JPH0322154B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0322154B2 JPH0322154B2 JP3661983A JP3661983A JPH0322154B2 JP H0322154 B2 JPH0322154 B2 JP H0322154B2 JP 3661983 A JP3661983 A JP 3661983A JP 3661983 A JP3661983 A JP 3661983A JP H0322154 B2 JPH0322154 B2 JP H0322154B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- pmv203
- molecular weight
- buffer
- plasmids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
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- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、分子量が小さく、遺伝子操作上きわ
めて有利なプラスミドpMV203に関するものであ
る。
めて有利なプラスミドpMV203に関するものであ
る。
更に詳細には、本発明は、酢酸菌から分離さ
れ、分子量が小さく、制限酸素による切断部位も
少いプラスミドpMV203に関するものである。
れ、分子量が小さく、制限酸素による切断部位も
少いプラスミドpMV203に関するものである。
従来、酢酸菌由来のプラスミドに関する報告は
きわめて少い。例えば、アセトバクター・アセチ
No.1023が分子量17×106ダルトン（17メガダルト
ン）の分子量のプラスミドをもち、これを
pTA5001と命名されたことが報告（Agric Biol
Chem 46(2)２）381−389、1982）され、また、
アセトバクター・アセチNo.1023が分子量17×106
ダルトンの数倍の大きさのプラスミドをもつてい
ることが報告（日本農芸化学会昭和56年度大会講
演要旨集、p6）され、更に、グルコノバクター
属細菌タイプカルチヤー37株についてプラスミド
を検索し、27株にプラスミドの存在を認め、その
分子量は２〜72メガダルトンで菌株により複数
（最大４種）のプラスミドをもつものがあると報
告（醗酵工学第61巻第１号15−18、（1983））され
ている程度に過ぎない。
きわめて少い。例えば、アセトバクター・アセチ
No.1023が分子量17×106ダルトン（17メガダルト
ン）の分子量のプラスミドをもち、これを
pTA5001と命名されたことが報告（Agric Biol
Chem 46(2)２）381−389、1982）され、また、
アセトバクター・アセチNo.1023が分子量17×106
ダルトンの数倍の大きさのプラスミドをもつてい
ることが報告（日本農芸化学会昭和56年度大会講
演要旨集、p6）され、更に、グルコノバクター
属細菌タイプカルチヤー37株についてプラスミド
を検索し、27株にプラスミドの存在を認め、その
分子量は２〜72メガダルトンで菌株により複数
（最大４種）のプラスミドをもつものがあると報
告（醗酵工学第61巻第１号15−18、（1983））され
ている程度に過ぎない。
本発明者らは、酢酸菌にはよりすぐれたプラス
ミドが存在するであろうとの想定のもとに、鋭意
研究を行つた結果、グルコノバクター・サブオキ
シダンスIFO3130からプラスミドpMV203を単離
するに至つた。
ミドが存在するであろうとの想定のもとに、鋭意
研究を行つた結果、グルコノバクター・サブオキ
シダンスIFO3130からプラスミドpMV203を単離
するに至つた。
本発明は、第１図の制限酵素地図で示されるプ
ラスミドpMV203に関するものである。
ラスミドpMV203に関するものである。
本発明のプラスミドpMV203はXho、Acc
／Sal／Hind、及びSmaによる切断部位
を有し、Aat、BamH、Bbe、Bcl、Bgl
、BstE、Cla、EcoR、EcoR、Hind
、Hpa、Kpn、Mlu、Nde、Mlu、
Nde、Pst、Pvu、Sac、及びXbaによ
る切断部位を有しない点で特徴的である。
