH＝6.5 アセトバクター・アセチNo.1023はYPG液体培
地で、30℃で24〜36時間振とう培養し、培養液を
遠心分離処理して集菌される。菌体は緩衝液で十
分洗浄し、緩衝液に懸濁され、これにリゾチーム
が添加され、溶菌される。溶菌液には界面活性剤
及び食塩が添加され、静置後遠心分離し、上清に
ポリエチンレングリコールが添加され、静置後遠
心分離し沈殿物を得る。この沈澱物を緩衝液に溶
解し、エチジウムブロマイドを加え、更に塩化セ
シウムを加え、密度を1.57に合わせ、密度勾配遠
心分離を行こなう。遠心分離後、遠心チユーブに
紫外線ランプで365nmの紫外線照射により、染色
体バンドの下に出たバンドを分取する。

ここで得られるバンドにはプラスミド
pTA5001(A)とプラスミドpTA5001(B)が混在して
いる。

混在する２つのプラスミドは制限酵素による解
析の結果、はじめて２種類のほぼ同一分子量のプ
ラスミドの混在物であることが明らかとなつたも
のである。

プラスミドpTA5001(B)の分子量は22.5Kbで、
制限酵素開裂地図は第２図に示される。

図面に示される略記号の意味は次の通りであ
る。

Ｅ：EcoR：Escherichia coli RY13 給源の制限酵素 Ｓ：Sal：Streptomyces albus Ｇ 給源の制限酵素 Ｘ：Xho：Xanthomonas holcicola 給源の制限酵素 本発明のプラスミドpTA5001(B)はXhoによ
つてただ１ケ所のみ切断されることによつてきわ
めて特徴的であつて、この切断部位に他のプラス
ミド断片や染色体断片を導入するのがきわめて容
易である。

本発明のプラスミドpTA5001(B)は酢酸菌ベク
ターとして使用するのに好適である。

即ち、プラスミドpTA5001(B)にプラスミド断
片又は染色体断片を導入したものは、酢酸菌（ア
セトバクター属菌、グルコノバクター属菌）に容
易に移入することができ、酢酸菌の形質転換及
び／又は物質生産に新たな画期的手法を提供する
ものである。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１、DNA受容菌体の調製 アセトバクター・アセチNo.1023，FERM Ｐ−
7122より100μｇ／ml濃度のニトロソグアニジン
（NTG）変異処理によつて得られたプロリン要求
性（Pro^-）の親株であるアセトバクター・アセ
チ10−８（Ace^r，Eth⁺⁺，Pro^-）から自然変異に
よつて得た酢酸耐性およびエタノール酸化能が低
下、欠失（Ace^ss，Eth^-）し、かつ、ストレプト
マイシン耐性（Str^r）の菌株であるアセトバクタ
ー・アセチ10−80S1（Ace^ss，Eth^-，Pro^-，Str^r）
を500ml坂口フラスンコに入れた100mlYPG液体
培地に接種し、30℃で20時間振とう培養した。

培養液は０℃で、6000×ｇで、10分間遠心分離
し、集菌する。菌体は100mM NaCl及び5mM
MgCl₂を含有する5mMトリス塩酸緩衝液（PH
7.6）の0.5倍容量で２回洗滌する。再び０℃で
6000×ｇで、５分間遠心分離し、集菌する。

この菌体には0.4倍容量のCaCl₂溶液
（100mMCaCl₂，250mM KCl，5mM MgCl₂，
5mM Tris−HCl，PH7.6）が加えられ、０℃で
30分間静置した後０℃で、6000×ｇで、５分間遠
心分離し、集菌する。

菌体には0.004倍容量の上記CaCl₂溶液を添加し
DNA受容菌体懸濁液とした。

実施例２、プラスミドpTA5001(B)とプラスミド
pTA5001(A)の混在物の単離 アセトバクター・アセチNo.1023，FERM Ｐ−
7122を40mlのYPG培地に植菌し、30℃で一晩振
とう培養した。

その後新らしいYPG培地４に１％で植え継
ぎさらに30℃で36時間振とう培養した。

集菌後、TE緩衝液（20mM EDTA，50mM
トリス塩酸、PH8.0）で２回菌体を洗浄した。

得られた湿菌体2gあたり２mlのTES緩衝液
（50mM トリス塩酸、20mM EDTA、25％シヨ
糖、PH8.0）を加え、菌体を懸濁し、４mlのリゾ
チーム液（0.25M トリス塩酸、リゾチーム２
％、PH8.0）をさらに加え、０℃で５分間静置し
た。次に0.25MEDTA液（PH8.0）を４ml加え、
０℃で５分間静置した後、37℃で20分間反応させ
た。反応後、３mlの10％ラウリル硫酸ナトリウム
を加え、37℃で20分間静置後、５mlの5M食塩水
を加え、０℃で一夜静置した。48200×ｇで60分
間遠心分離をかけ、上清を分取した。次にこの上
清に最終濃度で10％になるようにポリエチレング
リコール6000を加え、４℃で一夜静置した後、
3000×ｇで10分間遠心分離し、沈澱物を得た。こ
の沈澱物を７mlのUC緩衝液（50mM トリス塩
酸、5mM EDTA，50mM NaCl，PH7.8）に溶
解させた後、最終濃度で500μｇ／mlになるよう
にエチジウムブロマイドを加え、さらに塩化セシ
ウムを加えて密度を1.57に合わせた。この溶液を
15℃、100200×ｇで40時間密度勾配遠心分離をお
こなつた。遠心分離後、遠心チユーブに紫外線ラ
ンプで365nmの紫外線を照射することにより、染
色体バンドの下にあらわれるバンドをプラスミド
分画として分取した。次いで、分画液をイソプロ
パノールで処理し、エチジウムブロマイドを除去
した後、TE緩衝液（10mM トリス塩酸、1mM
EDTA，PH7.5）に対して透析した。これをプラ
スミド混在溶液とした。

得られたプラスミド混在溶液中には２つの環状
プラスミドが混在しており、制限酵素による解析
の結果、第１図に示すプラスミドpTA5001(A)と
第２図に示すプラスミドpTA5001(B)であること
が明らかとなつた。

すなわち前記で調製したプラスミド混在溶液に
対し、少なくとも５倍量過剰の制限酵素（EcoR
およびSalは宝酒造社製、Xhoは、ベセス
ダ・リサーチ社製を使用した。）を常法に従がつ
て各々の制限酵素の至適条件下で反応させた。反
応後、垂直型アガロースゲル電気泳動で分析し
た。即ち、１％アガロースゲルを用い、トリス酢
酸緩衝液（40mM トリス、20mM酢酸、2mM
EDTA，PH8.1）中で泳動させた。その後、ゲル
をエチジウムブロマイドの1μｇ／mlに浸して染
色した。このゲルに紫外線を照射し、生成断片の
数を判定し、各断片の泳動距離から、各々の分子
量を算出した。分子量は、同一アガロース上で同
時に泳動したラムダフアージDNAのHind切断
で生成する分子量既知の各断片の泳動距離から作
成した標準線をもとに算出した。

各種制限酵素を単独で用いて得られた各断片及
び各制限酵素の２種以上を組合わせて用いた処理
によつて得られた各断片の断片数及び分子量など
からpTA5001(A)及びpTA5001(B)の第１図及び第
２図に示した制限酵素開裂地図が決定された。