／Sal／Hind、及びSmaによる切断部位
を有し、Aat、BamH、Bbe、Bcl、Bgl
、BstE、Cla、EcoR、EcoR、Hind
、Hpa、Kpn、Mlu、Nde、Mlu、
Nde、Pst、Pvu、Sac、及びXbaによ
る切断部位を有しない点で特徴的である。
また、プラスミドpMV203の分子量は1.6メガ
ダルトン（Md）である。
ダルトン（Md）である。
本発明のプラスミドpMV203はグルコノバクタ
ー・サブオキシダンスIFO 3130の培養菌体から
単離することができる。
ー・サブオキシダンスIFO 3130の培養菌体から
単離することができる。
グルコノバクター・サブオキシダンスIFO
3130は例えばＡ培地で培養し、多量の菌体を取得
し、菌体を緩衝液で洗浄し、溶菌酵素で溶菌し、
遠心分離により上清をとり、上清にポリエチレン
グリコールを加え、４℃で一夜放置した後、遠心
分離し、沈殿物を得る。
3130は例えばＡ培地で培養し、多量の菌体を取得
し、菌体を緩衝液で洗浄し、溶菌酵素で溶菌し、
遠心分離により上清をとり、上清にポリエチレン
グリコールを加え、４℃で一夜放置した後、遠心
分離し、沈殿物を得る。
得られた沈殿物を緩衝液に溶解し、エチジウム
ブロマイドを加え、更に塩化セシウムを加えて密
度を1.57とし、密度勾配遠心分離を行い、遠心チ
ユーブの紫外線照射による各染色体バンドを分画
し、各分画液を精製し、これからプラスミド
pMV203を単離することができる。
ブロマイドを加え、更に塩化セシウムを加えて密
度を1.57とし、密度勾配遠心分離を行い、遠心チ
ユーブの紫外線照射による各染色体バンドを分画
し、各分画液を精製し、これからプラスミド
pMV203を単離することができる。
本発明のプラスミドpMV203は従来報告された
例はなく、新規プラスミドであり、かつ、本プラ
スミドは分子量が1.6メガダルトンときわめて小
さく、その精製はきわめて容易であり、その上に
少くとも数種の制限酵素による認識部位をそれぞ
れ１ケ所有しているだけでキメラプラスミドを製
作するのに好適であるなど、遺伝子操作上有益な
プラスミドということができる。
例はなく、新規プラスミドであり、かつ、本プラ
スミドは分子量が1.6メガダルトンときわめて小
さく、その精製はきわめて容易であり、その上に
少くとも数種の制限酵素による認識部位をそれぞ
れ１ケ所有しているだけでキメラプラスミドを製
作するのに好適であるなど、遺伝子操作上有益な
プラスミドということができる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 １
（プラスミドの分離精製法）
グルコノバクター・サブオキシダンスIFO
3130を５mlのＡ培地〔２％グリセロール、0.2％
塩化アンモニウム、0.05％リン酸１カリウム、
0.05％リン酸２カリウム、0.02％硫酸マグネシウ
ム、0.2％酵母エキス、0.2％ポリペプトン、PH
6.5〕に植菌し、30℃で24時間振とう培養した。
その後、新しいＡ培地500mlに１％で植え継ぎを
し、30℃で36時間振とう培養した。集菌後、20ｍ
ＭのEDTAを含む50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）で２回菌体を洗浄した。得られた湿菌体２
ｇあたり７mlのTES緩衝液（50ｍＭトリス塩酸、
20ｍＭ EDTA、25％シヨ糖、PH8.0）を加え、
菌体を懸濁し、４mlのリゾチウム液（0.25Mトリ
ス塩酸、リゾチウム20mg／ml、PH8.0）をさらに
加え、０℃で５分静置した。次に0.25MEDTA液
（PH8.0）を４ml加え、０℃で５分静置した後、37
℃で20分間反応させた。反応後、３mlの10％ラウ
リル硫酸ナトリウムを加え、37℃で20分間静置
後、５mlの5M食塩水を加え、０℃で一夜静置し
た。０℃、48200×ｇで60分間遠心分離をかけ、
上清を分取した。次にこの上清に最終濃度で10％
になるようにポリエチレングリコール6000を加
え、４℃で一夜静置した後、3000×10分間遠心分
離し、沈殿物を得た。この沈殿物を７mlのUC緩
衝液（50ｍＭ トリス塩酸、５ｍＭ EDTA、
50ｍＭ NaCl、PH7.8）に溶解させた後、最終濃
度で500μｇ／mlになるようにエチジウムブロマ
イドを加え、さらに塩化セシウムを加えて密度を
1.57に合わせた。この溶液を15℃、100000×ｇで
40時間密度勾配遠心分離をおこなつた。遠心分離
後、遠心チユーブに紫外線ランプで365nｍの紫
外線を照射することにより、染色体バンドの下に
あらわれるバンドをプラスミド分画として分取し
た。次いで分画液をイソプロパノールで処理し、
エチジウムブロマイドを除去した後、TE緩衝液
（10ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ EDTA、PH7.5）
に対して透析した。グルコノバクター・サブオキ
シダンス IFO 3130は、分子量のことなる３つ
のプラスミドをもつており、透析後プラスミド分
画液を垂直型0.8％アガロースゲル電気泳動に供
し、ゲルを1μｇ／mlのエチジウムブロマイドに
浸し染色した後、紫外線照射下で相当するプラス
ミドバンドをゲルごと分取して、他のプラスミド
から単離した。分取したゲルゲルの重量の３倍量
の過塩素酸ナトリウム溶液（6M 過塩素酸ナト
リウム、25ｍＭ リン酸２ナトリウム、25ｍＭ
リン酸１ナトリウム、10ｍＭ EDTA、PH7.0）
を加え、37℃で１時間静置し、アガロースを溶解
させた後、ワツトマン社製GFCフイルターに
DNAを吸着させた。吸着させたDNAをTE緩衝
液で溶出させ、この溶出液100μに200μの99.5
％エタノールを加え、−80℃に２時間おいた後、
15000rpmで５分間遠心分離をおこないDNAを沈
降させ、さらに真空乾燥をおこなつてプラスミド
pMV203を得た。（各種制限酵素による切断特異
性および分子量測定法） 前記で調製したプラスミドをTE緩衝液に溶解
し、少なくとも５倍量過剰の制限酵素を各々の制
限酵素の至適条件下で反応させた。反応後、垂直
型アガロースゲル電気泳動で分析した。即ち、１
％アガロースゲルを用い、トリス酢酸緩衝液（40
ｍＭ トリス、20ｍＭ 酢酸、２ｍＭ EDTA、
PH8.1）中で泳動させた。その後、ゲルをエチジ
ウムブロマイドの1μｇ／ml液に浸して染色した。
このゲルに紫外線を照射し、生成断片の数を判定
し、各断片の泳動距離から、各々の分子量を算出
した。分子量は、同一アガロース上で同時に泳動
したラムダフアージDNAのHind切断で生成す
る分子量既知の各断片の泳動距離から作成した標
準線をもとに算出した。
3130を５mlのＡ培地〔２％グリセロール、0.2％
塩化アンモニウム、0.05％リン酸１カリウム、
0.05％リン酸２カリウム、0.02％硫酸マグネシウ
ム、0.2％酵母エキス、0.2％ポリペプトン、PH
6.5〕に植菌し、30℃で24時間振とう培養した。
その後、新しいＡ培地500mlに１％で植え継ぎを
し、30℃で36時間振とう培養した。集菌後、20ｍ
ＭのEDTAを含む50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）で２回菌体を洗浄した。得られた湿菌体２
ｇあたり７mlのTES緩衝液（50ｍＭトリス塩酸、
20ｍＭ EDTA、25％シヨ糖、PH8.0）を加え、
菌体を懸濁し、４mlのリゾチウム液（0.25Mトリ
ス塩酸、リゾチウム20mg／ml、PH8.0）をさらに
加え、０℃で５分静置した。次に0.25MEDTA液
（PH8.0）を４ml加え、０℃で５分静置した後、37
℃で20分間反応させた。反応後、３mlの10％ラウ
リル硫酸ナトリウムを加え、37℃で20分間静置
後、５mlの5M食塩水を加え、０℃で一夜静置し
た。０℃、48200×ｇで60分間遠心分離をかけ、
上清を分取した。次にこの上清に最終濃度で10％
になるようにポリエチレングリコール6000を加
え、４℃で一夜静置した後、3000×10分間遠心分
離し、沈殿物を得た。この沈殿物を７mlのUC緩
衝液（50ｍＭ トリス塩酸、５ｍＭ EDTA、
50ｍＭ NaCl、PH7.8）に溶解させた後、最終濃
度で500μｇ／mlになるようにエチジウムブロマ
イドを加え、さらに塩化セシウムを加えて密度を
1.57に合わせた。この溶液を15℃、100000×ｇで
40時間密度勾配遠心分離をおこなつた。遠心分離
後、遠心チユーブに紫外線ランプで365nｍの紫
外線を照射することにより、染色体バンドの下に
あらわれるバンドをプラスミド分画として分取し
た。次いで分画液をイソプロパノールで処理し、