実施例３、プラスミドpTA5001(A)とプラスミド
pTA5001(B)の混在物のベクターと
しての利用 実施例２で得られたプラスミド混在溶液
（DNA量10μｇ）中に、大腸菌薬剤耐性ベクター
であるpACYC177（カナマイシン耐性及びアンピ
シリン耐性；Journal of Bacteriology，134
（３），1141−1156，1978）を持つ大腸菌
（Escherichia coli C600）から得たプラスミド
pACYC177（第３図に示す。DNA量2μｇ）を添
加し少なくとも５倍量過剰の制限酵素Xhoを常
法により至適条件下で反応させ、反応終了後、等
量のフエノールを加え、激しく攪拌して制限酵素
を失活させた後、さらにエーテル抽出を充分行な
つてフエノールを除去し、さらに２倍量のエタノ
ールを加えて−80℃に１時間保持した後、
15000rpmで５分間遠心分離を行なつてDNAを沈
降させ、さらに真空乾燥してエタノールを除去し
た後、次に沈澱を水に溶解後、常法によつてT4
DNA リガーゼによる反応を21℃で２時間行な
い、さらに前記と同様にしてエタノール沈澱、真
空乾燥を行なつて得られた沈澱をTE緩衝液0.1ml
に溶解してキメラプラスミド含有溶液を得た。

それぞれのキメラプラスミドはいずれもプラス
ミドpACYA177を含有している。しかし、プラ
スミドpACYA177のカナマイシン耐性部位に
Xho切断点があつて、そこが切断されているた
めにカナマイシン耐性は発現せず、アンピシリン
耐性のみが発現することになる。

次の実施例１で得られたDNA受容菌体懸濁液
0.2mlを用意し、これに上記それぞれのキメラプ
ラスミド含有溶液を加え、０℃で90分間ゆるやか
に攪拌しつつ、キメラプラスミドの直接導入を行
なつた。

ここに得られたキメラプラスミド導入菌体を含
む液を３mlのYPG培地に移し、30℃、６時間振
とう培養を行なつた後、アンピシリン50μｇ／ml
添加したYPG培地（固体）上で30℃で５日間培
養し、９株のコロニーを得た。これらを10−
80S1−A1〜−A9TOと命名した。このうち、10
−80S1−A1をアンピシリンを30μｇ／ml添加した
YPG液体培地で30℃、24時間振とう培養し、実
施例２の方法に従ってプラスミドを分離して解析
したところ、プラスミドpTA5001(A)とプラスミ
ドpTA5001(B)の混在物以外にこれらよりやや分
子量の大きいプラスミドが得られた。このプラス
ミドは先に導入したキメラプラスミドにうち、
pTA5001(A)とpACYA177がXho切断部位を介
して連結したキメラプラスミドと認められた。ま
た、アセトバクター・アセチ10−80S1はアンピ
シリン耐性を有しないが10−80S1−A1はアンピ
シリン耐性を持つていることなどからもキメラプ
ラスミドが導入され、形質転換が行なわれたこと
が確認された。

同様にして、少なくとも10−80S1−A2〜−A6
はpTA5001(B)とpACYA177が制限酵素Xho切
断部位を介して連結したキメラプラスミドが導入
されていることが確認された。

また、10−80S1−A1〜−A6の持つキメラプラ
スミドを再度10−80S1に前記と同様の方法で導
入したところ10−80S1−A1〜−A6の各キメラプ
ラスミドにおいて、1μｇDNA量当りに換算して
10₅個前後のアンピシリン耐性の形質転換株が得
られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpTA5001(A)の制限酵素開
裂地図を示し、第２図はプラスミドpTA5001(B)
の制限酵素開裂地図を示し、第３図はプラスミド
pACYC177の制限酵素開裂地図を示す。 Ｅ……EcoRによる切断部位、Ｓ……Salに
よる切断部位、Ｘ……Xhoによる切断部位、
Km……カナマイシン耐性遺伝子、Am……アン
ピシリン耐性遺伝子。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 22.5Kbの分子量で、下記の制限酵素地図で
   示されるプラスミドpTA5001(B)。 Ｅ：EcoR：Escherichia coli RY13 給源の制限酵素 Ｓ：Sal：Streptomyces albus Ｇ 給源の制限酵素 Ｘ：Xho：Xanthomonas holcicola 給源の制限酵素。