エチジウムブロマイドを除去した後、TE緩衝液
（10ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ EDTA、PH7.5）
に対して透析した。グルコノバクター・サブオキ
シダンス IFO 3130は、分子量のことなる３つ
のプラスミドをもつており、透析後プラスミド分
画液を垂直型0.8％アガロースゲル電気泳動に供
し、ゲルを1μｇ／mlのエチジウムブロマイドに
浸し染色した後、紫外線照射下で相当するプラス
ミドバンドをゲルごと分取して、他のプラスミド
から単離した。分取したゲルゲルの重量の３倍量
の過塩素酸ナトリウム溶液（6M 過塩素酸ナト
リウム、25ｍＭ リン酸２ナトリウム、25ｍＭ
リン酸１ナトリウム、10ｍＭ EDTA、PH7.0）
を加え、37℃で１時間静置し、アガロースを溶解
させた後、ワツトマン社製GFCフイルターに
DNAを吸着させた。吸着させたDNAをTE緩衝
液で溶出させ、この溶出液100μに200μの99.5
％エタノールを加え、−80℃に２時間おいた後、
15000rpmで５分間遠心分離をおこないDNAを沈
降させ、さらに真空乾燥をおこなつてプラスミド
pMV203を得た。（各種制限酵素による切断特異
性および分子量測定法） 前記で調製したプラスミドをTE緩衝液に溶解
し、少なくとも５倍量過剰の制限酵素を各々の制
限酵素の至適条件下で反応させた。反応後、垂直
型アガロースゲル電気泳動で分析した。即ち、１
％アガロースゲルを用い、トリス酢酸緩衝液（40
ｍＭ トリス、20ｍＭ 酢酸、２ｍＭ EDTA、
PH8.1）中で泳動させた。その後、ゲルをエチジ
ウムブロマイドの1μｇ／ml液に浸して染色した。
このゲルに紫外線を照射し、生成断片の数を判定
し、各断片の泳動距離から、各々の分子量を算出
した。分子量は、同一アガロース上で同時に泳動
したラムダフアージDNAのHind切断で生成す
る分子量既知の各断片の泳動距離から作成した標
準線をもとに算出した。
第１図はプラスミドpMV203の制限酵素地図を
示す図である。
示す図である。
Claims (1)
- １ 下記の制限酵素地図で示されるプラスミド
pMV203。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58036619A JPS59162883A (ja) | 1983-03-08 | 1983-03-08 | プラスミドｐＭＶ２０３ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58036619A JPS59162883A (ja) | 1983-03-08 | 1983-03-08 | プラスミドｐＭＶ２０３ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59162883A JPS59162883A (ja) | 1984-09-13 |
| JPH0322154B2 true JPH0322154B2 (ja) | 1991-03-26 |
Family
ID=12474814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58036619A Granted JPS59162883A (ja) | 1983-03-08 | 1983-03-08 | プラスミドｐＭＶ２０３ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59162883A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000050869A (ja) * | 1998-08-11 | 2000-02-22 | Ajinomoto Co Inc | グルコノバクター属細菌由来プラスミド及びベクター |
-
1983
- 1983-03-08 JP JP58036619A patent/JPS59162883A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59162883A (ja) | 1984-09-13 |
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